מאמר שיטה

הכנת מורסה מיקובקטריום משובצת חרוז אגר לחיסון עכברים בעלי יכולת חיסונית תוך קנה הנשימה

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67602

⸱

25 באפריל 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health, 2Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, 3Department of Biological Sciences, College of Science, University of Tabuk, 4Emerging Bacterial Pathogens Unit, Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Medical Sciences, Hackensack Meridian School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology, Georgetown University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

עכברים בדרך כלל עמידים לזיהומים על ידי Mycobacterium abscessus, מה שמסבך את הגילוי והפיתוח של אנטיביוטיקה נחוצה מאוד נגד זיהומים ריאתיים. כאן, אנו מתארים שיטה להכנת חיסון וזיהום תוך-קנה שהוכח כגורם לזיהום מתמשך בעכברים בעלי יכולת חיסונית.

תקציר

יש צורך נואש במודלים עכבריים חזקים של זיהום כרוני ב-Mycobacterium abscessus, פתוגן סביבתי שעדיף להדביק את הריאות. טיפולים רב-תרופתיים לאורך השנה מספקים שיעורי ריפוי נמוכים באופן בלתי מתקבל על הדעת בחולים, בסביבות 50%, ומכאן הצורך בכלים פרה-קליניים לחיזוי כדי לפתח אנטיביוטיקה טובה יותר. עם זאת, עכברים בעלי יכולת חיסונית עמידים בדרך כלל לזיהום ריאתי על ידי M. abscessus. ניסיונות רבים לבסס זיהום מתמשך ב-M. abscessus בעכברים בעלי יכולת חיסונית דווחו בספרות. בין אלה, שיטות המסתמכות על חיידקים משובצים בחרוזי אגר שחוסנו לעכברי C57BL/6 דרך המסלול התוך-קנה הוכחו כמבטיחות ביותר. המגבלה העיקרית של גישה זו היא האתגר הטכני הקשור להכנת חרוזי אגר בגודל הניתן לשחזור ומספרי חיידקים, ואחריהם חיסון תוך קנה הנשימה. כאן, אנו מספקים תחילה תיאור מפורט של פרוטוקול אופטימלי המספק חרוזי אגר טעונים ב-M. abscessus בקוטר אופטימלי ועומס חיידקי הניתן לשחזור. לאחר מכן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של חיסון תוך-קנה הנשימה, המותאם למניעת אובדן חרוזים וחיידקים עקב היצמדות למשטחים של מכשירי החיסון וכדי להשיג שקיעה ריאתית ניתנת לשחזור של M. abscessus משובץ אגר. המטרה היא להבטיח קלות יישום ושחזור מעולה ממעבדה למעבדה.

מבוא

אפשרויות הטיפול במחלת ריאות Mycobacterium abscessus (Mab) מוגבלות וכוללות משטר רב תרופתי של שנה עם אנטיביוטיקה דרך הפה, פרנטרל ולעיתים בשאיפה, שרובן חסרות פעילות חיידקית אופטימלית וקשורות לרעילות משמעותית 1,2,3,4,5 . יש צורך דחוף בטיפולים קצרים יותר, בטוחים יותר ויעילים יותר. מודלים עכבריים של זיהומים מיקובקטריאליים היו חיוניים בגילוי ואופטימיזציה של תרופות יעילות ומשטרי תרופות 6,7. עם זאת, ההערכה הפרה-קלינית של אנטיביוטיקה כנגד זיהומי Mab הוכחה כמאתגרת בשל הקושי לבסס זיהומים ריאתיים מתקדמים ומתמשכים בעכברים 8,9.

הדבקה של זני עכברים בעלי יכולת חיסונית ב-Mab מביאה במידה רבה להתיישבות חולפת ואחריה פינוי מהיר של הפתוגן10,11. כדי להשיג זיהום כרוני כפי שנצפה קלינית, נעשה שימוש בתרופות משתקות כגון אגרוז או אגר לקידום התמדה ותגובות אימונופתולוגיות לפתוגנים אופורטוניסטיים כגון Pseudomonas aeruginosa או Haemophilus influenza בעכברים בעלי יכולת חיסונית 12,13,14. מודל זה הותאם לאחרונה להשגת זיהום נשימתי כרוני על ידי Mab ATCC 19977 בעכברי C57BL/6N בעלי יכולת חיסונית 15,16,17,18. השיטה גרמה לזיהום מתמשך עד 45 יום לאחר החיסון התוך-קנה עם ~1 × 104 עד 1 × 106 יחידות יוצרות מושבה (CFU), עם שכיחות של זיהום כרוני בקרב עכברים נגועים של 90%-100%19 והיווצרות גרנולומות מאורגנות סביב חרוז האגר המתפורר18. נראה כי הטמעת Mab בחרוזים מגנה מפני פינוי מהיר על ידי מערכת החיסון המולדת וכי חרוזים עמוסים בחיידקים מהווים מוקדים לגיוס תאי חיסון המובילים להיווצרות גרנולומות ולהקמת זיהום כרוני18. חרוזי אגר/אגרוז מהווים חומר ביולוגי אינרטי יחסית הגורם לתגובות דלקתיות מינימליות. בנוסף, החרוזים מתפרקים לאט, ונמנעים מבעיות של תגובות אלרגיות לגוף זר או פיברוזיס מושרה. זיהום תוך-קנה עם או בלי מכשיר מיקרו-ריסוס מבטיח שקיעה יעילה של החיסון לריאות 8,20,21 ומשחזר חשיפה קלינית וזיהום טוב יותר מאשר חיסון תוך ורידי או תוך-אף.

המודל, אם כן, מציע יתרונות רבים. עם זאת, זה מגיע גם עם כמה אתגרים בעלי אופי טכני, כלומר (i) השגת גודל חרוז הניתן לשחזור, (ii) השגת עומס חיידקי חרוזים הניתן לשחזור, ו-(iii) הבטחת אספקה תוך-קנה עקבית של החיסון. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים להשגת יעדים אלה באופן אמין ולהבטיח שחזור ממעבדה למעבדה.

פרוטוקול

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של ה-NIAID (NIH), בת'סדה, מרילנד. כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. כל המחקרים הכוללים M. abscessus בוצעו במעבדה עם רמת בלימה ביולוגית 2.

1. הכנת חרוז אגר משובץ M. abscessus inoculum

  1. הכן תרבית מוקדמת של M. abscessus ATCC 19977 על ידי חיסון 1.5 מ"ל של צפיפות אופטית (OD600) 1 (באמצעות ספקטרופוטומטר) לתוך 200 מ"ל של מדיום Middlebrook 7H9 בתוספת 0.05% (v/v) טווין 80, 0.5% (v/v) גליצרול, ו-10% (v/v) העשרת אלבומין-דקסטרוז-קטלאז (ADC).
  2. דגרו את התרביות בבקבוק רולר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עד שהגיעו לשלב אמצע העץ (OD600 = 0.4-0.6).
  3. השעו 1.2 גרם מרק סויה טריפטי (TSB) ב-40 מ"ל מים טהורים במיוחד והוסיפו 0.6 גרם דיפקו אגר לריכוז סופי של 1.5%.
  4. מעבירים 60 מ"ל שמן מינרלי כבד לבקבוק ארלנמאייר בנפח 500 מ"ל ומעקרים גם את השמן המינרלי וגם את אגר הסויה הטריפטי (TSA) ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואז מאזנים ב-50 מעלות צלזיוס בתנור.
  5. דגימת 1 מ"ל של התרבית ומדידת OD600.
  6. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב -3700 גרם למשך 15 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש תאים ב-4 מ"ל של 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) כדי להשיג OD600 של כ-30.
  7. מערבבים 3 מ"ל של תרחיף חיידקים עם 27 מ"ל TSA מותך מאוזן מראש ב-50 מעלות צלזיוס בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. מערבבים במהירות על ידי מערבולת או פיפטינג.
  8. יוצקים בזהירות את תערובת החיידקים-אגר (30 מ"ל) לתוך 60 מ"ל שמן מינרלי ומניחים את הבקבוק בכלי משני. מכוונים במהירות את התערובת להסתובב במהירות בינונית (420 סל"ד) על מערבל מגנטי המכוון ל-50 מעלות צלזיוס, באמצעות מוט ערבוב מגנטי. ודא שנוצרת מערבולת גלויה בתערובת השמן-אגר. מערבבים במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  9. מצננים את התערובת על ידי הנחת קרח בכלי המשני וממשיכים לערבב במשך 35 דקות.
  10. הפסיקו את הערבוב ותנו לתמיסת חרוזי האגר לנוח במשך 20 דקות (מלאו את הקרח לפי הצורך).
  11. העבירו את תערובת התרחיץ לשני צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל ושטפו 10 פעמים בנפח אחד של DPBS כדי להסיר שמן וחיידקים חופשיים (3700 גרם, 6 דקות, 4 מעלות צלזיוס, במשך 5 המחזורים הראשונים).
    1. שלב את מתלי חרוזי האגר לצינור אחד בכביסה השלישית. במהלך 5 מחזורי הכביסה הראשונים, השתמש בצינור סרולוגי כדי להשעות בעדינות את החרוזים.
    2. עבור 5 מחזורי הכביסה הבאים, השתמש בפרמטרי הצנטריפוגה הבאים: 2000 גרם למשך 5 דקות, ואחריו 1000 גרם למשך 4, 3, 2 ו -2 דקות, בהתאמה.
  12. השעו מחדש את חרוזי האגר ב-DPBS לנפח סופי של 40 מ"ל, העבירו לבקבוק סטרילי של 125 מ"ל ודללו פי 4 על ידי הוספת 120 מ"ל DPBS.
  13. העבירו את המתלה דרך מסננת תאים של 200 מיקרומטר.
    1. חבר את המסננת לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל. לאחר מכן, הוסף חומר לדוגמה על המסננת וסנן את מתלה החרוזים.
    2. כדי להקל על תהליך הסינון, שלב מסננת תאים, משפך, טבעת מחבר וצינור של 50 מ"ל ליחידה. הרכיבו את החלקים לפי סדר המשפך, מסננת התאים, טבעת המחבר וצינור 50 מ"ל, ומשכו לאט את הבוכנה של מזרק 30 מ"ל המחובר לטבעת המחבר.
  14. במידת הצורך, שטפו את המסננת מהצד הנגדי עם DPBS כדי לשטוף את כל החרוזים הגדולים יותר שנשארו. רכז את התרחיף המדולל על ידי סיבוב ב-1000 גרם למשך 2 דקות או לאפשר לחרוזים להתיישב על ידי כוח הכבידה. לאחר הקטיף, אחסן את חרוזי האגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבוע. הכנה טרייה מומלצת לכל אצווה של ניסויים.
  15. פיפטה 5 מיקרוליטר של מתלה החרוזים על מגלשת זכוכית, כסה אותה בהחלקת כיסוי וצלם תמונות בכמה מיקומים אקראיים באמצעות מיקרוסקופ אור או פלואורסצנטי עם עדשת אובייקטיבית של 10×. שמור את התמונות ומדוד את קוטר החרוז עם ImageJ (טווח הגדלים הרצוי: 200 ± 50 מיקרומטר).

2. טיטרציה של חרוז אגר משובץ M. abscessus inoculum

  1. הוסף 1 מ"ל של תרחיף החרוזים לתוך צינור M והפוך להומוגניזציה אספטית כדי לשחרר חיידקים המוטבעים בחרוזים באמצעות דיסוציאטור המוגדר מראש לתוכנית RNA.02.01 המוגדרת מראש.
  2. קח 100 מיקרוליטר מההומוגנט ודלל באופן סדרתי 1:10 עד 1 × 10-5 דילול. יש לפזר דילולים על אגר 7H10 בתוספת 10% חומצה אולאית-אלבומין-דקסטרוז-קטלאז (OADC) ו-2% גליצרול. יש לספור CFU לאחר 3 עד 5 ימי דגירה.
  3. התאימו את טיטר החיסון לפי הצורך. לדוגמה, אם כל עכבר מקבל 100 מיקרוליטר של תרחיף חרוזים המכיל 1 × 105 CFU עד 10 עכברים, מכינים בסך הכל תרחיף של 2 מ"ל המכיל 1 × 106 CFU/מ"ל בתוספת ~25% כדי להסביר הפסדים במזרקים.

3. בדיקת חלוקת חרוזים דרך המזרק והמחט

הערה: השלבים הבאים נכללו כדי להבטיח שהחרוזים לא יידבקו למשטחי המזרק או המחט. נמצא כי חשוב להשתמש במזרק זכוכית ובמחט הזנה ממתכת 24 גרם כדי למנוע אובדן חרוזים עקב היצמדות למשטחי פלסטיק.

  1. הכן PBST על ידי הוספת 1.25 מ"ל של Tween סטרילי 80 עד 500 מ"ל של PBS סטרילי.
  2. הוסף 900 מיקרוליטר של PBST לחמישה צינורות M לבדיקת חרוזי האגר העוברים דרך מחט ההזנה, כמו גם 900 מיקרוליטר של PBST לצינורות סטריליים של 2 מ"ל כדי להכין -2 עד -6 דילולים של כל דגימת דחיפה.
  3. מערבבים את חרוז האגר המוטבע M. abscessus שהוכן קודם לכן באמצעות פיפטה P1000 כדי להבטיח שכל החרוזים מפוזרים באופן שווה.
  4. חבר מחט הזנה ממתכת 24 גרם למזרק הזכוכית ושאף את מתלה חרוזי האגר, הקפד למנוע היווצרות בועות אוויר.
  5. לאחר שהמזרק מלא ללא בועות אוויר, הניחו קליפסים או פקקים מניילון על הבוכנה של המזרק, ללא רווח בין הקלפסים. המעצורים מאפשרים חלוקה מדויקת של 50-100 מיקרוליטר. אפשר להתאים עד 6 קליפסים לאורך הבוכנה.
  6. הוצא 100 מיקרוליטר של חרוזים ("דחיפה") לתוך צינורות M בסדר שלהם.
  7. לאחר שנאספו 5 דחיפות דרך, הומוגניזציה של החרוזים באמצעות דיסוציאטור הרקמה המותאם להגדרת RNA.02.01, מתאים להכנת RNA מאיברים קפואים ואשר נמצא כמשחרר ביעילות את M. abscessus מהחרוזים מבלי להשפיע על כדאיות התא.
  8. בצע דילול סדרתי עבור ההומוגנטים בטווח של -1 עד -6. צלחו את הדילולים על צלחות אגר 7H11 בתוספת OADC. ספור CFU לאחר 5 ימים.

4. חיסון תוך קנה הנשימה של עכברים

  1. הכן עכברי CD-1 בני 6 עד 8 שבועות.
  2. להרגיע את העכברים באמצעות מערכת חשיפה לתרסיס איזופלורן, בקצב זרימה של 1-5%, כמתואר קודם לכן1.
  3. רסנו את העכברים באמצעות מעמד מוטה מודפס בתלת מימד (תלת מימד) (מעוצב ומיוצר בהתאמה אישית). למוט במרכז המעמד יש חוט תפר המחזיק את העכבר אנכית על ידי החותכות שלו, ומציב את העכבר במצב שכיבה גחוני עם ראשו מורם.
  4. חבר מחט מתכת להאכלת בעלי חיים 24 גרם למזרק זכוכית מלא בחרוז אגר משובץ M. abscessus. הניחו קליפסים או פקקים מניילון על הבוכנה של המזרק כדי להדביק כל עכבר ב-50 מיקרוליטר של חיסון.
  5. לאחר שהעכבר המורדם מרוסן על עקיצת התפר, העבר את הלשון לצד הפה באמצעות מוליך צמר גפן.
  6. דמיין את החלק האחורי של פיו של העכבר כדי לזהות בבירור את החלק הלבן בחלק האחורי של הפה ולמקד את קנה הנשימה של העכבר.
  7. זווית את מחט המתכת אנכית מעל העכבר והכנס אותה בחלק העליון של קנה הנשימה. תיתכן התנגדות קלה בעת מעבר דרך האפיגלוטיס.
  8. החלק את מחט הגוואג' כלפי מטה לתוך קנה הנשימה, הסר את קליפ הניילון או הפקק והוציאו 50 מיקרוליטר של חרוז אגר משובץ M. abscessus.
  9. תן לעכבר לנוח במשך 5 דקות וחזור על שלבים 4.2-4.8 בפעם השנייה. מטרת הליך החיסון הדו-שלבי היא להבטיח שקיעה עמוקה וניתנת לשחזור של החיסון המלא בריאה.
  10. תנו לזיהום להתקדם במשך 24 שעות, ולאחר מכן העכבר מורדם כדי לספור שקיעת חיידקים בריאות.

תוצאות

גודל ועומס חרוזים
כדי לדמיין חרוזי אגר ועומס החיידקים שלהם, החלבון הפלואורסצנטי האדום mCherry התבטא תחת מקדם Hsp60 המכונן בזן מסוג Mab ATCC 19977 והטמיע זן זה בחרוזי אגר כמתואר לעיל. איור 1A מציג את טווח גודל החרוזים (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). איור 1B מציג את הנטל של 6 תכשירי חרוזים עצמאיים, המדגים את יכולת השחזור של ההליך כמתואר.

ציפוי דחיפה של מזרק והשתלת חיידקים לאחר חיסון תוך קנה הנשימה
החיסון התוך-קנה עבר אופטימיזציה בשני שלבים. CFU/mL נמנו בחיסון לפני ואחרי המעבר דרך מזרק הזכוכית כדי להבטיח שלא נגרמו הפסדי חרוזים או חיידקים כאשר החרוזים עברו דרך המזרק והצינור המחובר. טבלה 1 מציגה את טיטר החיידקים הראשוני של שני תכשירי חרוזים עצמאיים (ניסויים 1 ו-2) ואת מספר ה-CFU ששוחזר לכל 100 מ"ל של דגימות 'נדחפות' מעומס מזרק יחיד. כדי למנוע אובדן חרוזים וחיידקים, נדרש מזרק זכוכית המחובר לצינור מתכת. חרוזי אגר נוטים להיצמד למשטחי פלסטיק.

ספירת CFU לאורך זמן בהכנת החרוזים הראתה כי העומס החיידקי של החרוזים נשאר יציב ב-4 מעלות צלזיוס למשך שבוע אחד, עם אובדן של ~פי 2 של עומס חיידקי לשבועיים, ושקיעת ריאות ללא פגע. לאחר מכן, קבוצות של 5 עד 8 עכברים נדבקו בשלושה תכשירי חרוזים עצמאיים כדי לבחון את יכולת השחזור של הליך החיסון התוך-קנה הנשימה. טבלה 2 מציגה את מספר ה-CFU של הריאות לעכבר, שנספר 24 שעות לאחר ההדבקה כמתואר.

לבסוף, יכולת השחזור של ההדבקה הוערכה על ידי הדבקה של שלוש קבוצות של 10 עכברי CD-1, כל אחת מבוצעת על ידי מפעיל אחר. CFUs ריאתיים שנמנו 24 שעות לאחר ההדבקה מוצגים באיור 2.

figure-results-1
איור 1: ניסוי פיילוט להערכת גודל החרוז, הדמיה וכימות של עומס חיידקי M. abscessus . (A) חרוזי אגר המכילים את הזן M. abscessus ATCC 19977, שתוכננו לבטא את החלבון הפלואורסצנטי האדום mCherry תחת מקדם hsp60 המכונן. חמישה מיקרוליטר של תרחיף חרוזים נפרסו על מגלשת זכוכית וצולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמה (אובייקטיבית פי 10). כל נקודה אדומה היא תא חיידקי פלואורסצנטי, הסגור בתוך חרוזי אגר בקוטר הנע בין ~70-250 מיקרומטר. (B) עומס חיידקים, ב-CFU/mL, של 6 תכשירי חרוזים בודדים המראים את יכולת השחזור של השיטה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: שחזור זיהום בין מפעילים. קבוצות של 10 עכברים נקבות CD-1 נדבקו תוך קנה הנשימה על ידי שלושה מפעילים עצמאיים כמתואר, תוך שימוש באותו הכנת חרוזים. מוצגים CFUs ריאתיים שנמנו 24 שעות לאחר ההדבקה. O1, O2, O3: אופרטורים 1, 2 ו-3. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

CFU/100 מיקרוליטר
הכנת חרוזיםגירסת ניסיון 1גירסת ניסיון 2
1.13ה+052.40ה+05
דגימת דחיפה של מזרק
11.14ה+055.10ה+05
21.36ה+054.10ה+05
39.30ה+043.90ה+05
49.80ה+043.60ה+05
51.14ה+05
ממוצע1.11ה+054.18ה+05
ס"ד1.69ה+04 (15%)6.50ה+04 (16%)

טבלה 1: יחידות יוצרות מושבה (CFU) לכל דגימה של 100 מיקרוליטר לאחר מעבר דרך מזרק הזכוכית ומחט הזנת המתכת.

גירסת ניסיון 1גירסת ניסיון 2משפט 3
מזהה עכברCFU ריאות/עכברמזהה עכברCFU ריאות/עכברמזהה עכברCFU ריאות/עכבר
M-16.50ה+03M-62.20ה+05M-116.80ה+04
M-21.10ה+04M-72.70ה+05M-121.70ה+05
M-31.40ה+04M-88.10ה+04M-132.10ה+05
M-43.20ה+03M-91.40ה+05M-144.40ה+04
M-54.50ה+03M-101.30ה+05M-157.50ה+04
M-161.01ה+05
M-177.00ה+04
M-185.80ה+03
ממוצע7.84ה+03ממוצע1.68ה+05ממוצע9.30ה+04
ס"ד4.54ה+03 (58%)ס"ד7.57ה+04 (45%)ס"ד6.67ה+04 (72%)

טבלה 2: השתלת חרוז אגר משובץ M. abscessus בריאות עכבר 24 שעות לאחר החיסון

דיון

כדי להבטיח פיזור אחיד של חיידקים בחרוזי האגר, חשוב להשעות באופן אחיד את תערובת חיידקי האגר המותכים לפני הוספתה לשלב השמן. יחס נפח השמן לאגר-חיידקים הוא קריטי בשליטה על גודל החרוזים. יחס שמן לאגר גבוה יותר מוביל להיווצרות חרוזי אגר קטנים יותר. כאשר מערבבים את תרחיף האגר-חיידקים עם שלב השמן, בקרת הטמפרטורה היא קריטית. תערובת השמן-אגר חייבת להיות חמה מספיק כדי לאפשר תחליב והיווצרות טיפות, אך קרירה מספיק כדי לא לפגוע בחיידקים. ערבוב מתמשך תוך כדי קירור התערובת לטמפרטורת החדר ומטה מאפשר לטיפות אגר להיווצר ולהתמצק.

כיול נכון של צלחת הערבוב, גודל מוט הערבוב וצורת וגודל הבקבוק הם גורמים חשובים למערבולת אחידה. מוט ערבוב הממוקם במרכז הבקבוק יוצר מערבולת סימטרית, המבטיחה ערבוב אחיד. מוט ערבוב מחוץ למרכז יכול להוביל למערבולת לא יציבה, וכתוצאה מכך חרוזים בעלי צורה לא סדירה והכנסת בועות אוויר לחרוזים. מומלץ לבצע ניטור והתאמה בזמן אמת של מיקום מוט הערבוב. נפח הבקבוק צריך להיות פרופורציונלי לנפח תערובת השמן-אגר. בקבוק של 500 מ"ל אידיאלי לסובב תערובת שמן-אגר של 90 מ"ל, ויוצר מערבולת גלויה. בעת שימוש בצלוחיות גדולות יותר, חשוב להתאים את נפח תערובת השמן-אגר, את גודל המערבל ואת מהירות המערבולת כדי להשיג איזון בין ערבוב יעיל למערבולת יציבה. שמירה על מהירות מערבולת עקבית במהלך התהליך ובכל הכנת החרוזים היא קריטית לשחזור אצווה לאצווה.

תהליך הכנת חרוזי האגר, במיוחד מהירות המערבולת ויחס השמן-אגר, מותאמיםמ-16,22, עם שינויים קלים. כוחות גזירה בתוך המערבולת המסתובבת מייצרים מטבעם חרוזים בגדלים שונים. כדי למזער את שונות הגודל הזו, שלב קצירת החרוזים שונה על ידי הכנסת מספר שלבי כביסה, תוך שימוש בשיפוע של ירידה במהירות ובזמן הצנטריפוגה כדי להבטיח הסרת חרוזים בגודל קטן (וחיידקים חופשיים). מסנן מיקרו-רשת שימש להעשרת חרוזים בגודל הרצוי, וסינון יעיל של חרוזים גדולים יותר וכאלה שאולי נוצרו באמצעות התלכדות אקראית. כדי למנוע אובדן חרוזים או חיידקים כאשר תמיסת החרוזים עוברת דרך המזרק והצינור המחובר לחיסון תוך-קנה הנשימה של העכבר, קריטי להשתמש במזרק זכוכית, מחטי הזנה ממתכת 24 גרם וצינור המחובר למתכת.

המגבלה העיקרית של השיטה היא המורכבות הטכנית של הכנת החרוזים והחיסון התוך-קנה להשגת עומס חרוזים הניתן לשחזור והשתלת ריאות. נדרשת תשומת לב לפרטים ויכולת פתרון בעיות. בנוסף, המודל לא אומת במלואו על ידי בדיקת היעילות של אנטיביוטיקה סטנדרטית ושילובי אנטיביוטיקה נפוצים ביותר הניתנים לחולי Mab.

נכון לעכשיו, אף מודל עכברי של זיהום Mab כרוני לא אומת במידה שניתן לחזות באופן סביר את היעילות של חומרים בודדים ושילובי תרופות בחולים על ידי מודל9. מערכת העכברים C57BL/6 המשובצת בחרוזי אגר נוצלה לבדיקת היעילות של טיפולים אנטי-מיקרוביאליים 15,19,23. האלטרנטיבה הקרובה ביותר למערכת העכברים C57BL/6 המשובצת בחרוזי אגר היא מודל העכבר C3HeB/FeJ, המסתמך על דיכוי חיסוני של דקסמתזון כדי להשיג זיהום כרוני מתמשך24,25. היתרונות של הפרוטוקול המתואר כאן הם (i) ניתן להשתמש בעכברי C57BL/6 בעלי יכולת חיסונית מלאה ובמחיר סביר ביותר, (ii) ניתן להשיג זיהום פרודוקטיבי וכרוני עם זן מסוג ATCC 19977 המאופיין היטב, ו-(iii) אין דרישה לדיכוי חיסוני המושרה כימית, העוקף את הצורך בזריקות דקסמתזון יומיות, ובכך נמנע אינטראקציות פוטנציאליות בין תרופות והשפעה על אימונופתולוגיה של הריאות.

בהתחשב בהיעדר מודלים עכבריים מאומתים של זיהום Mab כרוני להערכת מועמדים לתרופות חדשות ומשטרי תרופות 8,9, לטכניקה המתוארת כאן יש פוטנציאל להניע את התחום קדימה, לשפר את ערך החיזוי של נתוני יעילות פרה-קלינית, לעזור לתעדף משטרי תרופות עם הפוטנציאל הגבוה ביותר לספק ריפוי עמיד ולהאיץ באופן כללי את הגילוי והפיתוח של תרופות למחלת ריאות Mab. ניתן ליישם את השיטה על פתוגנים ריאתיים אחרים ויש לה רקורד מבוסס של P. aeruginosa או Haemophilus influenza. המטרה העיקרית של הפרוטוקול המתואר כאן היא לספק מספיק פרטים והמלצות כדי להבטיח קלות יישום ושחזור מעולה ממעבדה למעבדה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים

תודות

עבודה זו מומנה על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס, פרס DICK24XX0, ל-TD ו-VD, ו-R01-AI132374 מ-NIH-NIAID ל-TD ו-VD.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקבוק 125 מ"לקורנינג8388סטרילי
3 x 3 צינור החזקת מתלהפישר5972-0030PKחיטוי לפני השימוש
מעמד עכבר מודפס בתלת מימדTransworld Marketing תוכנן ויוצר בהתאמה אישיתמחוטא לפני השימוש
ב-48 בארות דילול צלחתCelltreat 
229192 צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מ"לגריינר ביו-וואן227261
מכונת הרדמהמערכותEZ-AF9000מערכת n/a
Avanti J-15R בקמן קולטר  B99517מחסום צנטריפוגה
במתלה מכסה הרמה 1000GThermo Scientific ART 21-236-2A
תיק ביולוגיFisherbrand22-044561
טבעת מחבר pluriSelect41-50000-03
אפליקטורים עם קצה כותנהפוריטן 22-029-571
לולאות חיסון חד פעמיות סטריליות צהובות סטריליות 100 בשקית זיפלוקCole-Parmer Essentials 03-391-562
וילון מגבת חד פעמי סטרילי מרופד פוליDynarex19-310-671
תמיסת מלח פוספט סטרילית של Dulbeccoתומאס סיינטיפיק21-031-CM
משפךpluriSelect42-50000סטרילי
GE Ultrospec 10ספקטרופוטומטרGE80211630 סיגמא-אולדריץ
ג'נטלמק מפרק רקמותMiltenyi Biotec130-096-427מזרק המילטון לא מופעל בחום
 המילטון 80801חיטוי לפני השימוש
שמן מינרלי כבדSigma-Aldrich330760-1L
תמיסת איזופלורן סטרילית 250 מ"ל בקבוקCovetrus29405קורוזיה/גירוי בעור: קטגוריה 2, נזק חמור לעיניים/גירוי בעיניים: קטגוריה 2A, רעילות מערכתית של איבר מטרה ספציפי (חשיפה יחידה): קטגוריה 3
עלול לגרום לנמנום וסחרחורת, גורם לגירוי חמור בעיניים, גורם לגירוי בעור. אין לשאוף, השתמש באזור מאוורר היטב.
M Tubes (gentleMACS)Miltenyi Biotec130-096-335
בוחש מגנטי סטרילי MR Hei-Connect Heidolph505-40000-13-1
מוט ערבוב מגנטיThomas Scientific  1181L08
פיפט מכני סטרילי 100– 1000 ומיקרו; L גילסון פיפטמן L FA10006Mחיטוי לפני השימוש
ב-Mechanical Pipet 20– 200 ומיקרו; L גילסון פיפטמן L FA10003MGחיטוי לפני השימוש
מחט מתכת להאכלת בעלי חיים 24 גרםBraintree ScientificN-VP 24G-1Sחייב להיות מעוקר (חיטוי)
Middlebrook 7H10 AgarSigma-AldrichM0303-500Gמעוקר (אוטוקלב)
Middlebrook 7H11 AgarThermo FisherR4554002מעוקר (אוטוקלאב)
Middlebrook 7H9 בינוניבקטון דיקינסון271310מעוקרים (אוטומטיים)
TriMech Solutions SRV-AMS-FDMחיטוי לפני השימוש
תפר משי לא נספגFisher Scientific18020-50n/a
OADC העשרה נוזלית לשימוש עם Middlebrook Media 500 מ"לThermo Scientific Remel R450605סטרילי
(10x), pH 7.4 סטרילי מסונן 500 מ"לGibco70-011-044
מגבוני Peroxiguard סטרילייםPeroxigard29221n/a
צלחות פטרי עם מכסה שקוף עגול 100 מ"מ x 15 מ"מFisherbrand FB0875712
פלורי סטרילי מסננת 200 מ"מpluriSelect43-50200-03סטרילי; מסננת תאים
בקבוקי רולרקורנינג430165
פיפטה סרולוגיתקורנינג4489
ספקטרופוטומטר סטרילי קובטות 1.5 מ"לפישר סיינטיפיק14955127מעוקר (אוטוקלב)
פקקי מזרק או קליפסים (ניילון)Trimech SRV-AMS-MJFחיטוי לפני השימוש
מרק סויה טריפטיSigma-AldrichT8907-500G
טווין סטרילי 80 פישר170793פילטר מעוקר 
קצות פיפטה מסוננים רחבים מתלה מכסה הרמה 200G תרמו סיינטיפיק ART21-236-1Aסטרילי
סטרילית קצות פיפטה סטרילי סטרילי ' חלקי מעמד עכבר PBS סטרילית

מקורות

  1. Dartois, V., Dick, T. Drug development challenges in nontuberculous mycobacterial lung disease: Tb to the rescue. J Exp Med. 219 (6), e20220445(2022).
  2. Martiniano, S. L., Nick, J. A., Daley, C. L. Nontuberculous mycobacterial infections in cystic fibrosis. Clin Chest Med. 43 (4), 697-716 (2022).
  3. Maurer, F. P., et al. Lack of antimicrobial bactericidal activity in mycobacterium abscessus. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3828-3836 (2014).
  4. Wu, M. L., Aziz, D. B., Dartois, V., Dick, T. Ntm drug discovery: Status, gaps and the way forward. Drug Discov Today. 23 (8), 1502-1519 (2018).
  5. Egorova, A., Jackson, M., Gavrilyuk, V., Makarov, V. Pipeline of anti-mycobacterium abscessus small molecules: Repurposable drugs and promising novel chemical entities. Med Res Rev. 41 (4), 2350-2387 (2021).
  6. Nuermberger, E. Using animal models to develop new treatments for tuberculosis. Semin Respir Crit Care Med. 29 (5), 542-551 (2008).
  7. Nuermberger, E. L. Preclinical efficacy testing of new drug candidates. Microbiol Spectr. 5 (3), (2017).
  8. Nicola, F., Cirillo, D. M., Lore, N. I. Preclinical murine models to study lung infection with mycobacterium abscessus complex. Tuberculosis (Edinb). 138, 102301(2023).
  9. Dartois, V., et al. Preclinical murine models for the testing of antimicrobials against mycobacterium abscessus pulmonary infections: Current practices and recommendations. Tuberculosis (Edinb). 147, 102503(2024).
  10. Obregon-Henao, A., et al. Susceptibility of mycobacterium abscessus to antimycobacterial drugs in preclinical models. Antimicrob Agents Chemother. 59 (11), 6904-6912 (2015).
  11. Lerat, I., et al. In vivo evaluation of antibiotic activity against mycobacterium abscessus. J Infect Dis. 209 (6), 905-912 (2014).
  12. Saliu, F., et al. Chronic infection by nontypeable haemophilus influenzae fuels airway inflammation. ERJ Open Res. 7 (1), (2021).
  13. Rodgers, A. M., et al. Biologically relevant murine models of chronic pseudomonas aeruginosa respiratory infection. Pathogens. 12 (8), 1053(2023).
  14. Hoover, J. L., et al. A robust pneumonia model in immunocompetent rodents to evaluate antibacterial efficacy against s. Pneumoniae, h. Influenzae, k. Pneumoniae, p. Aeruginosa or a. Baumannii. J Vis Exp. (119), e55068(2017).
  15. Lore, N. I., et al. The aminoglycoside-modifying enzyme eis2 represents a new potential in vivo target for reducing antimicrobial drug resistance in mycobacterium abscessus complex. Eur Respir J. 60 (6), 2201541(2022).
  16. Riva, C., et al. A new model of chronic mycobacterium abscessus lung infection in immunocompetent mice. Int J Mol Sci. 21 (18), 6590(2020).
  17. Chang, V., Phillips, P. P. J., Imperial, M. Z., Nahid, P., Savic, R. M. A comparison of clinical development pathways to advance tuberculosis regimen development. BMC Infect Dis. 22 (1), 920(2022).
  18. Yang, S. J., et al. Pathological granuloma fibrosis induced by agar-embedded mycobacterium abscessus in c57bl/6jnarl mice. Front Immunol. 14, 1277745(2023).
  19. Poerio, N., et al. Combined host- and pathogen-directed therapy for the control of mycobacterium abscessus infection. Microbiol Spectr. 10 (1), e0254621(2022).
  20. Pearce, C., et al. Inhaled tigecycline is effective against mycobacterium abscessus in vitro and in vivo. J Antimicrob Chemother. 75 (7), 1889-1894 (2020).
  21. De Groote, M. A., et al. Gm-csf knockout mice for preclinical testing of agents with antimicrobial activity against mycobacterium abscessus. J Antimicrob Chemother. 69 (4), 1057-1064 (2014).
  22. Facchini, M., De Fino, I., Riva, C., Bragonzi, A. Long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice. J Vis Exp. (85), e51019(2014).
  23. Degiacomi, G., et al. The novel drug candidate vomg kills mycobacterium abscessus and other pathogens by inhibiting cell division. Int J Antimicrob Agents. 64 (4), 107278(2024).
  24. Rimal, B., et al. T405, a new penem, exhibits in vivo efficacy against m. Abscessus and synergy with beta-lactams imipenem and cefditoren. Antimicrob Agents Chemother. 66 (6), e0053622(2022).
  25. Maggioncalda, E. C., Story-Roller, E., Ammerman, N. C., Nuermberger, E. L., Lamichhane, G. Progressive mycobacterium abscessus lung infection in c3heb/fej mice associated with corticosteroid administration. bioRxiv. , (2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים