הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הפרשת אינסולין מגורה על ידי גלוקוז באמצעות זלוף דרך כלי הדם של העכברים עם לבלב שלם

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67701

⸱

25 ביולי 2025

 ,  , 
1Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מספקים פרטים על ביצוע הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז (GSIS) באמצעות זלוף דרך כלי הדם של העכברים עם לבלב שלם כטכניקה נוספת להערכת תפקוד הלבלב האנדוקריני עם הפחתת מבלבלים אפשריים.

תקציר

השיטות הנוכחיות להפרשת אינסולין מגורה גלוקוז (GSIS) במכרסמים כוללות פריפוזיה ex vivo או דגירה סטטית של איי הלבלב ופרוסות הלבלב. זלוף ex vivo ודגירה סטטית מאפשרים לקחת דגימות מרובות במהירות וביעילות. עם זאת, הליכים אלה חושפים את האיים לטראומה, היפוקסיה לסירוגין ואיתות אינסולין פרקריני מופחת, כל אלה יכולים להשפיע על GSIS. ניתן למזער את ההשפעות השליליות הללו באמצעות זלוף דרך כלי הדם של העכברים עם לבלב שלם, המספק שיטת השוואה נוספת לדגמי ה-GSIS השונים. עמוד השדרה של הליך זלוף זה כלל 1) קשירת כלי דם לבידוד הלבלב ו-2) קנולציה של כלי הדם בלבלב. מודל זה כלל שבע נקודות קשירה ושתי קנולציות. כלי הדם שנוצרו כללו את אבי העורקים התחתון של הבטן, הצליאק והעורק המזנטרי העליון, היובלים המסתעפים ווריד הפורטל.

הפרפוזה הוכנסה לכלי הדם במהירות של ~2 מ"ל/דקה באמצעות משאבה פריסטלטית לצינורות PE-50 המקננים את אבי העורקים בבטן התחתונה. הפרפוזטים עברו דרך כלי הדם המבודדים ונאספו דרך וריד הפורטל באמצעות קנולציה עם צינורות PE-30. פרפוזה נאסף במרווחים של 3 דקות בסבבים של 30 דקות עבור כל תמיסת פרפוזה של 2.6 מ"מ גלוקוז, 16.8 מ"מ גלוקוז ו-2.6 מ"מ גלוקוז עם 3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX) במאגר ביקרבונט קרבס-רינגר (KRB, 16 מ"מ HEPES ו-0.1% BSA, pH 7.4). לתמיסת IBMX קדם תמיסת גלוקוז רגילה של 2.6 מ"מ כמחזור כביסה. הזמן הכולל היה ~ שעה להליך הכירורגי ושעתיים לאיסוף פרפוזה. פרפוזטים הוקפאו עד שבוצעה ELISA למדידת הפרשת אינסולין.

רשימת שיטות זו מקווה לספק בסיס פרוצדורלי מפורט למדידת הפרשת אינסולין באמצעות זלוף לבלב דרך כלי הדם, מה שיאפשר לחוקרים לבצע זלוף לבלב שלם בהצלחה במעבדותיהם.

מבוא

כימות והבנה של תפקוד תאי בטא הושגו בעיקר באמצעות פריפוזיה ex vivo, דגירה סטטית, ולאחרונה, באמצעות פרוסות לבלב. בעוד שהנהלים הללו מאפשרים הערכה של איים מבודדים, שני הראשונים עשויים להכניס את האיים לגורמי לחץ המשפיעים על יכולתם לתפקד. במחקר של רוזנברג ואחרים, איי כלבים שבודדו בשיטות סטנדרטיות הראו אפופטוזיס מוגבר של תאי בטא, אשר הוכח על ידי אובדן קרום הבסיס, הופעת גרעינים פיקנוטיים וגופים אפופטוטיים1. מחקר זה עולה בקנה אחד עם דיווח נוסף על בידוד איי לבלב אנושיים שבהם הודגמו שינויים מורפולוגיים המתארים אפופטוזיס זמן קצר לאחר בידוד האיים 2,3. אפופטוזיס מוגבר של תאי בטא הוביל לשחרור מופחת של אינסולין מהאיים הללו, מה שתמך בתפיסה שבידוד איים נוטה לנזק ולפגיעה תפקודית.

בנוסף לאפופטוזיס, כלי הדם הולכים לאיבוד עם בידוד האיים, מה שמוביל לפגיעה בהובלה של חומרים מזינים, מטבוליטים והורמונים 4,5. מגבלה זו הובילה לחלופות כמו השתלת תאי האי לתוך העין כדי לשמור על צורה כלשהי של כלי דם ועצבוב6. השינוי בארכיטקטורת כלי הדם במהלך בידוד האי יוצר גם אי קומפקטי יותר, שונה ממה שצפוי ב-vivo 7,8.

כדי להוסיף להבדלים האנטומיים, ההתנהגות של איים מודגרים סטטית שונה מהלבלב המבודד. עבור איים מודגרים סטטית עם גלוקוז נמוך, 77% מכלל האינסולין ששוחרר (3.31 ננוגרם מתוך 4.34 ננוגרם בסך הכל) נראה נוכח במהלך 30 הדקות הראשונות ומעט בפרק הזמן שלאחר מכן. זאת בניגוד מוחלט ללבלב המבודד בריכוזי גלוקוז נמוכים, שם היה כמעט אפס שחרור אינסולין בכל נקודות הזמן (<1.8 ננוגרם בסך הכל)9. בעוד שיש לבצע מחקר נוסף כדי להבהיר את ההבדל הזה במלואו בריכוזי גלוקוז נמוכים, הבדל זה בנתונים עשוי לייצג דליפה מתאים גוססים היפוקסיים, שנבדקה עוד באמצעות דגירה סטטית של חד-שכבות של תאי איים. עם זאת, הבדלים אלה בין השיטות הנוכחיות לסביבות in vivo עלולים לגרום לפגיעה בתוקף החיצוני (טבלה 1).

בנוסף להיפוקסיה, גם פריפוזיה ex vivo וגם דגירה סטטית כרוכים בתרבית והפרדה של האיים מהלבלב לצלחות תרבית רקמה כדי לשמור אותם במצב תלוי. במהלך תהליך זה, קולגנאז מוזרם בדרך כלל דרך צינור הלבלב כדי לאפשר דיסוציאציה של רקמת הלבלב. קולגנאז נקשר לסיבי קולגן ומפרק אותם בעזרת פרוטאזות ניטרליות, ג'לטינאזות ופרוטאזות לבלב אנדוגניות. יחד, פרוטאזות אלה ממשיכות להתעכל עד שהאיים משתחררים מהמטריצה החוץ-תאית ומחיבורי התאים האצינריים שלהם. איזון תערובת זו של פרוטאזות מניב תוצאות משתנות הן בטוהר והן בפונקציונליות של האיים המבודדים10. היעילות של קולגנאז תלויה גם במאפיינים של בעלי חיים כמו זן, גיל, משקל ומצב סוכרת. השימוש בפרוטאזות אלו בשילוב עם תכונות ספציפיות לבעלי חיים עלול לפגוע באיי הלבלב במהלך תהליך הבידוד. כאשר נותנים קולגנאז, פרוטאזות אלו מפעילות גם אנזימים פרוטאוליטיים אנדוגניים בלבלב המסייעים לעיכול קרום הבסיס. עם זאת, שליטה בהפעלת אנזימי לבלב אנדוגניים עדיין אינה אפשרית; לפיכך, זה עשוי לשחק תפקיד בפגיעה באיים במהלך תהליך הטיפוח 11,12,13. דיווח אחד מאדמונטון הראה פעילות פרוטאז אנדוגנית המשפיעה על תפוקת בידוד האיים ברגע שהגיעה לרמת פעילות אנזימים מספקת לבידוד14,15.

הוכח כי טכניקות עירוי נוכחיות של קולגנאז (תוך-צינורית) חודרות גם לפנים האי, מה שמוביל לפיצול אפשרי של האיים, ולכן, תפוקות איים נמוכות16. במחקר של Balamurugan et al., נראה כי קולגנאז מתמקם באיים וברקמת אצינאר בתוך לבלב עכבר מוזרק, מה שהוביל לדלקת עזה ולהפעלת מסלולים אפופטוטיים17. איים שכן שרדו את שלב הבידוד הראו יכולת מופחתת לשחרר אינסולין גם כן.

בנוסף, גורמים אחרים כמו לחץ מכני במהלך הכנת האי ונמק הנגרם על ידי היפוקסיה במהלך התרבית ממלאים תפקיד בתפקוד האי18. תכונות אלו יכולות להשפיע על כדאיות האי בעת בידוד הלבלב ולכן על התפקוד המתקבל.

מלבד בידוד והערכה של איים באמצעות פריפוזיה ex vivo ודגירה סטטית, איים בפרוסות לבלב חיות הם שיטה נוספת ex vivo המשמשת למדידת תגובות תאים אנדוקריניים19. במערכת זו נמנע הלחץ הכימי מהליכי בידוד האיים. בנוסף, המיקרו-סביבה של האי נשארת שלמה, מה שמאפשר לחקור את הפיזיולוגיה של האי קרוב יותר למצב in vivo 20 שלו. בדומה לפריפוזיה ex vivo ודגירה סטטית, זוהי שיטה שתמשיך למלא תפקיד חשוב ברכישת ידע על הלבלב. עם זאת, חלק מהמגבלות כוללות לחץ מכני במהלך יצירת פרוסות, כמו גם היעדר ראייה הוליסטית כוללת של לבלב שלם לפתולוגיה ופיזיולוגיה. הפרוסה מייצגת אזור מסוים בתוך הלבלב, מה שמפחית את יכולת ההכללה שלו עקב גודל המדגם הקטן והראייה המוגבלת21.

בידוד האי הזה ושיטות אחרות מלווים בנקודות שונות של גורמי לחץ שעלולים להיות מוטלים על האיים. מתח מכני, היפוקסיה, פעילות יתר של פרוטאז וראייה מוגבלת ממלאים תפקיד בתפוקת האי הנוצרת ובתוקף החיצוני הכללי. ניתן להפחית גורמים אלה באמצעות זלוף של הלבלב דרך כלי הדם של העכברים, מה שממזער את כל גורמי הלחץ הנ"ל תוך שהוא מאפשר גם לבחון את ההשפעות של הפרשות אחרות וחומרים פרמקולוגיים הקיימים בגוף עקב שמירה על שלמות התאים22. מחקרים קודמים הראו את ההשפעה של זרימת הדם באיים על רמות האינסולין בפלזמה23; בתורם, מולקולות כלי דם כמו פפטידים אנגיוטנסין ואגוניסטים סימפתטיים, המשנים את זרימת הדם באיים, ישנו את תפקוד האי ואת שחרור האינסולין24,25. זלוף הלבלב יאפשר הערכה נוספת של האופן שבו מולקולות אלה ואחרות עשויות להשפיע על תגובת התאים האנדוקריניים. מערכת זו מקווה לאפשר התקדמות מושגית נוספת של הבנתנו את הביולוגיה של הלבלב האנדוקריני בנוכחות דיבור צולב במיקרו-סביבה הטבעית שלו עם כלי דם ועצבוב שלמים. בנוסף, זלוף של הלבלב השלם בפרוטוקול זה מאפשר בידוד של האיבר, ומפחית מבלבלים פוטנציאליים מאיברים אחרים כמו הכבד, אשר מנקה אינסולין ממחזור הדם, בהשוואה לזלוף של העכבר כולו. זלוף של העכבר כולו יאפשר טכניקה כירורגית מופחתת; עם זאת, זה עדיין ידרוש איסוף של הפרפוזה דרך כלי דם לאחר הלבלב ולפני הגעתו לכבד - ככל הנראה וריד הפורטל. איסוף ורידים פורטליים ימשיך לדרוש קנולציה. בעוד שזלוף עכבר שלם יספק את היתרון של צעדי ניתוח מופחתים, יהיו מגבלות עקב הבלבול שנוצר על ידי איברים כמו הכליות והריאות המייצרים פפטידים של אנגיוטנסין. עם זאת, זו תהיה גישה חדשה שיכולה להיות שימושית כאשר בוחנים את ההשפעות של מולקולות כלי דם המיוצרות מאיברים אחרים על איי הלבלב, שהיא העדיפות העיקרית.

זלוף לבלב שלם בוצע בהצלחה בעבר על ידי אחרים 7,22,26. בפרוטוקול מעודכן זה, השימוש בעכברים מהווה אתגר טכני מוגבר בשל האנטומיה הקטנה יותר שלהם בהשוואה לחולדות. עם זאת, הליך זה מדגים בהצלחה את ההיתכנות של פרוטוקול זה על ידי הדגמת פרופיל הפרשת אינסולין מאופיין היטב מהלבלב השלם של 3 עכברים עצמאיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים המבוצעים על מכרסמים עומדים בהנחיות המרכז לחקר הסוכרת של ג'וסלין (מספר אישור 22-01).

1. התחלה

  1. לתת הרדמה.
    1. הזרקת עכברים נורמוגליקמיים בצום (Flox/Cre 53-74 שבועות M/F ששימשו בניסויים) עם תערובת קטמין/קסילזין (~75 מ"ג/ק"ג של תערובת קטמין HCl) הניתנת תוך שרירית דרך אחת הירכיים האחוריות באמצעות מחט 28 גרם להמתת חסד.
      הערה: שימוש בעכברים נורמוגליקמיים בצום חשוב להפחתת ההשפעות של קטמין; עם זאת, ניתן להחליף חומר הרדמה.
    2. ודא שהעכבר מורדם כראוי על ידי צביטה של כף הרגל האחורית במלקחיים כדי לבדוק אם יש רפלקס.
      הערה: חוסר רפלקס מסומן על ידי חוסר תנועה של הרגל הצבוטה.
    3. יש לתת משחה עיניים סטרילית לעיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה ולמנוע כיבים בקרנית.
  2. אבטח את הנושא.
    1. ודא שהעכבר מאובטח ויישאר במקומו במהלך ההליך, אותו משלים ניסוי זה באמצעות מגנטים המחוברים לגומיות המתחברות לגפיים עם המגנטים המחוברים ללוח מגנטי.
  3. נקה את מקום החתך.
    1. ודא שהעכבר מרוסס ב-70% אתנול כדי למנוע זיהום משיער העכבר,
      הערה: גילוח העכבר יאפשר פחות סיכוי לזיהום מהפרווה.
  4. בצע חתך.
    1. בעזרת מלקחיים/פינצטה צובטים 2-3 ס"מ מפי הטבעת וחותכים כלפי מעלה תוך ניקוב הצפק במספריים מעוקלים.
    2. צור חתך אלכסוני מקו האמצע לצלעות ולחלק הצדדי של העכבר.
    3. צור חתך זהה בצד הנגדי.
      הערה: המטרה היא ליצור ראייה נאותה של חלל הבטן מסמוך לרקטום ועד לסרעפת

2. קשירה

  1. לקשור את עורק הקיבה.
    1. הזיזו את המעיים ימינה של החיה בעזרת מלקחיים/אצבעות קהות. הרם את הקיבה כדי לאתר את עורק הקיבה והווריד.
      הערה: עורק קיבה ווריד מזוהים באמצעות הדמיה של כלי דם העוברים מהוושט התחתון לקיבה העליונה.
    2. קח תפר 7-0 (ללא מחט) והנח אותו מתחת לעורק הקיבה באמצעות מלקחיים קהים כהכנה לקשירה.
    3. צור קשר מנתח והקפד על קשירה נאותה באמצעות קשר יציב.
      הערה: סוג הקשר אינו חשוב; מניעת זרימת הדם יכולה להיקבע על ידי שינוי צבע האיבר הקשור למראה חיוור יותר או הסרת האיבר ומעקב אחר הוצאת דם מנקודת הקשירה. קשירת עורק הקיבה מבטיחה שאין השפעה מתכולת הקיבה. זה גם מפחית את הדליפה לכלי הקיבה ומכוון את הפרפוזה לעורק הצליאק.
  2. קשירת כלי כליה שמאליים.
    1. חזור על שלבים 2.1.1-2.1.3 עבור כלי הכליה השמאליים.
      1. זהה את כלי הכליה השמאליים על ידי הדמיית כלי דם בצבע אדום בוהק וסגול כהה המתחברים לכליה השמאלית. שלב זה מונע דליפה לכלי הכליה ומפנה פרפוזה לעורק הצליאק.
  3. קשר את אבי העורקים הבטני העליון.
    1. חזור על שלבים 2.1.1-2.1.3.
      1. זהה את אבי העורקים הבטני העליון על ידי הדמיית הכלי האדום הבוהק בקו האמצע עם כלי דם מסועפים של עורק הצליאק, העורק המזנטרי העליון וכלי הכליה השמאליים. בצע קשירה מעל עורק הצליאק כדי להפחית דליפה דרך אבי העורקים בבטן העליונה ולהבטיח זרימה לעורק הצליאק ובסופו של דבר, ללבלב.
  4. לקשור כלי כליה ימניים.
    1. הזיזו את המעיים לשמאל החיה. צבטו את הרקמה/שומן המקיף את הכליה הימנית כמנוף לזיהוי כלי הכליה הימניים.
    2. חזור על שלבים 2.1.1-2.1.3.
      1. זהה כלי כליה ימניים על ידי הדמיה של כלי דם סגולים/אדומים כהים (שני ורידים ימניים עם עורק שמתחתיו שאינו נראה) המחוברים לכליה הימנית עם חיבור הן לווריד הנבוב התחתון והן לאבי העורקים הבטני. שלב זה מקביל לשלב 2.2 עם כלי הכליה השמאליים, ומאפשר בידוד נוסף של הלבלב; עם זאת, היזהר מהקרבה של כלי זה לווריד הנבוב התחתון.
  5. קשר את החלק הבטני של הווריד הנבוב התחתון.
    1. זהה את החלק הבטני של הווריד הנבוב התחתון באמצעות הדמיה של כלי סגול גדול יותר עם חיבור מסועף לווריד הכליה הימני.
    2. חזור על שלבים 2.1.1-2.1.3.
      הערה: שלב זה מפחית גורמים מבלבלים פוטנציאליים מהדם העובר לווריד הפורטלי, שם ייאסף הפרפוזה.
  6. קשרו את אבי העורקים בבטן התחתונה, לפני ההסתעפות (איור 1)
    1. חזור על שלבים 2.1.1-2.1.3.
    2. לאחר קשירה ממש לפני ההתפצלות, הניחו חוט תפר מתחת לאבי העורקים 0.5 ס"מ בערך מעל הקשר הראשון. השתמש בחוט תפר זה כדי לקשור את הצינור למקומו.
    3. השתמש ברווח בין חוט התפר לתפר הקשור כדי להכניס את הצינור לקנולציה. קשירה זו מבטיחה שפרפוזה עוברת דרך אבי העורקים של הבטן התחתונה לכיוון עורק הצליאק.
  7. קשר את וריד הפורטל (איור 2)
    1. הזיזו את המעיים משמאל לבעל החיים כדי לאפשר הדמיה נכונה של וריד הפורטל.
    2. צור חתך בסרעפת ובצלעות כדי ליצור יותר מקום, לפי הצורך, לצפייה בווריד הפורטלי ולמתיחה מתאימה לקשירה וקנולציה.
    3. קשרו את הכלי בצורה מעולה ככל האפשר (קרוב יותר לכבד) כדי להבטיח מקום לקנולציה מאוחר יותר.
    4. הניחו תפר שני נחות מהראשון אך מעל הלבלב. שלב 2.7.2 יגרום לנבדק למות. בנוסף, שלב זה חשוב כדי לאפשר איסוף פרפוזה ולמנוע זרימה חוזרת פוטנציאלית עדיפה על נקודת הקנולציה.

3. קנולציה

  1. קנולציה של אבי העורקים בבטן התחתונה.
    1. צור חתך של 0.5-1.5 מ"מ עם מספריים לתוך אבי העורקים של הבטן התחתונה בין הקשר התחתון לתפר העליון.
    2. השתמש בקשר הנמוך ביותר כמנוף, הכנס את הצינור לתוך אבי העורקים דרך החריץ עד שהוא מגיע לתפר המעולה יותר; היזהר לא לקרוע.
    3. קשרו את התפר המעולה יותר לקשר כדי לנעול את הצינור במקומו.
      הערה: שלב זה מאפשר לפרפוסט להיכנס למערכת המצורפת. עם הקשרים במקום, הפרפוזה צריכה לעבור מנקודת הכניסה באבי העורקים של הבטן התחתונה דרך עורק הצליאק, ואז לכלי הלבלב, ולהסתיים בווריד פורטל הכבד שבו ניתן לאסוף את הפרפוזה.
  2. קנול את וריד השער.
    1. צור חתך של 0.5-1 מ"מ לווריד הפורטל מיד לאחר שווריד הפורטל עוזב את הלבלב.
    2. החזק את הקשר העליון כמנוף עם מלקחיים קהים ביד אחת, הכנס את הצינור לווריד הפורטל באמצעות מלקחיים כדי לאחוז בצינור ביד השנייה.
    3. השתמש בתפר השני כדי לקשור את הצינור למקומו, במידת האפשר.
      הערה: שלב זה הוא נקודת הסיום של המערכת הסגורה שאליה הפרפוזה צריכה לצאת עם השפעת הלבלב על הנוזל הקיים.

4. איסוף

  1. בצע זלוף.
    1. לפני הנחת צינור אבי העורקים בבטן התחתונה, ודא שמערכת הזלוף החלה עם זרימת הפרפוזה במהירות הרצויה (~2 מ"ל/דקה).
      הערה: הפרפוזה צריכה להתנקז מקנולציה של וריד הפורטל לתוך צינור איסוף. ניתן להשתמש בצינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) לאחסון קל יותר. תמיסות הפרפוזה המשמשות כאן הן 2.6 מ"מ גלוקוז עם 1.2 מ"מ 3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX), 16.8 מ"מ גלוקוז ו-2.6 מ"מ גלוקוז עם 3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX) במאגר ביקרבונט קרבס-רינגר (KRB, 16 מ"מ HEPES ו-0.1% BSA, pH 7.4). תמיסת פרפוזה התחילה בתמיסה נמוכה של גלוקוז לגלוקוז גבוה, חזרה לגלוקוז נמוך, והסתיימה בתמיסת IBX לבקרה.
  2. אוספים את הפרפוזה.
    1. אסוף את הפרפוזה במרווחים של 30 דקות לתוך צינורות PCR (החלפת צינורות כל 3 דקות).
    2. לאחר כל מרווח של 30 דקות, החלף את הפתרון.
    3. בצע בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים (ELISA) עם הדגימות. ניתן לעשות זאת בשלב מאוחר יותר אם מאוחסן כראוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאות לאחר ELISA אמורות להדגים הפרשת אינסולין מהלבלב של העכבר במידה התלויה ברמות הגלוקוז בפרפוזה. בגלל החידוש של הליך זה בעכברים, ניתוח התוצאה והצלחתו תלוי בהשוואה למספר ניסויים אחרים של לבלב עכברים מעוברים. תגובת אינסולין דו-פאזית לריכוז גלוקוז גבוה נחשבת פיזיולוגית, כפי שהוערך בנבדקים אנושיים ובשיטות פריפוזיה של איים. התוצאות שהוצגו דומות לזלוף לבלב קודם בחולדות22. רמות אינסולין ממוצעות משלושה ניסויים עצמאיים מראות הפרשת אינסולין אופיינית בשלב הראשון הנגרמת על ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר לעיל נועד ליצור מערכת סגורה המורכבת מהלבלב השלם, שני כניסות (צליאק ועורק מזנטרי עליון), ויציאה אחת (וריד פורטל הכבד). כל שאר כלי הדם קשורים כדי למנוע דליפה בעת טיסת פרפוזה, כמו גם כדי להבטיח בידוד של הלבלב עצמו עם המיקרו-סביבה שלו. שלבי הקשירה בפרוטוקול זה מאפשרים גם את זרימת הפרפוזה דרך הלבלב מבלי לנסוע לאיברים אחרים שעלולים לבלבל את התוצאות, כמו הכליות, הכבד או הריאות, שעלולים להפריש פפטידים של אנגיוטנסין או לנקות במהירות אינסולין ממחזור הדם. במסגרת פרוטוקול זה, שני של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא מדווחים על ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים מודים לכריסטופר קאהיל, ג'ניפר הוליסטר-לוק, ד"ר סוזן בונר-ויר, קנאקו איוואסאקי, פרנצ'סקו הלה ופריסילה קרפטו על ייעוץ מועיל, סיוע טכני והדרכה לאורך כל הפרויקט. מחקר זה נתמך על ידי מענק NIDDK R01 DK132535.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחמצן קרום סיביםמנגנון הרווארד73-3757מאפשר לחמצן להיכנס לפרפוזה
כרית חימוםבריינטרי סיינטיפיק39 אום
קטמין/קסילזיןפטרסון וטרינרי78908598
לוח מגנטיבריינטרי סיינטיפיק39 אום
מגנטים עם גומיותבריינטרי סיינטיפיק39 אום
מיקרוסקופלא ישיםלא ישיםאין חברה ספציפית
מיכל חמצןלא ישיםלא ישיםאין חברה ספציפית
צינורות PCRתרמו-פישר/אינוויטרוגןAM12225משמש לאיסוף פרפוזה
צינור PE-30בריינטרי סיינטיפיקPE30
צינור PE-50בריינטרי סיינטיפיקPE50
משאבה פריסטלטיתלא ישיםלא ישיםאין חברה ספציפית
כלים כירורגייםלא ישיםלא ישיםאין חברה ספציפית
תפרלא ישיםלא ישיםאין חברה ספציפית

מקורות

  1. Rosenberg, L., Wang, R., Paraskevas, S. Structural and functional changes resulting from islet isolation lead to islet cell death. Surgery. 126 (2), 393-398 (1999).
  2. Paraskevas, S., et al. Apoptosis occurs in freshly isolated human islets under standard culture conditions. Transplant Proc. 29 (1-2), 750-752 (1997).
  3. Bottino, R., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
  4. Burganova, G., Bridges, C., Thorn, P., Landsman, L. The role of vascular cells in pancreatic beta-cell function. Front Endocrinol. 12, 667170(2021).
  5. Jansson, L., Carlsson, P. -O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
  6. Leibiger, I. B., Berggren, P. -O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Mol Metab. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  7. Weir, G. C., Atkins, R. F., Martin, D. B. Glucagon secretion from the perfused rat pancreas following acute and chronic streptozotocin. Metabolism. 25 (11 Suppl), 1519-1521 (1976).
  8. Pisania, A., et al. Quantitative analysis of cell composition and purity of human pancreatic islet preparations. Lab Invest. 90 (11), 1661-1675 (2010).
  9. Weir, G. C., Leahy, J. L., Braunstein, L. P. Characteristics of insulin and glucagon release from the perfused pancreas, intact isolated islets, and dispersed islet cells. Horm Res. 24 (1), 62-72 (1986).
  10. Fathi, I., Goto, M. Collagenases in Pancreatic Islet Isolation. Transplantation, Bioengineering, and Regeneration of the Endocrine Pancreas. , Elsevier Academic Press. (2019).
  11. Heiser, A., Ulrichs, K., Müller-Ruchholtz, W. Isolation of porcine pancreatic islets: low trypsin activity during the isolation procedure guarantees reproducible high islet yields. J Clin Lab Anal. 8 (6), 407-411 (1994).
  12. Basir, I., et al. Improved outcome of pig islet isolation by Pefabloc inhibition of trypsin. Transplant Proc. 29 (4), 1939-1941 (1997).
  13. White, S. A., et al. A preliminary study of the activation of endogenous pancreatic exocrine enzymes during automated porcine islet isolation. Cell Transplant. 8 (3), 265-276 (1999).
  14. Lakey, J. R. T., et al. Serine-protease inhibition during islet isolation increases islet yield from human pancreases with prolonged ischemia. Transplantation. 72 (4), 565-570 (2001).
  15. Rose, N. L., Palcic, M. M., Helms, L. M. H., Lakey, J. R. T. Evaluation of Pefabloc as a serine protease inhibitor during human-islet isolation. Transplantation. 75 (4), 462-466 (2003).
  16. Cross, S. E., et al. Collagenase penetrates human pancreatic islets following standard intraductal administration. Transplantation. 86 (7), 907-911 (2008).
  17. Balamurugan, A. N., et al. Harmful delayed effects of exogenous isolation enzymes on isolated human islets: relevance to clinical transplantation. Am J Transplant. 5 (11), 2671-2681 (2005).
  18. Li, W. Functional analysis of islet cells in vitro, in situ, and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 103, 14-19 (2020).
  19. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nat Protoc. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  20. Cohrs, C. M., et al. Bridging the gap: pancreas tissue slices from organ and tissue donors for the study of diabetes pathogenesis. Diabetes. 73 (1), 11-22 (2024).
  21. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525(2020).
  22. Wargent, E. T. Measurement of insulin secretion using pancreas perfusion in the rodent. Methods Mol Biol. 2076, 281-297 (2020).
  23. Tamayo, A., et al. Pericyte control of blood flow in intraocular islet grafts impacts glucose homeostasis in mice. Diabetes. 71 (8), 1679-1693 (2022).
  24. Yuan, L., Li, Y., Li, G., Song, Y., Gong, X. Ang(1-7) treatment attenuates β-cell dysfunction by improving pancreatic microcirculation in a rat model of type 2 diabetes. J Endocrinol Invest. 36 (11), 931-937 (2013).
  25. Carlsson, P. -O., Berne, C., Jansson, L. Angiotensin II and the endocrine pancreas: effects on islet blood flow and insulin secretion in rats. Diabetologia. 41 (2), 127-133 (1998).
  26. Penhos, J. C., et al. A rat pancreas-small gut preparation for the study of intestinal factor(s) and insulin release. Diabetes. 18 (11), 733-738 (1969).
  27. Ma, Y. H., et al. Differences in insulin secretion between the rat and mouse: role of cAMP. Eur J Endocrinol. 132 (3), 370-376 (1995).
  28. Aynsley-Green, A., Biebuyck, J. F., Alberti, K. G. Anaesthesia and insulin secretion: the effects of diethyl ether, halothane, pentobarbitone sodium and ketamine hydrochloride on intravenous glucose tolerance and insulin secretion in the rat. Diabetologia. 9 (4), 274-281 (1973).
  29. Chen, H., Li, L., Xia, H. Diabetes alters the blood glucose response to ketamine in streptozotocin-diabetic rats. Int J Clin Exp Med. 8 (7), 11347-11351 (2015).
  30. Lehmann, R., et al. Effects of ketamine sedation on glucose clearance, insulin secretion and counterregulatory hormone production in baboons (Papio hamadryas). J Med Primatol. 26 (6), 312-321 (1997).
  31. Sharif, S. I., Abouazra, H. A. Effect of intravenous ketamine administration on blood glucose levels in conscious rabbits. Am J Pharm Toxicol. 4 (2), 38-45 (2009).
  32. Komatsu, M., Takei, M., Ishii, H., Sato, Y. Glucose-stimulated insulin secretion: a newer perspective. J Diabetes Investig. 4 (6), 511-516 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ELISA
הפרשת אינסולין מגורה על ידי גלוקוז באמצעות זלוף דרך כלי הדם של העכברים עם לבלב שלם
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.