מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

Anna Rodina; Hediye Erdjument-Bromage; Mara Monetti; Zhuoning Li; Souparna Chakrabarty; Shujuan Wang; Chander S. Digwal; Laura Tuffery; Palak Panchal; Sahil Sharma; Tanaya Roychowdhury; Thomas A. Neubert; Gabriela Chiosis

doi:10.3791/69197

מאמר שיטה

מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

DOI:

10.3791/69197

⸱

24 באוקטובר 2025

Anna Rodina^*¹ , Hediye Erdjument-Bromage^*² , Mara Monetti³ , Zhuoning Li³ , Souparna Chakrabarty¹ , Shujuan Wang¹ , Chander S. Digwal¹ , Laura Tuffery³ , Palak Panchal¹ , Sahil Sharma¹ , Tanaya Roychowdhury¹ , Thomas A. Neubert²^,⁴ , Gabriela Chiosis¹^,⁵

¹Chemical Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, ²Department of Neuroscience and Physiology, NYU Grossman School of Medicine, ³Proteomics Core, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, ⁴NYU Neuroscience Institute, NYU Grossman School of Medicine, ⁵Department of Medicine, Division of Solid Tumors, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לכידה וזיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות למחלה מתאים ורקמות מקומיות באמצעות בדיקות כימיות וספקטרומטריית מסה. מערכי הנתונים של האינטראקציה המתקבלים מנותחים באמצעות פלטפורמה ייעודית מבוססת אינטרנט כדי לחשוף ליקויים דינמיים ברשת ושינויים במסלול הקשורים למחלות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) מעוצבות מחדש באופן דינמי במחלות, אך רוב הגישות לביולוגיה מערכתית מתמקדות בשינויים בשפע החלבונים, ומתעלמות מתפקוד לקוי ברמת האינטראקציה הקריטית. כאן, אנו מציגים שיטה כימו-פרוטאומית חזקה - אינטראקטום חלבון-חלבון לא מתפקד (dfPPI) - המאפשרת מיפוי בתפוקה גבוהה, שיטתי, קונטקסטואלי למחלה של תפקוד לקוי של רשת PPI בתאים וברקמות אנושיות ראשוניות. שיטה זו משלבת בדיקות ביולוגיה כימית הלוכדות באופן סלקטיבי מכלולי אינטראקטום מבוססי אפיכפרום עם ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית ללא תוויות (LC-MS/MS) וניתוח חישובי מבוסס רשת, כדי לחשוף את החיווט מחדש של רשתות חלבונים שאינן ניכרות מנתונים טרנסקריפטומיים או פרוטאומיים בלבד. ניתן ליישם את פלטפורמת dfPPI על פני מצבי מחלה, מינים ורקמות כדי לזהות צמתים ניתנים לפעולה של תפקוד לקוי ולאפשר תובנות ברזולוציה גבוהה ברמת המערכת לגבי התקדמות המחלה. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים נהלים שלב אחר שלב להכנת דגימות, טיפול בבדיקה כימית, העשרת זיקה, ניתוח LC-MS/MS ללא תוויות ותהליכי עבודה ביואינפורמטיים המשמשים ליצירה ופירוש של מערכי נתונים של dfPPI. מאמר זה נועד לקדם את יכולת השחזור והנגישות של גישה זו, ולתמוך באימוצה על ידי קהילות הביולוגיה של המערכות והמחקר התרגומי הרחבות יותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תפקודם של תאים, ובהרחבה אורגניזמים, תלוי בתיאום המדויק של רשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) ^1,2. רשתות אלה אחראיות על ארגון וביצוע כמעט כל התהליכים הביולוגיים. בעוד שרשתות PPI הן דינמיות מטבען ומגיבות ללחץ, במחלה, הן עלולות להיות מחווטות מחדש באופן חריג, מה שמוביל לתפקודים לא מסתגלים. חשוב לציין, חיווט מחדש זה אינו כרוך בהכרח בשינויים בביטוי גנים או חלבונים; במקום זאת, הוא נובע מאינטראקציות פיזיות משתנות בין חלבונים המתבטאים בדרך כלל ^3,4,5. גישות מסורתיות בביולוגיה מערכתית, כגון טרנסקריפטומיקה או פרוטאומיקה, אינן מצליחות ללכוד את השינויים הקריטיים הללו ברמת האינטראקציה.

טכנולוגיות מיפוי PPI התקדמו משמעותית, ומציעות תובנות לגבי ארגון ורגולציה של רשתות סלולריות 6,7,8,9,10,11. גישות נפוצות, כולל טיהור זיקה-ספקטרומטריית מסה (AP-MS), קישור צולב (XL)-MS, תיוג קרבה וחלוקה משותפת, כל אחת מהן מציעה יתרונות ספציפיים, כגון ספציפיות גבוהה, רזולוציה מרחבית או היכולת לזהות קומפלקסים חולפים 6,8,9,10,11 . עם זאת, שיטות אלה דורשות לעתים קרובות חלבוני פיתיון, מניפולציה גנטית או ביואינפורמטיקה מורכבת, ועשויות להתקשות ללכוד את החיווט מחדש בקנה מידה גדול, מונע מחלות של רשתות חלבונים במערכות ביולוגיות מקומיות 6,7,8,9,10,11 . רובם גם חסרים מדרגיות, מה שהופך אותם לבלתי מעשיים לניתוח קבוצות מדגם גדולות או למיפוי שיטתי של שינויים באינטראקטום על פני תנאים, סוגי תאים או נקודות זמן 6,7,8,9,10,11 (טבלה 1).

כדי להתמודד עם פער זה, פיתחנו את פלטפורמת אינטראקטום חלבון-חלבון (dfPPI) לא מתפקדת, שיטה כימו-פרוטאומית המזהה ישירות את הפרעות התפקוד של רשת ה-PPI האחראיות לפנוטיפים של מחלות¹². הוא ממנף תובנה ביולוגית מרכזית: במצבי מחלה, תת-קבוצה של מלווים מולקולריים יוצרים פיגומים על-מולקולריים הנקראים אפיכפרומים 13,14,15. מבנים אלה אינם פועלים בקיפול חלבונים אלא מתפקדים כמרכזי אינטראקציה של פיגומים המארגנים מחדש את קישוריות החלבון³. באופן מכריע, החלבונים המופרדים לאפיכפרומים אינם אקראיים; הם אלה המעורבים באופן פעיל בשמירה על פנוטיפ המחלה 16,17,18,19,20. על ידי לכידת חלבונים אלה הקשורים לאפיכפרום והאינטראקטורים שלהם, dfPPI מזהה את השינויים המדויקים ברשת המניעים מצבי מחלה ספציפיים. חיווט מחדש של רשת מונע אפיכפרום נפוץ במחלות - בעיקר בקבוצות מחלת אלצהיימר ו~70% בדגימות סרטן^16,20 התומכות ביישום של dfPPI למחקרים גדולים וממוקדי מחלה.

פלטפורמת dfPPI מקיפה את כל זרימת העבודה מהכנת דגימה, לכידת זיקה אפיכפרום וזיהוי אינטראקטום על ידי טרשת נפוצה, ועד לניתוחים ביואינפורמטיים במורד הזרם כגון העשרת מסלול ומידול רשת חלבונים פונקציונלית (איור 1). השיטה עושה שימוש בבדיקות כימיות ספציפיות לאפיכפרום המשותקות על מטריצות זיקה (חרוזי PU או בדיקות אחרות)13,16,17 כדי לבודד את האינטראקטום התפקודי מתאים או רקמות. בדיקות אלה כבר אומתו בקפדנות במספר פרסומים לספציפיות לאפיכפרומים והתאמה ל-dfPPI 16,17,18,20,21,22. קומפלקסים שנלכדו נתונים לטרשת נפוצה, תוך שימוש בתהליכי עיכול על חרוזים ובתוך הג'ל, ואחריהם LC-MS/MS ללא תוויות. לאחר מכן ניתן לנתח את הנתונים המתקבלים באמצעות צינור ביואינפורמטיקה ייעודי המגדיר תפקוד לקוי ברמת האינטראקציה ומקשר אותו לתהליכים ביולוגיים ופנוטיפים. מכיוון שאפיכפרומים פיגומים אינטראקטומים ספציפיים להקשר 17,18,20, dfPPI חושף כיצד רשתות חלבונים מעוצבות מחדש במחלה, סוג תא או שלב מסוים, מה שהופך אותו לכלי ביולוגיה מערכתי רב עוצמה לפנוטיפ מדויק.

השיטה ניתנת להרחבה ויושמה על מאות דגימות קליניות וניסיוניות, כולל רקמות אנושיות לאחר המוות ותאים מתורבתים, במחלות מגוונות כגון סרטן וניוון עצבי 16,17,18,19,20,22,23. על ידי חשיפת השינויים ב-PPI המגדירים מצב פתולוגי, dfPPI מאפשר הן תובנה מכניסטית והן גילוי מטרות טיפוליות הניתנות לפעולה 16,17,18,19,20,22,23.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט את מרכיבי הניסוי של פלטפורמת dfPPI, החל מלכידת זיקה של אינטראקטומים הקשורים לאפיכפרום ועד הכנת דגימה ל-LC-MS/MS ועד לזיהוי אינטראקטום באמצעות MS. צינור הניתוח החישובי - כלומר, מה שנעשה עם רשימת החלבונים שזוהו על ידי MS כדי להגדיר אינטראקציות דיפרנציאליות והשלכות פונקציונליות - אינו מכוסה כאן בגלל מגבלות מקום. עם זאת, הוא נגיש באופן חופשי ומתועד בהרחבה באמצעות אפליקציית dfPPI Shiny בכתובת https://epichaperomics.mskcc.org (מעודכן ל-https://dfppi.mskcc.org) ודרך אתר מעבדת Chiosis בכתובת https://www.chiosislab.com/resources. בנוסף לפורטלים אלה, צינור הביואינפורמטיקה המלא והתסריטים הנלווים כלולים במספר פרסומים המיישמים dfPPI על סרטן 16,17,19 ומחלת אלצהיימר ^18,20.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה למחקר בבני אדם של המוסד שלנו והוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים. ציוד וריאגנטים המשמשים במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה לדוגמא ללכידת זיקה

מיצוי חלבון מרקמה
הערה: פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לדגימות רקמת מוח לאחר המוות.
1. הכן מאגר מיצוי חלבון המכיל 20 מ"מ טריס (pH 7.5), 20 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl₂ ו-0.01% NP-40 (מאגר ליזה מקורי). יש להוסיף מעכבי פרוטאז ופוספטאז מיד לפני השימוש. שמור את המאגר על קרח.
2. הנח את הרקמה הקפואה (נפח יעד כ-50 מ"מ) לתוך צינור הומוגנייזר מיקרו רקמות, המורכב מצינור מיקרו-צנטריפוגה מיוחד של 1.5 מ"ל המצויד בעלי. הוסף 500-700 מיקרוליטר של מאגר ליזה מקורי, והתאם את הנפח על סמך קומפקטיות הרקמות וקלות ההומוגניזציה. הומוגניזציה של הדגימה על קרח על ידי הזזת העלי בעדינות למעלה ולמטה וכנגד הקירות השוחקים של צינור ההומוגנייזר עד שנוצר תרחיף הומוגני.
  הערה: בצע את כל השלבים על קרח כדי לשמור על מכלולי חלבון בתצורתם המקורית וכדי למנוע פירוק חלבון.
3. דגירה של ליזטים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על ידי הנחת הבקבוקון על יחידת סיבוב. מערבבים בעדינות את הדגימות במהלך הדגירה באמצעות סיבוב.
4. צנטריפוגה את הדגימות ב-13,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגה שולחנית להסרת פסולת.
5. אספו את הסופרנטנטים והעבירו אותם לצינורות מיקרו-צנטריפוגה שקופים של 1.5 מ"ל. הימנע מהפרעה לכדור במהלך ההעברה.
6. קבעו את ריכוז החלבון הכולל בסופרנטנט באמצעות ערכת הבדיקה של חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) בהתאם להוראות היצרן.
  הערה: ניתן לאחסן ליזטים של חלבון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים. עיין בפרסום קודם²⁴ להשפעה של מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים וטמפרטורת האחסון על שלמות מכלולי החלבון.
נורמליזציה לדוגמה
הערה: HSP90α ו-HSP90β הם מרכיבי הליבה של האפיכפרום והם שותפי הקישור הישירים של הגשושית הכימית המשמשת ללכידת אינטראקטום 13,21,23. נורמליזציה של דגימות המבוססות על HSP90α (או HSP90β) מבטיחה שכמות האפיכפרום הניתן לבדיקה מותאמת בין הדגימות, דבר חיוני להשוואה מדויקת של האינטראקטומים שנלכדו. ניתן לנרמל דגימות על סמך רמות HSP90 שנקבעו על ידי Western Blot, אך ניתן להשתמש גם בשיטות אחרות. אם רמות HSP90 דומות בין דגימות, דלג על סעיף זה והמשך לשלב 1.3. השימוש בכתמי HSP90α/β כאן הוא לנורמליזציה של קלט בלבד ואין לפרש אותו כמדד שפע אפיכפרום.
1. הכן 2× מאגר דגימה של Laemmli המורכב מ-4% נתרן דודציל סולפט (SDS), 20% גליצרול, 10% 2-מרקפטואתנול, 0.02% ברומופנול כחול ו-0.125 M Tris-HCl, pH ~ 6.8.
  זהירות: 2-מרקפטואתנול הוא רעיל ונדיף ויש לטפל בו במכסה אדים.
2. שלב 5 מיקרוגרם של תמצית חלבון המוח הכוללת (משלב 1.1) 1:1 (v/v) עם 2× מאגר דגימת Laemmli בצינור מיקרוצנטריפוגה שקוף של 1.5 מ"ל.
3. מחממים את הדגימות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות ביחידת חימום כדי לנטרל חלבונים לפני העמסה על אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל-סולפט (SDS-PAGE).
4. טען את הדגימות על ג'ל חלבון 8% Tris-Glycine מוכן מראש. לחלופין, השתמש בג'לים יצוקים ביד.
5. טען 5 מיקרוליטר של תקן חלבון צבוע מראש על כל ג'ל, למשל, לבאר הראשונה, כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של החלבון.
6. הפעל את הג'לים במאגר ריצה של 1× TGS (Tris-Glycine-SDS) ב-RT. זמן ריצה טיפוסי הוא 1.5-2 שעות ב-100 וולט.
7. הכן מאגר העברה המכיל 25 מ"מ טריס, 192 מ"מ גליצין ו-20% מתנול.
  זהירות: מתנול דליק ויש לטפל בו בהתאם להנחיות הבטיחות.
8. העבירו את החלבונים על קרום ניטרוצלולוזה במאגר העברה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות במתח קבוע (100 וולט).
9. הכינו תמיסת שטיפת ממברנה (1× TBS-0.1% Tween-20) ותמיסת חסימה (5% חלב ב-1× TBS-0.1% Tween-20). פרוטוקול זה משתמש באבקת חלב יבש ללא שומן ממקור מסחרי.
10. הנח את הממברנה בתמיסת חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר (RT) עם תסיסה עדינה על נדנדת פלטפורמה. השתמש ב-10 מ"ל של תמיסת חסימה לכל מיני ג'ל.
11. הסר את תמיסת החסימה ודגר את הממברנה עם נוגדן אנטי-HSP90α (דילול של 1:6,000 בתמיסת חסימה של 10 מ"ל) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על נדנדת פלטפורמה.
12. הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף את הממברנה שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם 10 מ"ל תמיסת כביסה.
13. הוסף את הנוגדן המשני נגד ארנב עז מצומד HRP (דילול של 1:5,000 ב-10 מ"ל, 1× TBS-0.1% Tween-20) ודגירה למשך שעה אחת ב-RT על נדנדת פלטפורמה.
14. הסר את הנוגדן המשני ושטוף את הממברנה ארבע פעמים בתמיסת כביסה (אותו נפח ותזמון כמו לעיל).
15. זהה את האות הכימילומינסנצינטי הספציפי ל-HSP90α באמצעות ערכת כימילומינסנציה משופרת (ECL) בהתאם להוראות היצרן. השתמש במערכת הדמיה כימילומינסנציה או בסרט אוטורדיוגרפי.
16. כמת את רמות HSP90α בדגימות על סמך עוצמת האות וחשב גורם נורמליזציה למשיכה במורד הזרם.
  הערה: עוצמת האות HSP90 משקפת את כמות האפיכפרום הניתן למטרה בכל דגימה. על ידי השוואת עוצמת האות בין דגימות ונורמליזציה לדגימת ייחוס המופעלת על כל ג'ל, ניתן להתאים את נפחי הקלט ללכידת אינטראקטום בהתאם. ניתן לבצע כימות באמצעות תוכנת דנסיטומטריה. כלול תמיד ציטוט של דגימת ייחוס על כל ג'ל כדי לאפשר נורמליזציה בין כתמים.
הכנת חרוזי PU
הערה: ניתן לסנתז חרוזי PU וחרוזי בקרה בתוך הבית כפי שדווח בעבר ^21,25 או לבקש ממעבדת Chiosis עם ביצוע הסכם העברת חומרים (MTA). יש לאחסן אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס באיזופרופנול.
1. קח חרוזי פוליאוריטן (PU) או חרוזי בקרה ישירות ממלאי האיזופרופנול. כלול כ-30% עודף כדי לקחת בחשבון אובדן חרוזים במהלך הכביסה והטיפול.
2. הסר את ממס האחסון: תן לחרוזים להתייצב ואז שאב את האיזופרופנול. הוסף מאגר ליזה מקורי (1 מ"ל עבור צינור של 1.5 מ"ל; 5 מ"ל עבור חרוט של 15 מ"ל) והשעיה מלאה על ידי פיפטינג עדין או היפוך.
3. שטפו ואזנו שלוש פעמים: לכל שטיפה, מערבולת להשעיה, צנטריפוגה (צינור 1.5 מ"ל: 10,000 × גרם, 1 דקה; 15 מ"ל חרוטי: 3,000 × גרם, 5 דקות), ואז שאפו את הסופרנטנט עם קו ואקום המצויד בקצה פיפטה, תוך הקפדה לא להפריע לגלולה.
4. הוסף מאגר ליזה מקורי לחרוזים השטופים ביחס נפח של 1:1 (חרוזים:מאגר) כדי ליצור תמיסת חרוזים אחידה.
5. Aliquot 40 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי PU (או חרוזי בקרה) (למשל, 1:1 v/v חרוזים: מאגר) לכל דגימה לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. השתמש בקצה פיפטה כשהקצה חתוך כדי לאפשר חלוקת חרוזים קלה.
  הערה: חרוזי PU רגישים לאור. השתמש בצינורות כהים או עטופים בנייר כסף של 1.5 מ"ל במהלך שלבי המשיכה. בשל ציפוי פני השטח ההידרופובי שלהם עם קלסר אפיכפרום המולקולה הקטנה, חרוזי PU נוטים להתגבש ולהיצמד למשטחי פלסטיק. פיפטה בעדינות וערבבו היטב כדי להבטיח השעיה אחידה. זה קריטי להוציא כמויות שוות של תמיסת חרוזים לכל דגימה כדי למנוע שונות בלכידת החלבון, מה שעלול להוביל לתוצאות לא עקביות או לא ניתנות לשחזור.
6. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם מאגר ליזה מקורי על ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר לכל צינור, מערבולת, צנטריפוגה ב-10,000 × גרם למשך דקה אחת, והשלכת הסופרנטנט על ידי שאיפה. ודא שהחרוזים תלויים במלואם בין כל כביסה.
  הערה: בעת שאיפה, הימנע מלגעת בחרוזים. לחץ בעדינות את קצה הפיפטה על דופן הצינור תוך הסרת הנוזל.
7. לאחר הכביסה הסופית, הסר את רוב הנוזל מהצינורות, הקפד לא להפריע לכדור החרוזים.
  הערה: ניתן לאחסן חרוזים שטופים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים. בדרך כלל, משתמשים בחרוזים תוך 1-2 ימים לאחר ההכנה.
נפתח Interactome
הערה: השלב הראשון של המשיכה למטה הוא שלב ניקוי מקדים באמצעות חרוזי בקרה, המצומדים למולקולה קטנה אינרטית שאינה קושרת אפיכפרומים¹⁶. שלב זה מסיר חלבונים, אגרגטים ופסולת בלתי מסיסים שאינם מקיימים אינטראקציה ספציפית מהליזאט, ובכך משפר את הספציפיות של משיכת חרוז ה-PU שלאחר מכן. ניקוי מקדים מפחית את קשירת הרקע ומשפר את הזיהוי של חלבונים ספציפיים הקשורים לאפיכפרום.
האינטראקטום המשוחזר על ידי פרוטוקול זה מנותח על ידי טרשת נפוצה, שהיא רגישה מאוד למזהמים ניסיוניים. כדי להבטיח זיהוי מדויק של חלבון ולשמור על איכות הנתונים, השתמש תמיד במאגרים וריאגנטים טריים שהוכנו, צמצם את החשיפה לאבק וקרטין ולבש כפפות נקיות ללא אבקה בעת טיפול בדגימות, חומרים מתכלים או ציוד. השתמש בכלי זכוכית/חומרים מתכלים ייעודיים ל-MS עבור כל שלבי העיכול הנשלפים ובתוך הג'ל, ושמור על כל הפריטים המשמשים לכתמים מערביים בנפרד פיזית. במקרה של שימוש חוזר בכלי זכוכית, יש לטהר על ידי שטיפה ברצף עם 100% מתנול, מים טהורים במיוחד, 80% חומצה אצטית, מים טהורים במיוחד, ולאחר מכן לייבש באוויר. אין להשתמש בחומרי ניקוי; אפילו שאריות עקבות עלולות לפגוע בעמודות LC ובמקורות יונים.
1. הוסף את תמציות החלבון המנורמלות (לפי שלב 1.2, מחושב על סמך עוצמת כתם HSP90) לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בודדים של 1.5 מ"ל המכילים 40 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי הבקרה (כלומר, חרוזי 20 מיקרוליטר + מאגר 20 מיקרוליטר), והתאם את הנפח הסופי ל-250 מיקרוליטר על ידי הוספת הנפח המתאים של מאגר ליזה מקורי.
  הערה: כדי לקבוע נפחי קלט ספציפיים לדגימה, השתמש בנוסחה A1 = (60 / C1) × X1, כאשר A1 הוא נפח החלבון הכולל המנורמל להוספה (μL), C1 הוא ריכוז החלבון הנמדד (μg/μL), ו-X1 הוא גורם הנורמליזציה הנגזר מ-HSP90 Blotting (כמתואר בשלב 1.2). נפח המאגר הנוסף שיש להוסיף מחושב כ-250 מיקרוליטר פחות A1. אם אין צורך בנורמליזציה, השתמש ב-250 מיקרוגרם חלבון כולל ב-250 מיקרוליטר.
2. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם סיבוב על מסובב קצה על קצה (10-15 סל"ד).
3. צנטריפוגה את הצינורות ב-10,000 × גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את חרוזי הבקרה יחד עם חלבון מצטבר או בלתי מסיס.
4. אסוף בזהירות את הסופרנטנט מחרוזי הבקרה באמצעות פיפטה של 1 מ"ל והעביר אותו לצינורות של 1.5 מ"ל המכילים 40 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי ה-PU השטופה.
5. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות עם סיבוב על מסובב קצה על קצה (10-15 סל"ד).
6. צנטריפוגה כל צינור ב-10,000 × גרם למשך דקה אחת, שואבים את הסופרנטנט ושוטפים את החרוזים ארבע פעמים עם 1 מ"ל של מאגר ליזה מקורי. לכל שטיפה: מערבולת, צנטריפוגה ושאיפה, תוך שימוש בפרמטרים המתוארים בשלב 1.3.
  הערה: בשלב זה, ניתן לעבד את הדגימות עבור LC-MS/MS באמצעות אחת משתי זרימות עבודה: (1) SDS-PAGE ואחריו עיכול בתוך הג'ל, או (2) עיכול על החרוזים של החלבונים שנלכדו.
  לזרימת העבודה של עיכול בתוך הג'ל, המשך עם הפרוטוקול כפי שנכתב. לעיכול על החרוזים, שטפו את החרוזים פעמיים נוספות עם PBS קר והמשיכו מיד לסעיף 3. אין להקפיא את החרוזים אם ממשיכים בעיכול על החרוזים; יש לעבד דגימות טריות באותו היום. הקפאת קומפלקסים של חלבונים הקשורים לחרוזים עלולה לפגוע ביעילות העיכול על ידי קידום צבירה או אובדן מסיסות חלבון, מה שמוביל להתאוששות נמוכה יותר של פפטידים ולשונות מוגברת. בהתבסס על המלצות הליבה של טרשת נפוצה, יש לעבד דגימות טריות באותו יום כדי להבטיח עיכול עקבי על החרוזים.
הכנה לדוגמא לעיכול בתוך הג'ל
1. הוסף 25 מיקרוליטר של 2× מאגר דגימת Laemmli לדגימות החרוזים שהוכנו בשלב 1.4.6, הכלולות בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  הערה: ניתן לאחסן את הדגימות בשלב זה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד 24 שעות. טען תמיד את כל נפח הדגימה לג'ל SDS-PAGE לעיכול בתוך הג'ל כדי למקסם את כיסוי הפרוטאום ולהבטיח ייצוג מלא של האינטראקטום. טעינה חלקית אינה מומלצת. אם נפח הדגימה מוגבל וטעינה חלקית היא בלתי נמנעת, יש לאחסן את החומר הנותר במכסים כדי למזער את מחזורי ההקפאה-הפשרה ולשמור על שלמות האינטראקטום.
2. מחממים כל דגימה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (בתוספת 2× מאגר דגימת Laemmli, כנ"ל) כדי לנטרל את קומפלקסי החלבון ולסלק אותם מהחרוזים לפני הטעינה על SDS-PAGE. ה-SDS וחומרי ההפחתה במאגר משבשים PPIs ומשחררים חלבונים מהמטריצה.
3. צנטריפוגה כל צינור ב-10,000 × גרם למשך דקה אחת ב-RT.
4. יש לטעון כל סופרנטנט על 4-20% ג'ל SDS-PAGE בצבע שיפוע מוכן מראש.
5. הפעל את הג'לים במאגר ריצה של 1× TGS ב-RT ועצור את הריצה באמצע הדרך (~3.5-4 ס"מ לתוך הג'ל ב-100 וולט, בדרך כלל זמן ריצה של 30-60 דקות).
6. הסר את הג'ל מיחידת האלקטרופורזה והמשך להכתים בכחול מבריק של Coomassie לפי הוראות היצרן.
  הערה: ניתן להעביר את הג'ל המוכתם, שקוע ב-5-7 מ"ל מים טהורים במיוחד במיכל פלסטיק, למתקן MS לזיהוי חלבון. אם המוצר לא מעובד מיד, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במים טהורים במיוחד למשך עד 1-2 שבועות. נעשה שימוש בשני זרימות עבודה פרוטאומיות חלופיות בהתאם למתקן הליבה שביצע את העבודה ומטרות הניסוי: סעיף 2 מתאר עיכול בתוך הג'ל ואחריו ניתוח רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA)-MS באמצעות ספקטרומטר מסה אורביטראפי מרובע; סעיף 3 מפרט פרוטוקול עיכול על חרוזים המותאם לספקטרומטריית ניידות יונים לכודים עם פיצול הצטברות סדרתי מקביל (diaPASEF)²⁶. ניתן להצליב שלבים במידת הצורך.

2. זיהוי חלבון על ידי LC-MS/MS עם עיכול חלבון בתוך הג'ל

הפחתת ג'ל ואלקילציה של חלבונים ציסטיניליים
1. כרתו את האזור המוכתם של כל נתיב ג'ל מוכתם בקומאסי וחתכו אותו לכחמש פרוסות ג'ל שוות בגודלן. הימנע מכל פרוסה על ידי דגירה שלוש פעמים ב-500 מיקרוליטר של 50% מתנול (v/v) למשך דקה אחת ב-37 מעלות צלזיוס עם תסיסה ב-700 סל"ד על שייקר מיקרו-צינור מבוקר טמפרטורה.
  הערה: כל פרוסת ג'ל צריכה להיות לא גדולה מ-~1 ס"מ ×-0.5 ס"מ ×-1 ס"מ כדי להבטיח דיפוזיה יעילה של ריאגנטים בשלבים הבאים, כמו גם עיכול יעיל של טריפסין בתוך הג'ל למשך הלילה. הסר את אזור הג'ל המתאים לחלבונים מוכתמים בכבדות - כגון HSP90 ו- HSC70, המייצגים קושרים ישירים של הבדיקה הכימית ומרכיבי הליבה של האפיכפרום 15,16,23 - בנפרד משאר הג'ל. השפע הגבוה שלהם עלול אחרת להפריע לזיהוי וכימות של אינטראקטורים בשפע נמוך יותר במהלך ניתוח LC-MS/MS.
2. דגרו כל פרוסת ג'ל ב-500 מיקרוליטר של 5 מ"מ אמוניום ביקרבונט (ABC) המוכן ב-30% אצטוניטריל (ACN) ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-700 סל"ד על שייקר מיקרו-צינור מבוקר טמפרטורה למשך 15 דקות להסרת שאריות כתם. חזור על הדגירה עד שפרוסת הג'ל נמנעת לחלוטין.
  הערה: כל כתם חלבון גלוי שנותר עלול להפריע לקשירת פפטיד למטריצת C18 במהלך שלב ניקוי הפפטיד, ולהפחית את ההתאוששות ואת הרגישות לטרשת נפוצה במורד הזרם.
3. הסר והשליך את תמיסת ABC/ACN באמצעות פיפטה עדינה, הקפד לא לאבד את חתיכות הג'ל (כלומר, אל תשאב את חתיכות הג'ל יחד עם הנוזל). לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של 100% ACN לכל צינור, וודא שחתיכות הג'ל שקועות במלואן. דגירה ב-RT על שייקר מסלולי ב-700 סל"ד למשך 10 דקות, או עד שחתיכות הג'ל הופכות שקופות, מתכווצות בגודלן ומקבלות מראה של נייר לבן.
  זהירות: ACN דליק ויש לטפל בו במכסה אדים.
4. הסר והשליך את ה-ACN מכל צינור באמצעות פיפטה עדינה, הקפד לא לשאוב חתיכות ג'ל. צנטריפוגה קצרה ב-1,000 × גרם למשך 10 שניות כדי לאסוף שאריות נוזל, ולשאוף בזהירות את הטיפות הנותרות בעזרת פיפטה עדינה. הנח את הצינורות הפתוחים בצנטריפוגת ואקום ב-RT למשך 10-15 דקות, או עד שפרוסות הג'ל יבשות ונוקשות.
  הערה: אין לייבש יתר על המידה. בדוק מעת לעת כדי למנוע סדקים או התכווצות יתר של חתיכות ג'ל. לאחר הייבוש, יש לאחסן את חתיכות הג'ל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בצינור אטום בעל קשירה נמוכה או בצינור מיקרו-צנטריפוגה עד לעיכול; חלבונים הקשורים לג'ל ומטוהרים יציבים עד מספר ימים כאשר הם נשמרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. הפחתה: הוסף ~100 מיקרוליטר של 10 מ"מ דיתיותרייטול (DTT) (מוכן טרי ממלאי 500 מ"מ באמוניום ביקרבונט של 50 מ"מ) לכל צינור דגימה, וודא שחתיכות הג'ל שקועות במלואן. דגירה בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות עם תסיסה ב-700 סל"ד על שייקר מיקרו-צינור מבוקר טמפרטורה.
  אזהרה: DTT הוא גורם לגירוי בעור ובנשימה. טפל בתוך מכסה אדים כימי ולבש כפפות.
  הערה: ודא שהצינורות סגורים היטב במהלך הדגירה כדי למנוע אידוי ולשמור על ריכוז DTT.
6. אלקילציה: הסר את תמיסת ה-DTT מכל צינור באמצעות פיפטה בעלת קצה עדין, הקפד לא להפריע לחתיכות הג'ל. הוסף מיד ~100 מיקרוליטר של 55 מ"מ יודואצטמיד (IAA) ב-50 מ"מ ABC כדי לכסות את פרוסות הג'ל במלואן. דגירה ב-RT עם תסיסה ב-700 סל"ד למשך 30 דקות בחושך.
  אזהרה: IAA רעיל ורגיש לאור. בצע את כל הטיפול במכסה אדים תוך לבישת כפפות.
  הערה: ודא הסרה מלאה של DTT לפני הוספת IAA כדי למנוע כיבוי של תגובת האלקילציה. עטפו את הצינורות בנייר אלומיניום או השתמשו במיכלים חוסמי אור במהלך הדגירה כדי למזער את פירוק ה-IAA.
7. צנטריפוגה את הצינורות לזמן קצר ב-1,000 × גרם למשך 5 שניות ב-RT כדי לאסוף שאריות נוזל בתחתית. הסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות קצה פיפטה דק (למשל, קצה P10) כדי למנוע הפרעה לחתיכות הג'ל. הטה מעט את הצינור ושאף מהקצה כדי למזער את הסיכון לשאיבת שברי ג'ל.
8. שיווי משקל: מכסים את חתיכות הג'ל ב-500 מיקרוליטר של 50 מ"מ ABC ב-30% ACN. דגירה ב-RT למשך 10 דקות, תסיסה ב-700 סל"ד על שייקר מסלולי מחומם. שלב זה מסייע בהסרת עודף ריאגנט אלקילציה ומאזן את הג'ל לפני התייבשות.
9. הסר את התמיסה: סובב לזמן קצר ב-1,000 × גרם למשך 5 שניות והשליך את הסופרנטנט באמצעות פיפטה דקה, כמתואר לעיל.
10. לייבש שוב: חזור על שלבים 2.1.3 ו-2.1.4 כדי לייבש מחדש את חתיכות הג'ל באמצעות 100% ACN ואחריו צנטריפוגה ואקום עד לייבוש. שלב זה מבטיח התאוששות אופטימלית של פפטידים במהלך העיכול האנזימטי.
פרוטאוליזה בתוך הג'ל וניקוי פפטידים
1. עכל את דגימות הג'ל המיובשות על ידי הוספת טריפסין בדרגת MS בריכוז סופי של 5 ננוגרם/מיקרוליטר ב-50 מ"מ ABC כדי להחזיר לחות מלאה לחתיכות הג'ל (בדרך כלל 50-100 מיקרוליטר נפח כולל, או מספיק כדי לכסות פרוסות ג'ל). דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, תוך הקפדה על אטימות הצינורות היטב למניעת אידוי. ערבב בעדינות במידת האפשר (למשל, 300 סל"ד על שייקר מיקרו-צינור מבוקר טמפרטורה).
2. החמצת הדגימה לאחר עיכול לילה על ידי הוספת 10% חומצה פורמית (FA) טיפתית כדי להשיג ריכוז סופי של 1% (v/v) (למשל, הוסף 1 מיקרוליטר של 10% FA לעיכול של 100 מיקרוליטר). מערבבים בעדינות, ואז סוניקציה של הצינורות למשך 10 דקות בסוניקטור אמבט מים RT כדי לשפר את מיצוי הפפטידים.
3. הסר בזהירות את הסופרנטנט המכיל פפטיד באמצעות פיפטה בעלת קצה דק (למשל, קצה צר P10), הקפד לא להפריע למטריצת הג'ל או לשאוב שברי ג'ל. העבירו את הסופרנטנט שנאסף לתוך שפופרת של 500 מיקרוליטר עם קשירה נמוכה והניחו אותו על קרח.
4. הוסף תמיסת 5% FA/50% ACN (v/v) לכל שפופרת (בדרך כלל ~50-100 מיקרוליטר, או מספיק כדי לכסות את חתיכות הג'ל במלואן), וערבב בעדינות ב-RT (למשל, על שייקר ב-70 סל"ד למשך 10-15 דקות) כדי לחלץ שאריות פפטידים. אספו בזהירות את הסופרנטנט ושלבו אותו עם תמיסת הפפטיד המקורית משלב 2.2.3.
5. יש לרכז את תמצית הפפטיד המשולבת באמצעות צנטריפוגת ואקום ב-RT (למשל, 1,000 × גרם למשך ~30 דקות) עד שנותרה רק טיפה קטנה. אל תאפשר לדגימה להתייבש לחלוטין, מכיוון שהדבר עלול לגרום לאובדן פפטידים עקב היצמדות לדפנות הצינור. השתמש בתמצית המיובשת חלקית מיד להתפלה או אחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בשפופרת אטומה עם קשירה נמוכה.
6. יש להמליח את הפפטידים באמצעות קצות פיפטה ארוזים בקנה מידה קטן בקנה מידה קטן (כלומר, StageTips) שהוכנו עם שני דיסקי מיצוי C18 מוערמים המוכנסים לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, כפי שתואר קודם לכן²⁷, עם השינויים הבאים:
7. הפעל את דיסקי C18 על ידי הוספת 40 מיקרוליטר מתנול. צנטריפוגה קצה הפיפטה המכיל את הדיסקים (מוכנס לקצה פיפטה ריק של 200 מיקרוליטר ומונח בתוך צינור של 500 מיקרוליטר) באמצעות צנטריפוגה ספסל ב-1,500 × גרם למשך 3 דקות.
  הערה: בכל השלבים, אל תאפשר לדיסקי C18 להתייבש. ייבוש יפריע לקשירת פפטידים ולפליטה. ייתכן שיהיה צורך לקצר את קצה הפיפטה החיצוני של 200 מיקרוליטר (שרוול) המחזיק את קצה הפיפטה הארוז בקנה מידה קטן C18 הארוז ביד על ידי חיתוך ~ 1 ס"מ מהקצה כדי להבטיח שמכלול שני הקצוות בצינור מתאים כראוי לצנטריפוגה.
8. לאזן את הדיסקים על ידי הוספת 0.1% FA וצנטריפוגה כאמור לעיל.
9. מרחו את תמיסת הפפטיד, שהורכבה מחדש ב-20 מיקרוליטר של 0.1% FA, ישירות על החלק העליון של הדיסקים המוערמים.
10. צנטריפוגה בעוצמה של 1,500 × גרם למשך 5 דקות כדי להקל על קשירת פפטידים לדיסקות C18.
11. שטפו את הפפטידים הקשורים על ידי העברת 40 מיקרוליטר של 0.1% FA דרך העמודה.
12. פפטידים עם 40 מיקרוליטר של 70% ACN המכילים 0.1% FA. אחסן את הפפטידים המנופחים בצינורות בעלי קשירה נמוכה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח LC-MS/MS. הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.
Nano-LC בשילוב עם ניתוח MS באמצעות DIA
1. יש לרכז את הפפטיד המומלח באמצעות צנטריפוגת ואקום (למשל, 20-30 דקות ב-RT, 1,000 × גרם), ולהשאיר טיפה קטנה. הרכיבו מחדש את הפפטידים ב-10 מיקרוליטר של 0.1% FA במים בדרגת LC-MS על ידי צנרת למעלה ולמטה בעדינות ומערבולת קצרה. סובב לזמן קצר כדי לאסוף נוזלים בתחתית הצינור לפני שתמשיך.
2. נתח 4 מיקרוליטר של דגימת הפפטיד המשוחזרת על ידי ננו-LC-MS/MS. הפרד את הפפטידים על עמודת פאזה הפוכה ארוזה עצמית (75 מיקרומטר ID × 2 ס"מ, שרף C18, גודל חלקיקים 3 מיקרומטר) הנשמר ב-50 מעלות צלזיוס. הכן את העמודה באמצעות פצצת לחץ²⁸ על ידי אריזת תרחיץ של שרף C18 (במתנול, 1:3 v/v) לתוך נימי סיליקה מותכים עם קצה ריסוס משולב של 10 מיקרומטר (360 מיקרומטר OD × 75 מיקרומטר ID × קצה 10 מיקרומטר). ממשק את העמודה באמצעות יינון ננו-ספריי לספקטרומטר מסה היברידי ברזולוציה גבוהה (מסוג Quadrupole-Orbitrap) התומך בתהליכי עבודה של DIA.
  הערה: מומלץ להשתמש באורך עמודה של 20 ס"מ מכיוון שהוא מספק הפרדה אופטימלית לתערובות פפטידים הנוצרות מפרוסות ג'ל SDS-PAGE.
3. שמור על העמודה האנליטית ב-50 מעלות צלזיוס באמצעות תנור עמודים או בלוק חימום כדי להבטיח שימור והפרדה עקביים של פפטידים. הבטח בקרת טמפרטורה יציבה לאורך כל הריצה, מכיוון שתנודות עלולות להשפיע על יכולת השחזור.
4. סילוק פפטידים באמצעות שיפוע ליניארי של 3-40% ACN ב-0.1% FA במשך 110 דקות, בקצב זרימה של 250 nL/min. שיפוע זה מספק הפרדת פפטידים יעילה לפני זיהוי טרשת נפוצה. זמן הניתוח הכולל, כולל שיווי משקל העמודות, הוא 120 דקות.
5. השג נתונים במצב DIA באמצעות MS ברזולוציה גבוהה, כפי שתואר קודם לכן²⁹.
  1. הגדר סריקות סקר MS1 מלאות לרכישה במצב פרופיל ברזולוציה של 120,000 (ב-m/z 200), על פני טווח סריקה של 300-1650 m/z. עקוב אחר כל סריקת MS1 עם פיצול MS2 של 30 חלונות קודמים עוקבים (364-1370 Th) באמצעות ערכת חלונות בידוד הזזה.
  2. בצע פיצול באמצעות אנרגיות התנגשות מנורמלות מדורגות של 25.5, 27.0 ו-30.0. מצב הטעינה המרבי המוגדר כברירת מחדל הוא 4. הגדר את המסה הראשונה הקבועה בסריקות MS/MS ל-200 Da, ורכוש ספקטרום MS2 ברזולוציה של 30,000.
  3. השתמש בהגדרת זמן הזרקה אוטומטית עבור MS2 וזמן הזרקה מרבי של 60 אלפיות השנייה עבור MS1. עבור סריקות MS1 ו-MS2, הגדר את יעד היונים (AGC) ל-3e6.
כימות יחסי של אינטראקטומות שנלכדו בזיקה
הערה: כדי לכמת חלבונים שזוהו בניתוחי DIA-MS של אינטראקטומות אפיכפרום שנלכדו בזיקה, השתמש בפלטפורמת תוכנה התומכת בתהליכי עבודה של DIA ומספקת כימות אמין המבוסס על עוצמת פפטיד או ספירות ספקטרליות. פרוטוקול זה השתמש ב-MaxQuant (למשל, גרסה 2.5.1.0) ובזרימת העבודה MaxDIA^20,29 שלו לזיהוי פפטיד/חלבון וכימות מבוסס עוצמה ללא תווית. החיפושים השתמשו באסטרטגיית פיתוי ברצף הפוך עם 1% FDR ברמות PSM/פפטיד וחלבון; ערכי "הפוך" ו"מזהם פוטנציאלי" סוננו לפני הביואינפורמטיקה. לא נעשה שימוש בספייק-אין; מוכנות המכשיר אומתה עם 250 ננוגרם של עיכול HeLa (ותערובת של 10 fmol 6-חלבונים לסירוגין) שעמדה בקריטריונים פנימיים של ID ויציבות RT.
1. נתח נתוני DIA-MS גולמיים עם פרמטרים עקביים בכל הדגימות. כלול עד שני מחשופים שהוחמצו והגדר שינויים כדלקמן: קבוע, קרבמידומתילציה של ציסטאין; משתנה, חמצון של מתיונין, ואצטילציה של החלבון N-terminus.
2. השתמש בספרייה ספקטרלית חזויה בסיליקו המבוססת על מסד הנתונים של חלבון אנושי UniProt (למשל, ~20,000 ערכים), כדי להבטיח שרצפי פיתוי ומזהמים נכללים להערכה מדויקת של שיעור גילוי שווא (FDR). ציין עיכול טריפטי אלא אם כן נעשה שימוש באנזים חלופי. ספרייה ספקטרלית אנושית מאומתת (המבוססת על מהדורת UniProt ב-18/06/2020, 20,956 ערכים) זמינה במאגר³⁰ של מכון מקס פלאנק לביוכימיה.
  הערה: כחלופה לזרימת עבודה זו עם ספריות חזויות, שלב 3.4 ממחיש עיבוד ללא ספריות, שהפיק זיהוי וכימות דומים על מערכי נתונים אלה.
3. כמת את שפע החלבון באמצעות ערכי עוצמה (לא עוצמות כימות ללא תווית [LFQ]), מכיוון שאלו מתאימים יותר לניתוחי רשת PPI במורד הזרם. ודא ש-LFQ אינו מסומן כדי למנוע תוצרי נורמליזציה, שעלולים לעוות נתוני העשרת זיקה. במקום זאת, השתמש בערכי עוצמה גולמיים הנגזרים מהתאמות ספקטרליות של פפטידים, המשקפים את חוזק האינטראקציה ולא ביטוי חלבון גלובלי. ליישם קריטריוני סינון מתאימים (למשל, מינימום פפטיד ייחודי אחד לכל קבוצת חלבונים) כדי לשפר את האמינות של זיהוי וכימות חלבונים. ייצא את טבלת עוצמת החלבון המתקבלת לניתוחים סטטיסטיים ומבוססי רשת עוקבים.
  הערה: בניגוד לתהליכי עבודה פרוטאומיים סטנדרטיים, שבהם ערכי LFQ עוזרים לנרמל להעמסת חלבון על פני ליזטים שלמים, כאן חלבונים מועשרים באמצעות לכידת זיקה של אפיכפרומים. שלב העשרה זה מציג שונות ביולוגית שנורמליזציה של LFQ עלולה לטשטש. לכן, ערכי עוצמה גולמיים עדיפים, מכיוון שהם משקפים טוב יותר את האינטראקציות הדיפרנציאליות של חלבון-אפיכפרום על פני תנאים ומשמרים את האות הדרוש לניתוח ברמת הרשת במורד הזרם (למשל, dfPPI). במחקרים קודמים שהשתמשו בחיפושים מבוססי קמע^16,18, נעשה שימוש גם בערכי ספירה ספקטרלית של MS/MS במקום עוצמות. בתהליכי עבודה של לכידת זיקה כמו זו, ספירות ספקטרליות משקפות את תדירות האינטראקציה ומתאימות היטב לזיהוי חלבונים הפועלים באינטראקציה דיפרנציאלית בין תנאים. בניגוד לערכי LFQ, ספירות MS/MS אינן מניחות נורמליזציה גלובלית על פני הפרוטאום, ושומרות על שונות משמעותית מבחינה ביולוגית משלב העשרת האפיכפרום.

3. זיהוי חלבון על ידי LC-MS/MS עם עיכול חלבון על חרוזים

עיכול על חרוזים
הערה: כדי להבטיח התאוששות חלבון אופטימלית ולמזער את אובדן הדגימה במהלך עיכול חלבון על חרוזים לניתוח טרשת נפוצה, חיוני להשתמש בצינורות מיקרוצנטריפוגה קושרים חלבון נמוך. צינורות אלו נועדו להפחית את ספיגת החלבון לדפנות הצינור, ובכך לשפר את התאוששות הדגימה. יש להכין את כל הריאגנטים המשמשים בסעיף זה באמצעות מים וכימיקלים בדרגת LC-MS. אם אתה שולח דגימות לליבת פרוטאומיקה, בדוק את המדיניות המקומית, מכיוון שמתקנים מסוימים עשויים לדרוש עיקור מסנן של כל המאגרים לפני השימוש.
1. הסר את כל שאריות PBS שעלולות להישאר בצינור משלב 1.4.6. השעו מחדש את החרוזים ב 80 מיקרוליטר של 2 מ 'אוריאה, שהוכנו טריים ב 50 מ"מ ABC, pH 8.5. הקפידו על ערבוב מלא על ידי פיפטינג או מערבולת קצרה.
  הערה: התאם את עוצמת הקול באופן פרופורציונלי על סמך כמות וסוג החרוזים. פרוטוקול זה ממוטב עבור 40 μL של תמיסת חרוזי PU.
2. הוסף DTT כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ"מ.
  הערה: הכן תמיסת DTT טרייה של 10 מ"מ מתמיסת מלאי DTT של 1 M במים בדרגת LC-MS מיד לפני השימוש, מכיוון ש-DTT נוטה לחמצון בתמיסה. הוסף את הנפח הנדרש ישירות לדגימה וערבב בעדינות על ידי פיפטינג.
3. יש לכסות את הצינור ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ניעור ב-1,100 סל"ד על שייקר מסלולי מחומם. אטום היטב את המכסים כדי למזער את האידוי.
4. הוסף IAA כדי להגיע לריכוז סופי של 3.67 מ"מ. דגירה בחושך ב-RT למשך 45 דקות עם רעידות ב-1,100 סל"ד.
  הערה: הכן מלאי IAA טרי של 10 מ"מ במים בדרגת LC-MS מיד לפני השימוש. הוסף את הנפח הנדרש לדגימה וערבב בעדינות על ידי פיפטינג.
5. הוסף DTT נוסף כדי להרוות IAA לא מגיב, ולהשיג ריכוז סופי של 3.67 מ"מ. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג.
  הערה: כיבוי IAA ללא תגובה מונע אלקילציה יתר, שעלולה לפגוע בפעילות הפרוטאז וביעילות העיכול. הכן DTT טרי וחשב את הנפח על סמך נפח הדגימה הנוכחי כדי להשיג את ריכוז היעד.
6. הוסף לדגימה 750 ננוגרם של 0.5 מ"ג/מ"ל של פרוטאז Lys-C בדרגת MS. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת עם טלטול ב-1,150 סל"ד.
  הערה: הכן את Lys-C על ידי המסה במים בדרגת LC-MS. אחסן את כמות האנזים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס והימנע מהפשרה מרובה בהקפאה.
7. הוסף 750 נ"ג של 0.5 מ"ג/מ"ל של טריפסין טריפסין טרי בדרגת ריצוף. דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-1,150 סל"ד. יש לדגור לא יותר מ-16-18 שעות כדי למנוע עיכול יתר ופירוק פפטידים.
8. למחרת, צנטריפוגה של הדגימה ב-1,000-5,000 × גרם למשך 1-5 דקות ב-RT והעבירו את הסופרנטנט על ידי פיפטינג לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי של 1.5 מ"ל. השליכו את החרוזים.
9. התאם את ה-pH של העיכול מתחת ל-3 על ידי הוספת 50% חומצה טריפלואורואצטית (TFA) טיפתית. אמת את ה-pH באמצעות רצועות מחוון pH.
  הערה: טווח ה-pH האופייני צריך להיות ~2.5-3.0, ויש להחמיץ את הדגימות לפני ההתפלה.
  זהירות: TFA הוא קורוזיבי ונדיף. הוסף מכסה אדים ולבש ציוד מגן אישי מתאים (PPE).
התפלת פפטידים
הערה: לצורך התפלה וניקוי פפטידים, השתמש בקצות פיפטה ארוזות C18 בקנה מידה קטן (כלומר, StageTips)³¹. הכן את C18 StageTips על ידי אריזת שלוש שכבות של חומר C18 (למשל, דיסקי מיצוי שלב מוצק C18) לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. ניתן להשתמש גם בעמודות ספין C18 מוכנות מראש וזמינות מסחרית. עקוב אחר פרוטוקול היצרן עבור מיזוג, טעינת דגימה ופליטת פפטידים. הביצועים (למשל, יעילות שימור, תפוקת התאוששות) עשויים להשתנות בין מכשירים תוצרת בית לעומת מכשירים מסחריים. יש לארוז היטב קצות פיפטה ארוזים בקנה מידה קטן C18 כדי למנוע זרימת מעקף.
1. מרכך את קצות הפיפטה הארוזים בקנה מידה קטן C18 ברצף עם: (1) 100 מיקרוליטר מתנול. צנטריפוגה בגובה 400 × גרם ולהשליך את הזרימה; (2) 100 מיקרוליטר של 70% ACN/0.1% TFA. צנטריפוגה בגובה 400 × גרם ולהשליך את הזרימה; (3) 100 מיקרוליטר של 0.1% TFA. צנטריפוגה ב -400 × גרם והשליכו את הזרימה. חזור על שלב זה פעמיים.
  הערה: מיזוג מבטיח הרטבה מלאה של שרף C18 ההידרופובי. עבור עמודי ספין C18 מוכנים מראש וזמינים מסחרית, ניתן להשתמש גם בסעפות ואקום. על המשתמשים לעיין בהוראות היצרן לקבלת המלצות טיפול ספציפיות.
2. טען את עיכול הפפטיד המחומצן על קצות הפיפטה הממוזגים בקנה מידה קטן ארוז C18 על ידי פיפטה איטית ישירות לתוך הקצה. צנטריפוגה בעוצמה של 300 × גרם כדי לאפשר לעיכול לעבור דרך השרף, ולהשליך את הזרימה. אם נפח הדגימה חורג מהקיבולת, טען במספר סיבובים.
  הערה: צנחו את העיכול ישירות על מצע השרף הארוז, הימנעו מבועות אוויר. אם אתה משתמש בקצות עם אחיזה נמוכה, גע בדופן הפנימית של קצות הפיפטות הארוזות בקנה מידה קטן C18 כדי לשחרר את הנוזל לאט ובאופן שווה.
3. פיפטה 100 מיקרוליטר של 0.1% FA ישירות לתוך קצה הפיפטה הארוז בקנה מידה קטן C18, מה שמבטיח שהתמיסה רוויה את חומר ה-C18 במלואו. צנטריפוגה במשקל 400 × גרם והשליכו את הזרימה. חזור על שלב זה פעמיים כדי להסיר מלחים וחומרים מפריעים.
  הערה: ודא שהנוזל זורם במלואו דרך חומר C18 לפני כל סיבוב. הימנע מלכידת בועות אוויר על ידי הוצאת תמיסת הכביסה באיטיות לאורך דופן קצה הפיפטה.
4. סילוק הפפטידים הקשורים על ידי פיפטינג של 50 מיקרוליטר של 70% ACN/0.1% FA לתוך קצה הפיפטה הארוז בקנה מידה קטן C18. צנטריפוגה במשקל של 300 × גרם ואוספים את הפליטה בצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי בעל קשירה נמוכה. חזור על שלב זה פעמיים כדי להבטיח שטיפה מלאה.
  הערה: ייתכן שיידרשו מספר סיבובים של צנטריפוגה כדי לשחזר את הפליטה במלואה. אם שאריות נוזל נשארות כלואות בבסיס הקצה, הקש בעדינות על קצה הפיפטה הארוז בקנה מידה קטן C18 או בצע סיבובים קצרים נוספים כדי לאסוף את הנפח הנותר. שלב משחרר ובדוק את הנפח הסופי לפני שתמשיך.
5. מקפיאים ומייבשים את הפפטידים המופשטים באמצעות רכז ואקום עד לייבוש. ודא שהמכסה ממוקם בצורה רופפת כדי לאפשר אוורור, אך הימנע מהתזות.
6. הרכיבו מחדש את הפפטידים המיובשים על ידי הוספת 12 מיקרוליטר של 0.1% FA במים בדרגת LC-MS ישירות לתחתית הצינור. מערבל בעדינות וסוניקציה של הצינורות כדי להמיס את הפפטידים במלואם.
  הערה: ודא שכל הגלולה או הסרט המיובש משוחזרים במלואם. פירוק מבוסס פיפטה מסתכן באובדן פפטידים עקב היצמדות למשטחי הקצה.
7. סוניקציה של הפפטידים המשוחזרים למשך 5 דקות בסוניקטור אמבטיה מלא במים קרים כדי להבטיח פירוק מוחלט ולמנוע התחממות יתר.
8. צנטריפוגה את הפפטידים ב-20,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. העבירו את הסופרנטנט הפפטידי לבקבוקון דגימה אוטומטית מתאים לטעינה על מערכת LC-MS. השתמש בבקבוקוני פוליפרופילן בנפח נמוך ואיכותי שנבדקו בכרומטוגרפיית גז (GC) עם מכסי מחיצה סיליקון/פוליטטרפלואורואתילן מלוכדים (PTFE) כדי למזער את אובדן הדגימה. סמן בקבוקונים בבירור עם מזהה לדוגמה וסדר הזרקה.
9. הערך את ריכוז הפפטידים באמצעות ספקטרופוטומטר ב-280 ננומטר. שימו לב שזה משוער ויכול להיות מושפע מתכולת שאריות ארומטיות או מזהמים. לחלופין, השתמש במבחני פפטיד קולורימטריים לכימות מדויק יותר.
פרמטרים של LC ו-MS
הערה: הפרמטרים הבאים של LC ו-MS מותאמים למערכת הננו-LC יחד עם ספקטרומטר המסה המשמש בפרוטוקול הנוכחי. עבור מערכות ננו-LC אחרות וספקטרומטרי מסה, יש להתאים את הפרמטרים בהתאם.
1. הכן את השלבים הניידים מדי שבוע כדי להבטיח תאימות LC-MS ולמזער את הזיהום: (1) שלב נייד א': הוסף 1 מ"ל של FA בדרגת LC-MS ל-1 ליטר מים בדרגת LC-MS, ו-(2) שלב נייד ב': הוסף 1 מ"ל של FA בדרגת LC-MS ל-1 ליטר של ACN בדרגת LC-MS.
  הערה: השתמש רק בממיסים וחומצה בדרגת LC-MS. הכן את שני השלבים בבקבוקי זכוכית נקיים ודגאס במידת הצורך על ידי מערכת ה-LC. השליכו שלבים שאינם בשימוש על בסיס שבועי כדי למנוע צמיחה או פירוק של חיידקים.
2. התקן עמוד נימי סיליקה התמזגה באורך 25 ס"מ ובקוטר פנימי של 75 מיקרומטר עמוס בחלקיקי 1.7 מיקרומטר C18 הפוך.
  הערה: טפל בעמודים בזהירות כדי למנוע הכנסת בועות אוויר או פגיעה בחומר האריזה. עקוב אחר הוראות היצרן להתקנה ואיזון עמודות.
3. התנה את העמודה על ידי הגדלה הדרגתית של קצב הזרימה מ-50 nL/min ל-300 nL/min באמצעות 3% Mobile Phase B.
  הערה: שלב זה מבטיח שהשלב הנייח נרטב כראוי ומאוזן לפני הזרקת הדגימה. עקוב אחר לחץ העמודה במהלך הגברת קצב הזרימה. עליות לחץ פתאומיות עשויות להצביע על בועות אוויר או סתימת עמודים. שיווי משקל יכול להיחשב שלם כאשר לחץ הבסיס מתייצב.
4. שמור על טמפרטורת העמודה על 50 מעלות צלזיוס כדי להבטיח ביצועים כרומטוגרפיים מיטביים.
5. הזרקת 100 ננוגרם של תקציר טריפטי של תאי HeLa כתקן בקרת איכות (QC) להערכת ביצועי המערכת.
  הערה: הזרקת QC זו משמשת כאמת מידה להערכת עקביות זמן שימור LC, רגישות MS וכיסוי פרוטאום על פני ריצות. השווה את ספירת זיהוי החלבון, זמן השחזור ועוצמת האות למערך נתוני QC ייחוס כדי לאשר את מוכנות המערכת לפני ניתוח דגימות ניסוי. השתמש בתקני תקציר HeLa מסחריים שהוכנו בריכוזים ידועים לשחזור בניסויים.
6. השתמש בפליטת שיפוע מ-2% ל-35% שלב B נייד במשך 90 דקות בקצב זרימה של 300 nL/min. השיפוע של 90 דקות מספק הפרדת פפטידים ברזולוציה גבוהה המתאימה לפרוטאומים מורכבים. לאחר השיפוע, החזק ב-95% משלב ב' הנייד למשך 7 דקות כדי לשטוף את העמודה.
  הערה: כלול שלב שיווי משקל מחדש (למשל, החזר ל-2% B למשך 10-15 דקות) לפני ההזרקה הבאה כדי להבטיח שחזור עמודות על פני ריצות. הימנע משינויים הדרגתיים פתאומיים, שעלולים להשפיע על יציבות זמן השמירה וצורת השיא.
7. בצע ניתוח MS באמצעות ספקטרומטר מסה המצויד במקור יינון אלקטרוספריי תואם ננו-זרימה (למשל, בסגנון CaptiveSpray).
  הערה: מקור היונים CaptiveSpray מספק אלקטרוספריי יציב בקצבי ננו-זרימה נמוכים, ומשפר את יעילות היינון והרגישות. עבור מעבדות המשתמשות בספקטרומטר מסה חלופי התאימו את פרמטרי הרכישה והיינון בהתאם. הקפידו על כוונון וכיול נאותים לפני הניתוח כדי לשמור על דיוק ורזולוציה. מקם את פולט הריסוס כראוי ועקוב אחר יציבות הריסוס במהלך הריצה כדי למנוע נשירת אותות.
8. השתמש בשיטת diaPASEF לרכישה בלתי תלויה בנתונים³². למשתמשים שאינם מכירים את diaPASEF, עיין בתיעוד הטכני של היצרן או בפרוטוקולים עדכניים המתארים תהליכי עבודה של ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים (TIMS)-DIA³³ כדי לבצע אופטימיזציה עבור סוגי דגימות או אורכי שיפוע שונים.
  הערה: diaPASEF משלב TIMS עם DIA כדי להגביר את מהירות הריצוף והרגישות על ידי יישור יוני קודמן ושבר בממד הניידות³⁴. ודא שהתקן ה-TIMS מכויל ומסונכרן כהלכה עם הקוואדרופוט כדי למנוע חוסר יישור של ניידות יונים וחלונות מסה.
9. השתמש בהגדרות המכשיר הבאות: (1) טווח מסה: 100 עד 1700 מ'/ז; (2) טווח ניידות יונים: 0.60-1.60 V·s/cm²; (3) אנרגיית התנגשות: 20-59 eV, רמול; (4) זמן רמפה: 100 אלפיות השנייה; (5) זמן צבירה: 100 אלפיות השנייה; (6) טווח מסה עבור diaPASEF: 400-1201 Da; (7) רוחב חלון המוני: 26 Da עם חפיפה של 1 Da; (8) מספר צעדי מסה למחזור: 32; (9) זמן מחזור: ~ 1.8 שניות
  הערה: הגדרות אלה ממוטבות כדי לאזן את עומק הכיסוי ומהירות הסריקה. ייתכן שיידרשו התאמות קלות (למשל, רוחב חלון או מספר שלבים) בהתאם למורכבות הדגימה, אורך השיפוע וביצועי מערכת LC-MS. השגת זיהוי של למעלה מ-7,500 חלבונים לעיכול HeLa מצביעה על ביצועי מערכת אופטימליים. מספר הזיהויים עשוי להשתנות בהתאם למכשיר ויש להעריך אותו בהתאם.
10. טען 300-400 ננוגרם של דגימת פפטיד בכל הזרקה כדי למנוע עומס יתר על העמודה האנליטית. עומס יתר יכול להוביל להרחבת שיא, דיכוי יונים ויכולת שחזור מופחתת. אשר את ריכוז הפפטיד לפני ההזרקה באמצעות ספקטרופוטומטר או בדיקת פפטיד קולורימטרי כדי למנוע שונות בין ריצות.
11. הפעל זריקות ריקות בין קבוצות הדגימה כדי למנוע העברה. השתמש ב-100% שלב A נייד (מים עם 0.1% FA) כריק ההזרקה. זה שוטף שאריות פפטידים מהעמודה ומפחית את הזיהום בין ריצות. עקוב אחר יוני הבסיס והרקע כדי לאשר ניקוי נאות.
ניתוח נתוני DIA
1. השתמש בתוכנה מתאימה התומכת בניתוח נתונים באמצעות directDIA workflow³⁵ ועיבוד ללא ספרייה של נתוני פרוטאומיקה של DIA. בצע זיהוי וכימות חלבונים על סמך מסד נתונים UniProt FASTA³⁶, עם פרמטרי חיפוש סטנדרטיים והגדרות כימות ברירת מחדל.
  הערה: כל הפרמטרים, כולל ספציפיות האנזים, הגדרות שינוי, ספי FDR ותפוקות לאחר הניתוח, מפורטים בקובץ המשלים 1. ניתן להשתמש גם בפלטפורמות ניתוח DIA חלופיות כגון DIA-NN³⁷ אם הן תומכות בזרימות עבודה ויציאות דומות.
2. הפעל directDIA ללא ספרייה עם חתכי q-value המתאימים ל-1% FDR ברמת המבשר, הפפטיד וקבוצת החלבון; לא לכלול זיהויי פיתוי לפני ניתוח במורד הזרם.
  הערה: לא נוספו תקני iRT; הביצועים נמדדו עם ריצות תקציר HeLa כנגד קריטריונים מוגדרים מראש של זיהוי ויציבות זמן שימור.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר הביצוע המוצלח של הפרוטוקול, על המשתמשים להשיג מערכי נתוני אינטראקציה באיכות גבוהה המתאימים לניתוח dfPPI במורד הזרם. זיהוי החלבון מבוצע מנתוני DIA ב-1% FDR (PSM ורמות חלבון), וכימות משתמש בעוצמות גולמיות או בספירות ספקטרליות של MS/MS (לא LFQ). חתימות QC צפויות כוללות: אשכולות הדוקים של שכפולים טכניים על ידי PCA, CVs חציוניים של מבשר/חלבון של כ-10-12%, אשכולות היררכיים המונעים על ידי מקור ביולוגי ולא שכפול, והעשרה חזקה ברמת המסלול ב-g:Profiler/Reactome.

יצירת בדיקה PU-bead ואימות פעילות לפני השימוש

חרוזי PU מוכנים על ידי צימוד אנלוגי מולקולה קטנה קושר אפיכפרום לאגרוז המופעל על ידי NHS, כפי שתואר קודם לכן²⁵. חבילת שרף סטנדרטית של 25 מ"ל מניבה ~25 מ"ל של חרוזי PU המאוחסנים כתרחיץ 1:1 באיזופרופנול. יש לשים לתוך צינורות בעלי קשירה נמוכה ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור (למשל, לעטוף בנייר אלומיניום). בתנאים אלה, אצווה נשארת יציבה למשך ≥12 חודשים. לפני השימוש, הסר איזופרופנול וחרוזי איזון במאגר קשירה מקורי (שלב 1.3). כל אצווה מוסמכת בסינתזה ולאחר מכן מעת לעת באמצעות שתי בדיקות (איור 2): (i) משיכות תואמות לביצוע ספציפיות ביולוגית מליזאט גבוה אפיכפרום (למשל, MDA-MB-468) וליזאט נמוך אפיכפרום (למשל, ASPC1) בתנאים זהים (40 מיקרוליטר תמיסת חרוזים עם 250 מיקרוגרם חלבון כולל; 3 שעות ב-4 מעלות צלזיוס; שטיפות מקוריות), אלוטה/דנטורציה ואימונובלוט עבור HSP90, HSC70 ו-HOP. קבלה: העשרה חזקה במדגם הגבוה של אפיכפרום עם אות מינימלי במדגם הנמוך; יחסי עוצמת פס דומים למגרש ייחוס (±20-30%). (ii) לכידות מקבילות המופעלות על ידי פרופיל מטען גלובלי מליזט גבוה אפיכפרום עם חרוזי PU לעומת חרוזי בקרה אינרטיים תואמים, עומסים נפחי פליטה שווים על SDS-PAGE וכתם קומאסי. קבלה: חרוזי PU מראים מטען עשיר במשקל מולקולרי גבוה עם רקע מינימלי בנתיב חרוזי הבקרה. אצווה של 25 מ"ל תומכת ב~600 לכידות ב-40 מיקרוליטר לדגימה; לפרוש הרבה אם הספציפיות או פרופיל המטען נופלים מחוץ לקבלה לאחר שטיפה מחדש/שיווי משקל מחדש.

תוצאות מייצגות של פרוטוקולי in-gel ו-on-bead

בהשוואת פיילוט ראש בראש על תאי MDA-MB-468 גבוהים באפיכפרום, זרימות עבודה בג'ל ועל חרוזים יצרו אינטראקטומות תואמות מאוד: 4,616 מתוך 6,333 חלבונים (73%) שותפו ברמת קבוצת החלבון, כאשר 1,275 (20%) זוהו רק על ידי ג'ל ו-442 (7%) רק על ידי חרוז. ההסכמה ברמת המסלול הייתה גבוהה עוד יותר: מבין 860 מונחי Reactome, 727 (85%) היו נפוצים, כאשר 81 (9%) ייחודיים ל-in-gel ו-52 (6%) ייחודיים ל-on-bead. עוצמות החלבון החציוניות היו גבוהות ב~3× עבור ג'ל מאשר על חרוז, בהתאם לריכוז פליטת הג'ל, אך זה לא השפיע באופן מהותי על קונקורדנציה של המסלול.

דוגמה בקנה מידה קוהורטי וחתימות QC

כדוגמה, ניתחנו שתים עשרה דגימות ביולוגיות (איור 3). ארבע דגימות נפלטו ועובדו על ידי עיכול בתוך הג'ל; שמונה דגימות עברו טיהור זיקה של קומפלקסים אפיכפרום ואחריו עיכול על חרוזים וננו-LC-MS/MS בשכפול טכני. חתימות QC צפויות נצפו: אשכולות הדוקים של שכפולים טכניים על ידי PCA, CVs חציוניים של מבשר/חלבון של ~10-12%, אשכולות היררכיים המונעים על ידי מקור ביולוגי ולא שכפול, והעשרה חזקה ברמת המסלול ב-g:Profiler/Reactome. תוצאות אלו ממחישות יכולת שחזור על פני רכיבי זרימת עבודה, זיהוי רחב של חלבונים המעורבים באפיכפרום ופרשנות פונקציונלית ברורה של אינטראקטורים דיפרנציאליים ברמת המסלול. העשרת המסלולים שנגזרו משני זרימות העבודה תאמו את תפוקות ה-dfPPI שפורסמו עבור קו זה, שאומתו על ידי מספר בדיקות אורתוגונליות ביוכימיות ופונקציונליות¹⁷.

איכות חומר הקלט והעיכול

ג'ל SDS-PAGE מייצג מוכתם בקומאסי מוצג עבור ארבע מהדגימות שעובדו על ידי עיכול בתוך הג'ל (איור 3A). הג'ל ממחיש לכידת חלבון הניתנת לשחזור ופיזור עקבי של רצועות על פני נתיבים, ומאשר העשרה מוצלחת של קומפלקסי חלבון מליזטים מקומיים לפני ספקטרומטריית מסה. פרופילי אינטראקטום מפורקים אלה מדגימים כי שלב לכידת הזיקה מניב קלט חלבון מספיק ועקבי לניתוח MS במורד הזרם.

האינטראקטומים שנלכדו מראים כיסוי חלבון רחב על פני משקלים מולקולריים, המשקף העשרה מוצלחת של מכלולי חלבון מליזטים מקומיים. באופן קריטי, התאוששות זו אינה מוגבלת לחלבונים בשפע אלא כוללת אינטראקטורים בשפע נמוך יותר, המספקים את המורכבות והעומק הנדרשים לניתוח ברמת המערכות.

בקרות וספציפיות בקנה מידה גדול

בתהליך עבודה זה, אנו משתמשים בחרוזי בקרה רק לניקוי מקדים (ראה שלבים 1.3 ו-1.4); איננו מבצעים לכידות השוואתיות שגרתיות של "בדיקה אינרטית" על כל דגימה ביולוגית. עבור קבוצות קליניות גדולות, לכידות אינרטיות צורכות חומר יקר אך מוסיפות מעט ערך פרשני ל-dfPPI מכיוון שסטטיסטיקות במורד הזרם פועלות ברמת הרשת/מסלול, לא ברמה של חלבון בודד כלשהו. מזהמים אקראיים או דביקים בשרף אינם מופיעים בצורה מתואמת על פני חברים באותו מסלול ולכן אינם שורדים מבחני העשרה ברמת המסלול או מסנני עקביות ברמת העוקבה. בפועל, הספציפיות מובטחת על ידי (i) ניקוי מקדים, (ii) שחזור שכפול הדוק (PCA/CV), ו-(iii) יציבות מסלול על פני ספים ודגימה מחדש. מבחינה היסטורית, הערכנו ניסויי בלוק של לכידה אינרטית ומתחרה מסיס (PU-H71) ומצאנו שהם לא שינו את תוצאות מסלול dfPPI 16,17,21, תוך צריכת חומר קליני שאין לו תחליף; לפיכך, אנו שומרים אותם לאימות טייס בלבד. עבור קבוצות המעדיפות בדיקות מפורשות ברמת הריצה, נציין ששתי האפשרויות תואמות לפרוטוקול אך אינן נדרשות לניתוחי dfPPI בקנה מידה קבוצתי.

שכפול מספר

הסקת נתיב ב-dfPPI מבוססת על קבוצה ואינה דורשת מספר שכפול קבוע. עם רכישות חזקות, דגימה בודדת לכל מצב יכולה להניב קריאות מסלול גישוש. לניתוחים מאשרים, אנו ממליצים על ≥3 שכפולים ביולוגיים לכל מצב עבור תאים מתורבתים (עם זריקות LC-MS/MS כפולות כאשר הדבר אפשרי), ו-Ns מתאים לקבוצה עבור רקמה אנושית (בדרך כלל ≥5-10 לקבוצה לגילוי, גדול יותר אם מרובד על ידי משתנים משותפים). אנו מעריכים את היציבות על ידי אשכולות שכפול (PCA), CV מבשר חציוני (יעד ~10-15%), ואתחול/דגימה מחדש של תוצאות העשרה.

שחזור טכני בין הפעלות

יכולת השחזור הטכנית הוערכה באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) (איור 3B) של נתוני עוצמת פפטידים מדגימות מעוכלות על חרוזים (שמונה מוחות של עכברים, רצים בכפולות). שכפולים מקובצים בחוזקה עבור כל דגימה ביולוגית, בעוד שדגימות שונות מופרדות בצורה נקייה לאורך שני המרכיבים העיקריים הראשונים. שני המרכיבים העיקריים הראשונים הסבירו 28.6% ו-22.0% מהשונות הכוללת, בהתאמה, וחילקו דגימות על פי הבדלים ביולוגיים ולא על פי רעש טכני. מבנה זה משקף עקביות אנליטית גבוהה ומאשר שהשיטה שומרת על הבדלים רלוונטיים מבחינה ביולוגית, וזה קריטי כדי לאפשר ל-dfPPI לזהות חיווט מחדש של רשת ספציפית למצב.

עקביות הזיהוי בין דגימות

התפלגות מקדם השונות (CV) עבור עוצמות יונים קודמות מדגימות כי הרוב המכריע של התכונות נופלות מתחת ל-20% CV, כאשר הערכים החציוניים נעים בין 9.7% ל-11.9% על פני תנאים (איור 3C). תוצאות אלה מאשרות זיהוי עקבי של טרשת נפוצה והתאוששות פפטידים על פני שכפולים.

טווח דינמי וכיסוי פרוטאום

אשכולות היררכיים של ערכי שפע חלבון שעברו טרנספורמציה (איור 3D) הראו הפרדה חזקה של דגימות ושימור שונות בין דגימות, תוך שיקוף הטווח הדינמי הרחב שנלכד בריצות MS. עוצמות החלבון השתרעו מאינטראקטורים בשפע נמוך לקבוצות חלבון מועשרות מאוד, כפי שמוצג על ידי השיפוע הכחול לצהוב. הנתונים מאשרים כי הפרוטוקול מאפשר זיהוי של מכלולי חלבונים ואינטראקטורים מגוונים, הלוכדים רכיבי ליבה ורכיבים היקפיים כאחד.

פרשנות פונקציונלית באמצעות dfPPI

כדי לתמוך בפרשנות ובשחזור, אנו מספקים שני משאבים משלימים לניתוח מערכי נתונים של dfPPI: (i) יישום אינטרנט מבריק אינטראקטיבי (https://epichaperomics.mskcc.org/ עודכן ל-https://dfppi.mskcc.org) ו-(ii) תהליכי עבודה פתוחים וניתנים לסקריפט וקבצי הפעלה של Cytoscape ששוחררו עם מחקרי dfPPI קודמים (GitHub/Zenodo)38,39,40,41. האפליקציה קולטת טבלאות עוצמה גולמית או ספירת ספקטרלים של MS/MS, מבצעת בקרת איכות (אשכולות שכפול, בדיקות ערך חסר), טיפול אופציונלי ברעש/אצווה (רגרסיה משתנה), מזהה חלבונים מעורבים באופן דיפרנציאלי ומספקת קריאות מסלול/רשת באמצעות תרשימים אינטראקטיביים ודוחות להורדה - ללא צורך בקידוד.

dfPPI מתייחס לעוצמות שנמדדו או לספירות ספקטרליות כפרוקסי ל"מעורבות אפיכפרום". המשתמשים בוחרים במודל חיבוריות דיפרנציאלית (DC) הנע בין מבחן t דו-זנבי פשוט (ברירת מחדל) למודלים ליניאריים מודעים למשתנים; ניתן לדלג גם על שלב DC. לאחר DC, משתמשים מגדירים סף שינוי קיפול וערך p (ברירת המחדל משקפת עבודת dfPPI קודמת; למשל, FC > 1.0, p נומינלי ≤ 0.25) כדי להעביר מועמדים להעשרה. שני מנועי העשרה זמינים: GSEA מבוסס דירוג (על סטטיסטיקה חתומה) וייצוג יתר (היפר-גיאומטרי) באמצעות g:Profiler עם תיקון בדיקות מרובות. להקשר ממוקד מלווה, הצינור מספק גם ניתוח העשרה אינטראקטום (iEA) כדי לבדוק אם אינטראקציות ישירות של חלבוני פיגום מלווה מיוצגים יתר על המידה בקרב חלבונים המעורבים באופן דיפרנציאלי. הרשת מציגה צמתים/קצוות משקללים לפי גודל אפקט ו/או תמיכה סטטיסטית, מה שמאפשר הדמיה של חיווט מחדש מתואם במקום השפעות של חלבון יחיד. עבור משתמשים המעדיפים זרימות עבודה מתוסרטות, קוד R הבסיסי וקבצי ההפעלה של Cytoscape המשמשים לבניית מפות ודמויות רשת זמינים לציבור (למשל, GitHub/Zenodo)38,39,40,41 עם הפרסומים המשויכים 17,18,19,20 וניתן להפעיל אותם באופן מקומי או להתאים אותם למערכי נתונים חדשים.

חיתוך מתירני (שינוי קיפול > 1.0; p נומינלי ≤ 0.25) מומלץ כדי לשמור על אותות מצב אינטראקציה שהוצגו על ידי העשרת זיקה. לאחר מכן אנו מעבירים את הבקרה הסטטיסטית לרמת המסלול: חלבונים מועמדים נבדקים להעשרה על פני אונטולוגיות אוצרות (למשל, GO, Reactome) באמצעות g:Profiler, וערכי p של מסלול מותאמים לבדיקות מרובות קובעים את המובהקות והדירוג. תכנון זה משקף את המטרה של dfPPI - לזהות חיווט מחדש מתואם של הרשת, לא ביטוי דיפרנציאלי של חלבון יחיד - ונמנע מנורמליזציה רחבה של פרוטאום שיכולה לטשטש אותות העשרה במערכי נתונים נפתחים. כפי שהוכח במחקרי dfPPI קודמים^17,20, סף מקל יותר ברמת החלבון מניב קריאות מסלול יציבות ורלוונטיות למחלה, בעוד שניתן להשתמש במודלים אחרים (למשל, מודלים ליניאריים עם התכווצות בייס אמפירית) כאשר שונות או משתנים משותפים מצדיקים זאת, מבלי לשנות את המסקנה הממוקדת במסלול הליבה.

לכידת זיקה מעשירה בהכרח חלבונים "דביקים" (למשל, קרטינים, חלבוני שלד ציטו, חלבונים ריבוזומליים), וחרוזי PU עשויים גם ללכוד אינטראקטורים כלליים של מלווים. ב-dfPPI, אלה אינם מניעים את הביולוגיה מכמה סיבות. ראשית, הניקוי המוקדם והשטיפות המחמירות מסירים את רוב הקלסרים הלא ספציפיים. שנית, קלסרים גנריים, כולל אינטראקטורים רבים של מלווים, מראים שינויי קיפול קרוב ל-1.0 על פני תנאים ו/או זיהוי לא עקבי ובכך נכשלים במסכי FC/p-value. שלישית, העשרת המסלול מבוססת על סט ומודעת רקע: המשמעות מחושבת כנגד הפרוטאום שזוהה ספציפי לניסוי, ודורשת מספר חברים מאותו מסלול כדי להשתנות. מזהמים אקראיים או בעלי שפע גבוה מפוזרים על פני מונחים רבים ולכן אינם יוצרים העשרה קוהרנטית ומשמעותית ל-FDR. שום חלבון יחיד - מזהם או אחר - לא יכול "לבצע" קריאת מסלול. רביעית, dfPPI מפרש קוהרנטיות ברמת הרשת, לא חלבונים בודדים; קריאות מסלול חייבות לשרוד תיקון בדיקות מרובות (למשל, ערכי p מותאמים של g:Profiler), גדלים מינימליים של ערכת גנים ועקביות שכפול. יחד עם פרקלירים אינרטיים תואמים וסינון מזהמים נפוצים, מסגרת זו הופכת את dfPPI לחזק לרקע: גם אם קיימים מאות חלבונים לא אינפורמטיביים, הם אינם משנים את דירוג המסלול מכיוון שההעשרה תלויה במספר החלבונים התואמים בתוך המסלול, ולא באורך הכולל של רשימת החלבונים. יתר על כן, כל מחקר dfPPI שפורסם עד כה אישר תחזיות ברמת המסלול והרשת עם אימות ניסיוני נרחב (למשל, ביוכימיה ממוקדת, קריאות איתות, הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות)16,17,18,19,20, מה שמדגים שתפוקות dfPPI אינן רק רשימות חלבונים רועשות אלא מפות הניתנות לשחזור של תפקוד לקוי של רשת PPI רלוונטית למחלה.

כדי להעריך את הנוף הפונקציונלי שנלכד על ידי מערך הנתונים של dfPPI מאיור 3D, ביצענו ניתוח העשרה באמצעות g:Profiler⁴² (איור 3E). התוצאות מדגימות כיסוי הערות חזק בכל האונטולוגיות הפונקציונליות העיקריות, כולל תהליך ביולוגי של אונטולוגיה גנטית (GO-BP), תפקוד מולקולרי (GO-MF) ורכיב תאי (GO-CC), כמו גם משאבי מסלול שנאספו כגון Reactome, KEGG ו-WikiPathways. ניתוח מייצג זה ממחיש חוזק מרכזי של גישת dfPPI: יכולתה לחשוף אסוציאציות מסלולים משמעותיות מבחינה ביולוגית על פני סוגי הערות מגוונים, אפילו מגדלי מדגם קטנים יחסית. הכיסוי הרחב של Reactome שנצפה כאן משקף ככל הנראה את העובדה ש-dfPPI מבוסס על חיווט מחדש ברמת האינטראקציה של רשתות חלבונים הממופות ישירות על תהליכים מרובי רכיבים ומפלי איתות, המיוצגים היטב במבנה של Reactome. מכיוון ש-dfPPI ממנף שינויים בקישוריות ולא בביטוי, הוא מתאים במיוחד לזיהוי שינויים פונקציונליים ברמת המערכת שעלולים להחמיץ על ידי טרנסקריפטומיקה או פרוטאומיקה בשפע בלבד. ממצא זה עולה בקנה אחד עם עבודות אחרות שבהן Reactome הניב באופן עקבי את ההעשרה הקוהרנטית והרלוונטית ביותר למחלה ממערכות חלבונים שמקורן ב-dfPPI 14,15,16,17,18,20,21.

Reactome מאורגן סביב תהליכים וקומפלקסים מרובי חלבונים (מפלי העברת אותות, מודולי מחזור תאים, מכלולים מטבוליים). מכיוון ש-dfPPI מעשיר אינטראקטורים המעורבים באפיכפרום - כלומר, קבוצות של חלבונים המגויסים מבחינה תפקודית לפיגומי מחלה - הפלט שלו מכיל באופן טבעי מודולי מסלול מלוכדים ולא פגיעות מבודדות. לכידה מתואמת זו מניבה כיסוי Reactome רחב ומשמעותי על פני תת-מסלולים והיררכיות קשורים. לעומת זאת, אומיקס ממוקד שפע (טרנסקריפטומיקה; פרוטאומיקה גלובלית) מדווח על שינויי ביטוי, לא על מצבי אינטראקציה; AP-MS עם פיתיון יחיד או תיוג קרבה מספקים לשכונות מקומיות סביב פיתיון מהונדס אחד בכל פעם; וקישור-צולב/קו-פרקציה מספקים לעתים קרובות חיבוריות דלילה. אף אחד מאלה, לבדו, לא מייצר באופן שגרתי את הקבוצות שנבחרו ברמת ההקשר ש-dfPPI מחזיר מלכידה אנדוגנית אחת בתאים או ברקמות. התוצאה היא העשרת מסלול שהיא גם רחבה (ענפי Reactome מרובים נדלקים) וגם קוהרנטית מבחינה מכנית (חלבונים נעים יחד מכיוון שהאינטראקציות שלהם - לא רק הכמויות שלהם - מחווטות מחדש על ידי אפיכפרומים). עם זאת, נציין כי dfPPI הוא משלים, לא תחליף: לכל שיטת אינטראקטומיקה יש חוזקות ומגבלות שונות, והבחירה האופטימלית (או השילוב) צריכה להיות מונעת על ידי השאלה הביולוגית, אילוצי הדגימה והרזולוציה הנדרשת.

יחד, תוצאות אלו מאשרות כי הפרוטוקול מניב מערכי נתונים אינפורמטיביים ביולוגיים הניתנים לשחזור שניתן להשתמש בהם כדי לחשוף שיפוץ אינטראקטום דיפרנציאלי על פני מצבי מחלה או הפרעות ניסיוניות. פלט ה-dfPPI מתאים היטב לאינטגרציה עם מסגרות העשרת מסלולים ומאפשר מיפוי של אירועי חיווט מחדש פונקציונליים שאינם ניתנים לזיהוי בשיטות סטנדרטיות מבוססות שפע.

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של פלטפורמת dfPPI. (A) פלטפורמת dfPPI (אינטראקטום חלבון-חלבון לא מתפקד) מאפשרת זיהוי של תפקודים לקויים של רשת PPI ספציפית למחלה באמצעות זרימת עבודה כימו-פרוטאומית. סעיף 1 כולל הכנת דגימה ולכידת אינטראקטום באמצעות בדיקות כימיות מכוונות אפיכפרום המשותקות על מטריצות זיקה (למשל, חרוזי PU). סעיפים 2 ו-3 מתארים שני זרימות עבודה תואמות לעיכול - על חרוז או בתוך ג'ל - ואחריהם LC-MS/MS ללא תוויות לזיהוי אינטראקטום. ניתוחים חישוביים, כולל מודלים סטטיסטיים והעשרת מסלול, מבוצעים באמצעות צינור הביואינפורמטיקה dfPPI, שאינו מכוסה בפרוטוקול זה אך זמין בחינם ב-https://epichaperomics.mskcc.org/. (ב) עקרון ה-dfPPI. בהקשרים רלוונטיים למחלה, אפיכפרומים אנדוגניים יוצרים פיגומים על-מולקולריים המארגנים מחדש רשתות PPI. בדיקות כימיות מכוונות אפיכפרום (למשל, חרוזי PU או שווה ערך) לוכדות את הפיגומים הללו יחד עם האינטראקטורים הקשורים שלהם ישירות מתאים שלמים או מליזטים מקומיים, ומניבים משיכה מרובת פיתיון בניסוי יחיד. ניתן לעבד בקרות תואמות (למשל, בקרת חרוזים אינרטיים ו/או תחרות עם בדיקה חופשית) במקביל. חומר שנלכד נפלט ומתעכל על חרוז או בתוך ג'ל, מנותח על ידי LC-MS/MS, וחלבונים מכומתים (עוצמה או ספירות ספקטרליות MS/MS). האינטראקטום המתקבל משמש לחישוב אינטראקטורים דיפרנציאליים בין תנאים ולביצוע העשרת מסלול/רשת, וחושף תפקוד לקוי של PPI ספציפי להקשר ברמת המערכות. זרימת העבודה אינה דורשת תיוג גנטי או ביטוי יתר, תואמת הן לתאים והן לרקמות, ומשתנה למחקרי עוקבה. לעומת זאת, טיהור-טיהור-MS מסורתי מתמקד בפיתיון מתויג אחד בכל פעם, מייצר שכונה מקומית לכל מבנה ובדרך כלל דורש מבנים/ריצות רבים כדי לדגום רשת. לעומת זאת, dfPPI משתמש באפיכפרומים אנדוגניים כפיתיון, לוכד PPIs לא מתפקדים רבים בו זמנית מהמערכת המקורית, מה שמאיץ את הגילוי של חיווט מחדש של רשת ספציפית למחלה ומספק קריאות ברמת המסלול מלכידה בודדת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אימות אצווה של חרוזי PU וספציפיות לכידה. (A) ספציפיות ביולוגית ועקביות אצווה למנה. תאי MDA-MB-468 (אפיכפרום גבוה) ו-ASPC1 (אפיכפרום נמוך) עברו ליזה במאגר טבעי (20 מ"מ טריס, pH 7.4; 20 מ"מ KCl; 5 מ"מ MgCl₂; 0.01% NP-40; מעכבי פרוטאז/פוספטאז). עבור כל לכידה, 40 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי PU הודגרו עם 250 מיקרוגרם של חלבון כולל (1 מיקרוגרם/מיקרוליטר) למשך 3 שעות ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב. חרוזים נשטפו במאגר מקומי; קומפלקסים עברו דנטורציה/נפלט ב~100 מיקרוליטר של מאגר דגימת SDS. 5-10 מיקרוליטר מכל פליטה נפתרה על ידי SDS-PAGE ובוצעה עבור HSP90, HSC70 ו-HOP. ליזטים קלט מוצגים לעיון. שני חבילות חרוזי PU (אצווה 1, טרי; אצווה 2, מיושנת) מניבה העשרה חזקה ב-MDA-MB-468 ואות מינימלי ב-ASPC1, מה שמדגים ספציפיות שמורה ועקביות אצונה. (ב) מטען גלובלי לעומת חרוזי בקרה. ליזטים MDA-MB-468 עובדו כמו ב-(A) עם חרוזי PU או חרוזי בקרה תואמים. ~20 מיקרוליטר מכל אלואט נטען, מופרד על ידי SDS-PAGE, וצבוע בקומאסי. חרוזי PU משחזרים מטען מורכב ועתיר MW האופייני למכלולים הקשורים לאפיכפרום, בעוד שחרוזי בקרה מראים רקע מינימלי. מסומנים סמני משקל מולקולרי (kDa). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תוצאות מייצגות מלכידת זיקה של dfPPI, זיהוי אינטראקטום וניתוחים ביואינפורמטיים. (A) ג'ל SDS-PAGE מוכתם בקומאסי של חלבונים שנפלטו מלכידת זיקה של חרוזי PU של אינטראקטומות הקשורות לאפיכפרום מארבע דגימות מוח אנושיות מייצגות (PT1-PT4). מכלולי חלבונים הקשורים לחרוזים עברו דנטורציה על ידי רתיחה במאגר דגימת SDS, נפתרו על ידי SDS-PAGE, ונצבעו כדי להעריך את התאוששות האינטראקטום על פני משקלים מולקולריים. כל דגימה הועמסה לנתיב נפרד, עם נתיב ריק בין הדגימות כדי למזער זיהום צולב; אות קלוש שנצפה מדי פעם בנתיבים הריקים הללו משקף זליגה קלה של דגימה במהלך אלקטרופורזה. ג'לים אלה מייצגים דגימות שהוגשו למתקן MS, שם כל נתיב נחתך לחמש פרוסות לעיכול בתוך הג'ל וזיהוי חלבון על ידי MS. (B) ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) של עוצמות חלבון שזוהו מאינטראקטומות אפיכפרום מעוכלות על חרוזים משמונה דגימות מוח מייצגות של עכברים (מופעלות בשכפול) חושף אשכולות הדוקים של שכפולים טכניים והפרדה ביולוגית ברורה לאורך PC1 ו-PC2. זה מאשר יכולת שחזור טכנית גבוהה ושונות ביולוגית מספקת לניתוח dfPPI חזק. מבנה הנתונים מדגים כי הבדלים ברמת האינטראקציה - לא חפצים טכניים - מניעים הפרדת דגימה, ומספקים בסיס חזק למידול אינטראקטום דיפרנציאלי במורד הזרם ללא צורך בנורמליזציה מלאכותית. (C) התפלגות מקדם השונות (CV) עבור עוצמות יונים קודמות על פני שמונה קבוצות המדגם מראות שונות נמוכה באופן עקבי, כאשר CVs חציוניים נעים בין 9.7% ל-11.9% (מסומנים על ידי קווים מקווקווים אנכיים). קורות חיים נמוכים אלה מדגישים את יכולת השחזור והחוסן של צינור הזיהוי והכימות של טרשת נפוצה. העקביות תומכת בשימוש בעוצמה גולמית או בערכי MS/MS כקלטים אמינים לניתוח dfPPI, כאשר שונות בעוצמת האינטראקציה - לא ביטוי חלבון גלובלי - היא האות הביולוגי המעניין. (D) מפת חום היררכית של אשכולות של ערכי עוצמת חלבון שעברו טרנספורמציה של log₂ בכל הדגימות (עם כפילויות טכניות מוצגות). הדגימות מתקבצות לפי מקור ביולוגי ולא משתכפלות, מה שמאשר לכידה חזקה של אינטראקטומים הקשורים לאפיכפרום ושימור השונות הרלוונטית מבחינה ביולוגית. טווח דינמי רחב וזיהוי עקבי על פני חלבונים תומכים עוד יותר באיכות מערך הנתונים לניתוח dfPPI. סרגל קנה המידה מייצג ערכי עוצמת חלבון שעברו טרנספורמציה של לוג₂, הנעים בין 2 (כחול, שפע נמוך) ל-14 (צהוב, שפע גבוה). (E) תרשים מנהטן של ניתוח העשרת מסלול המבוצע על חלבונים בעלי אינטראקציה דיפרנציאלית שזוהו על ידי dfPPI. ההעשרה בוצעה באמצעות g:Profiler, ומונחים משמעותיים משורטטים על ידי −log₁₀ (p-value), צבועים לפי מקור הביאור: GO Molecular Function (GO:MF), GO Biological Process (GO:BP), GO Cellular Component (GO:CC), KEGG, Reactome, WikiPathways ואונטולוגיה של פנוטיפ אנושי (HP). פלט זה מייצג את התועלת המרכזית של dfPPI: חשיפת מסלולים פונקציונליים בעלי משמעות ביולוגית המופרעים באמצעות שיפוץ אינטראקטום מונע אפיכפרום. כיסוי ההערות הרחב מדגיש את התובנה ברמת המערכת שניתן להשיג באמצעות גישה זו. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

שיטת	מה הוא לוכד	חוזקות עיקריות	מגבלות עיקריות	שימוש אופייני	מדרגיות (קבוצות)
AP-MS (טיהור זיקה - MS)	אינטראקטורים ישירים/כמעט ישירים של פיתיון בודד	ספציפיות גבוהה; כמותית; טוב להרכב מורכב	דורש פיתיון/תג/נוגדן; פיתיון אחד בכל פעם; עלול לפספס חולף/חלש	הגדירו שותפים של חלבון מעניין	נמוך-בינוני (דרושים פיתיונות רבים)
תיוג קרבה (למשל, גרסאות BioID/APEX)	חלבונים בסביבת פיתיון בקנה מידה ננומטרי לאורך זמן	לוכד שכנים ארעיים/חלשים; פועל בתאים חיים	הנדסה גנטית; תיוג מחוץ למטרה; פרמטר כבד	מפות שכונות מקומיות; דינמיקה	נמוך-בינוני (הנדסי לכל פיתיון)
XL-MS (MS צולב)	קרבה/מגעים מרחביים בתוך/בין חלבונים	מעצורים מבניים; לוכד אנשי קשר ארעיים	אנליזה מורכבת; רוחב פרוטאום תחתון; ספציפי לדגימה	טופולוגיה מבנית/הקשרית	נמוך (מתמחה)
קו-פרקציה/MS (CF-MS)	פליטה משותפת של מכלולים מקומיים	ללא תיוג; מכלולים מקומיים	עבודה אינטנסיבית; הסקה מורכבת; רגישות מוגבלת	נוף מורכב גלובלי	מתון
CETSA/TPP	פרופילי יציבות משותפת/צבירה משותפת	ללא תוויות; תנאים מקוריים	עקיף ל- PPIs; אילוצי מסיסות	מעורבות מטרה; משמרות תרמיות	מתון
dfPPI (אפיכפרומיקה)	חיווט מחדש של אינטראקציה ברמת הרשת שנלכד על ידי אפיכפרומים אנדוגניים כפיתיונות מולטיפלקס	אנדוגני; ללא תיוג; לכידה אחת חוקרת אלפי PPIs לא מתפקדים; קריאות מסלול/רשת; תואם רקמות; ידידותי לקבוצה	ישים רק להקשר של מחלה; בדיקות מיוחדות (חרוזי PU, YK5-B); לא מיועד לגילוי מורכב גנרי	שיפוץ אינטראקטום בהקשר מחלה, תעדוף מסלול, יצירת השערות	גבוה (מאות דוגמאות אפשריות)

טבלה 1: השוואה בין גישות מיפוי PPI ו-dfPPI. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

קובץ משלים 1: הגדרות פרמטר ספקטרונאוט מלאות. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר מיפוי של PPIs לא מתפקדים בדגימות ביולוגיות מקומיות באמצעות פלטפורמת dfPPI. בניגוד לשיטות מסורתיות המסיקות תפקוד לקוי משפע או שינויים בביטוי, פלטפורמה זו לוכדת חיווט מחדש של הרשת ברמה המבנית על ידי בידוד אינטראקטורים ספציפיים למחלה באמצעות טיהור זיקה עם בדיקות ממוקדות אפיכפרום, ואחריו MS כמותי מבוסס עוצמה ללא תווית. למרות שהיישום הנוכחי מתמקד ברקמת מוח לאחר המוות, השיטה ישימה באופן נרחב לסוגי דגימות ומודלים אחרים של מחלות, כולל תאים ורקמות מתורבתים ממודלים של סרטן, ניוון עצבי ותפקוד לקוי של מערכת החיסון 16,17,18,19,20,22,23.

dfPPI מסתמך על בדיקות שבוחרות באופן קינטי אפיכפרומים ולוכדות את המכלולים עם האינטראקטורים הקשורים שלהם. חרוזי PU (שמקורם בכימוטיפים קושרי אפיכפרום כגון PU-H71/PU-AD) עוסקים באפיכפרומים בעלי גרעין HSP90 באופן לא קוולנטי אך עם זמן שהייה ארוך, סימן היכר של סלקטיביות קינטית לקונפורמציה של אפיכפרום על פני מתחמי מלווים קונבנציונליים²³. YK5-B הוא בדיקה ביוטינילית, קוולנטית המכוונת ל-HSC70 בתוך אפיכפרומים, המאפשרת לכידה בתוך התא לפני ליזה ושימור PPIs אנדוגניים¹⁷. הסלקטיביות נובעת מ-PTMs הקשורים למחלה המעצבים מחדש קונפורמציות HSP90/HSC70 וכימיה של כיס ומייצבים מכלולי אפיכפרום 14,23,43,44; שינויים אלה מניבים זיקה גבוהה_{ואיטית לקשירת} K עבור בדיקות לא קוולנטיות מסוג PU⁴⁵ (ומאפשרים לכידה קוולנטית עם YK5-B בהכוונת HSC70), ובכך שומרים קינטית על מתחמי אפיכפרום ומבודדים במשותף את האינטראקטורים הישירים והעקיפים שלהם עבור LC-MS/MS. בפועל, חרוזי PU הם אופטימליים עבור זרימות עבודה של ליזאט/הומוגניאט, בעוד ש-YK5-B תומך בלכידת תאים חיים; שניהם שומרים על מכלולים תלויי הקשר שניתן לזהות על ידי LC-MS/MS ולהשתמש בהם לניתוח dfPPI במורד הזרם.

עבור dfPPI, נדרשת מומחיות מיוחדת בכימיה כדי לסנתז את בדיקות הלכידה. עם זאת, דרישה זו אינה ייחודית ל-dfPPI: שיטות PPI בשימוש נרחב (AP-MS, תיוג קרבה, XL-MS) מסתמכות גם על מיומנויות מיוחדות - למשל, שיבוט/הנדסה של פיתיונות מתויגים, יצירת קווי תאים יציבים, אופטימיזציה של תיוג/הצלבה וצינורות ביואינפורמטיים מורכבים. לעומת זאת, dfPPI נמנע ממניפולציה גנטית וביטוי יתר של פיתיון, פועל ישירות על תאים או רקמות מקומיות (כולל דגימות ביולוגיות קליניות נדירות), ומשתמש בתהליכי עבודה סטנדרטיים של לכידת זיקה ו-LC-MS שכבר שגרתיים בליבות פרוטאומיקה. כדי להוריד את מחסומי האימוץ, חרוזי PU מאומתים וחרוזי בקרה תואמים זמינים באמצעות MTA ממעבדת Chiosis, ושלבי הטיפול/QA מוגדרים במלואם בשלבים 1.3 ו-1.4. לבסוף, הניתוח נתמך על ידי אפליקציית dfPPI מבוססת אינטרנט המיישמת את הסטטיסטיקות הנדרשות וקריאות מסלולים/רשתות, ומפחיתה את הנטל הביואינפורמטי (כלומר, למשתמשים ללא רקע בקידוד וכישורי ביואינפורמטיקה בסיסיים בלבד).

AP-MS, XL-MS, תיוג קרבה, חלוקה משותפת ו-CETSA/TPP עונים כל אחד על שאלות שונות (קלסרים ישירים, קרבה מרחבית, תיוג שכונתי, הרכבה משותפת או יציבות תרמית). dfPPI היא שיטת הבחירה כאשר המטרה היא למפות חיווט מחדש אנדוגני ותלוי-הקשר במחלה - במיוחד ברקמות מקומיות או בקבוצות קליניות גדולות שבהן תיוג גנטי אינו אפשרי, וכאשר רצוי קריאות ברמת המסלול/רשת מלכידה בודדת. dfPPI משתמש באפיכפרומים כפיתיונות מולטיפלקס כדי ללכוד שינויי אינטראקציה מתואמים על פני חלבונים רבים במשיכה אחת, מה שמאפשר זיהוי LC-MS/MS ניתן להרחבה וניתוח ממוקד מסלול מחומר ראשוני. בפועל, dfPPI יכול לזרוע אימות במורד הזרם, ממוקד פיתיון (למשל, AP-MS בצמתים ספציפיים), בעוד ששיטות מסורתיות יכולות לחדד טופולוגיה (מגעים ישירים, אילוצים מרחביים) עבור קומפלקסים המודגשים על ידי dfPPI. ראה טבלה 1 להשוואה זו לצד זו.

מספר שלבים קריטיים משפיעים על הצלחת זרימת העבודה. ראשית, תמציות חלבון איכותיות הן חיוניות. זה דורש טיפול זהיר ברקמות או בתאים - באופן אידיאלי מוקפאים ומאוחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס - כדי למזער את הפרוטאוליזה ולשמר קומפלקסים מקומיים. הכללת מעכבי פרוטאז ופוספטאז אינה ניתנת למשא ומתן: שלמות האפיכפרום, הפועלת כ"פיתיון" פונקציונלי בבדיקה זו, תלויה בשינויים ספציפיים לאחר התרגום של רכיבי ליבה כגון HSP90^23,43. לדוגמה, זרחון של Ser226 ו-Ser255 חיוני לייצוב קונפורמציה של האפיכפרום ולשימור תפקוד הפיגומים^{שלו 23}. השמטת מעכבי פוספטאז מסתכנת בקריסה מבנית ואובדן הספציפיות הביולוגית.

גורם מפתח נוסף הוא האיכות והטיפול במטריצת הזיקה של חרוזי PU. יש לאחסן חרוזים ב-100% איזופרופנול ב-20 מעלות צלזיוס ולהשתמש בהם בחלון פעילות מוגדר, באופן אידיאלי תוך 1-2 שנים. יש לאמת את הפעילות לפני ניסויים קריטיים, שכן חרוזים מיושנים עשויים להפגין יכולת קשירה מופחתת או אינטראקציות לא ספציפיות מוגברות. יש לייעל גם את זמן הדגירה וקלט החלבון: דגירה יתר עלולה להעלות את הרקע, בעוד שקלט חלבון לא מספיק עלול לפגוע בעומק הזיהוי. אנו ממליצים על דגירה של 3 שעות ומשיכות פיילוט כדי לכייל את הקלט המתאים לכל סוג דגימה.

שתי אסטרטגיות עיכול תואמות לפרוטוקול זה: על חרוז ובתוך ג'ל. בעוד ששתי זרימות העבודה מניבות תוצאות הניתנות לשחזור, כל אחת מהן מציעה פשרות. עיכול בתוך הג'ל עלול להכניס מזהמים כגון קרטין ודורש שלבי טיפול נוספים. עיכול חרוזים מייעל את זרימת העבודה ומועדף בדרך כלל כאשר תפוקת הדגימה או כמות הקלט מגבילים. עם זאת, יש לכייל את כמויות הפרוטאז על סמך קלט החלבון הכולל: למרות שהשיטה מיועדת ל-750 ננוגרם של טריפסין, עיכול לא שלם עלול להתרחש אם רמות החלבון גבוהות, מה שמוביל להחמצת מחשופים ולהתאוששות מופחתת של פפטידים. רצוי להעריך את יעילות העיכול ולהתאים את קלט האנזים בהתאם. יש לבצע את כל שלבי העיכול בצינורות בעלי קשירה נמוכה באמצעות ריאגנטים טריים ונטולי זיהום כדי להבטיח עקביות ולמזער את הרקע.

טעינת החלבון לכל הזרקת LC-MS תלויה בזרימת העבודה של הלכידה, בתפוקת הפפטידים ובקיבולת העמודה. עבור תקצירים על חרוזים המנותחים על עמודות ננו-LC C18 סטנדרטיות (~50-75 מיקרומטר ID, ~15-25 ס"מ), אנו בדרך כלל מעמיסים 300-500 ננוגרם להזרקה; לא ראינו רווחי ביצועים מעל ~400-500 ננוגרם, בעוד שעומסים גבוהים יותר מסתכנים בדיכוי יונים והרחבת שיא. עבור זרימות עבודה בתוך הג'ל (למשל, חמש פרוסות לכל נתיב), אנו בדרך כלל מזריקים ~25% מהחומר המומלח לכל פרוסה לכל שכפול ושומרים ~50% כגיבוי להזרקה חוזרת במידת הצורך. בכל המקרים, יש למדוד את ריכוז הפפטידים לפני ההזרקה, לוודא תגובה ליניארית עם תקציר QC, ולכוונן את העומס כך שצורת השיא הכרומטוגרפית ועומק הזיהוי יישמרו ללא עומס יתר.

כימות ללא תווית באמצעות DIA נמצא בשימוש נרחב בפרוטאומיקה בשל יכולת השחזור והעומק שלו⁴⁶. עם זאת, בהקשר של ניסויי לכידת זיקה כמו זה - כאשר המטרה היא לזהות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם פיגומי אפיכפרום במקום למדוד שפע חלבונים גלובלי - אסטרטגיות נורמליזציה כמו MaxLFQ אינן מתאימות. גישות אלו מניחות קלט אחיד ודמיון רחב של פרוטאום, אשר מופרים על ידי שלב ההעשרה המהותי לפרוטוקול זה. במקום זאת, ערכי עוצמה או ספירות ספקטרליות של MS/MS מספקים כימות מספיק ומשמעותי מבחינה ביולוגית לניתוח פונקציונלי במורד הזרם. מדדים אלה משקפים את חוזק האינטראקציה היחסית או תדירות האינטראקציה של חלבונים עם אפיכפרומים על פני תנאים. כפי שהודגם במחקרים קודמים 16,17,18,20, ערכים אלה מתאימים היטב לניתוחי אינטראקטום ברמת המערכת כגון dfPPI, המזהים מסלולים ביולוגיים משתנים מבלי להסתמך על נורמליזציה רחבה של הפרוטאום. על ידי שימור השונות הביולוגית האמיתית הנוצרת על ידי מחלה או טיפול, כימות מבוסס אינטנסיביות או MS / MS מאפשר מיפוי מדויק וחזק של תפקודים לקויים ברשת PPI.

למרות שלכידת זיקה מפחיתה את מרחב החיפוש לעומת ליזאט שלם, משיכות dfPPI עדיין מכילות מאות עד אלפי חלבונים המשתרעים על פני טווח דינמי רחב, בתוספת רקע מועשר במשותף. עבור השוואות בקנה מידה קבוצתי, בחירת המבשר הסטוכסטי של DDA מובילה לערכים חסרים של ריצה לריצה ודגימה משתנה של אינטראקטורים בשפע נמוך¹⁸. DIA מפצלת באופן שיטתי את כל היונים בחלונות מוגדרים מראש, ומספקת עומק רב יותר, פחות ערכים חסרים ומאפייני שחזור גבוהים יותר של ריצה להפעלה שהם חיוניים כאשר ההסקה במורד הזרם היא ברמת המסלול/רשת ולא חלבון יחיד. זו הסיבה שאנו מתקנים את DIA עבור dfPPI.

כמו בכל שיטות לכידת זיקה, קשירת חלבון לא ספציפית היא שיקול אינהרנטי. חלבונים עשויים להישמר עקב דביקות לשרף, שפע גבוה או צבירה. בעוד שאינטראקטורים לא ספציפיים כאלה יכולים להופיע ב-eluate הנפתח, נוכחותם אינה מערערת את המטרה האנליטית במורד הזרם של פרוטוקול¹⁷ זה. זרימת העבודה של dfPPI לא נועדה להגדיר אינטראקציות בינאריות אלא לחלץ דפוסים של חיווט מחדש של PPI ברמת המערכות. ניתוחי העשרה פונקציונליים מבוצעים על אינטראקטורים דיפרנציאליים וממנפים סטטיסטיקה מבוססת רשת כדי לחשוף שינויים מתואמים ברמת המסלול. כפי שהודגם בעבודה קודמת¹⁷, גישה זו ברמת המערכת ממזערת את ההשפעה של חלבונים לא ספציפיים מבודדים ומאפשרת למסקנות ביולוגיות חזקות לצמוח מנתונים ברמת העוקבה.

בהשוואה לגישות מיפוי אינטראקטום קונבנציונליות - כגון קו-אימונו-משקעים, תיוג קרבה או קישור צולב - פלטפורמת dfPPI מציעה יתרון מובהק: היא לוכדת שיפוץ אינטראקטום פונקציונלי בתנאים רלוונטיים למחלה מבלי לדרוש הנדסת פיתיון או ביטוי יתר. מכיוון שהשיטה מבודדת קומפלקסים של חלבונים הנוצרים סביב אפיכפרומים על-מולקולריים, היא מזהה מכלולי חלבון מתעוררים שאינם קיימים במערכות בריאות, ומאפשרת גילוי של גורמי מחלה חדשים. הגישה ניתנת להרחבה וניתנת להתאמה בין רקמות, מינים ומצבי מחלה, והיא כבר סיפקה תובנות ייחודיות לגבי עיצוב מחדש של פרוטאום בסרטן וניוון עצבי. ככזו, שיטה זו מציעה כלי רב עוצמה לחשיפת רשתות תפקודיות משובשות במחלות אנושיות.

מעבר לדוגמאות כאן, dfPPI ממוקם היטב עבור (i) קבוצות קליניות גדולות כדי לרבד חולים לפי תפקוד לקוי של הרשת ולגלות סמנים ביולוגיים פרמקודינמיים המדווחים על מעורבות מטרה ותיקון מסלול; (ii) דגימה אורכית (למשל, לפני/אחרי טיפול, שלב מחלה) כדי לעקוב אחר מסלולי חיווט מחדש ולחזות מגיבים; (iii) אינטגרציה עם פוספופרוטאומיקה ואומיקים אחרים המודעים ל-PTM כדי לקשר שינויים במצב אינטראקציה לאיתות במעלה הזרם; (iv) לכידות שנפתרו מרחבית מאזורים מנותחים מיקרו (ממשקים נורמליים של גידול, תת-אזורים במוח) כדי למפות פתוביולוגיה של רשת מקומית; (v) מסכי הפרעות (גנטיים או מורכבים) שבהם קריאות dfPPI ממנות צמתים ומנגנוני פעולה הניתנים לפעולה; ו-(vi) מודלים גרפיים/בינה מלאכותית שלומדים תכונות רשת ספציפיות למחלה ממפות dfPPI עבור פרוגנוזה ועיצוב טיפולי. מבחינה מתודולוגית, מזעור, אוטומציה (למשל, פורמטים של 96 בארות) ו-QC סטנדרטי יאפשרו צינורות תפוקה גבוהה למחקרים תרגומיים וניסויים קליניים. לבסוף, יציאות dfPPI יכולות לזרוע מעקבים ממוקדים - AP-MS, XL-MS או תיוג קרבה - כדי לפתור טופולוגיה של מודולים מתועדפים, תוך הדגשת ההשלמה של השיטה בתוך ערכת הכלים האינטראקטומית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מרכז הסרטן ממוריאל סלואן קטרינג (MSKCC) מחזיק בזכויות הרוחניות על תיק האפיכפרום. G.C., A.R., C.S.D. ו-S.S. הם ממציאים בקניין הרוחני המורשה. כל המחברים האחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי ה-NIH (R01 CA172546, U01 AG032969, P01 CA186866, R56 AG061869, R01 AG067598, R01 AG074004, R01 AG072599, R56 AG072599, RF1 AG071805, P30 CA008748, S10 RR027990) ומר ויליאם ה. וגברת אליס גודווין וקרן חבר העמים לחקר הסרטן והמרכז לטיפולים ניסיוניים של MSKCC (G.C). SS מבקשת להודות על תמיכת המימון מקרן BrightFocus (מזהה פרס: A2022020F).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-מרקפטואנול	סיגמא-אלדריץ'	M6250	רעיל, דליק
אצטוניטריל (ACN) Optima	פישר סיינטיפיק	A955-1	דרגת LC/MS (דליק)
מדיום כרומטוגרפיה מופעל על ידי Affi-Gel 10	ביו-ראד	1536099	משמש לייצור חרוזי PU ולשליטה בחרוזים (דליקים)
ביקרבונט אמוניום (ABC)	סיגמא-אלדריץ'	09830-500G
עמוד Aurora Ultimate 25x75 C18 UHPLC	IonOpticks	AUR3-25075C18-CSI
סרט אוטורדיוגרפי	חברת אוון-פארקר אקס-ריי	EBA45	חלופה לזיהוי אות כימילומינסנטי לאחר ווסטרן בלוט
הומוגנייזר מיקרו-רקמות ביומאשר	DWK מדעי החיים קימבל	7496250010	משמש להומוגניזציה של רקמת מוח קפואה לצורך הפקת חלבון
ברומופנול כחול	ביוריאגנט פישר	BP115-25
צנטריפוגה לצינורות 1.5 מ"ל	אפנדורף	5424
צנטריפוגה לצינורות 1.5 מ"ל	אפנדורף	5417R	עם בקרת טמפרטורה
צנטריפוגה לצינורות 15-50 מ"ל	אפנדורף	5810R	משמש לצינורות חרוטיים
מערכת ההדמיה של ChemiDoc MP	ביו-ראד	17001402	משמש לצפיפות ג'ל/כתמים
תנור עמוד	סונאשן GmBH, גרמניה	ES071/ES072	שומר על עמודת nanoLC ב-50 ו-deg; C לשמירה עקבית
צינורות חרוטיים (15 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	352096
חרוזי בקרה	מעבדת כיוזיס	לא זמין	טלדונה ואח' (PMID: 21459002)
כתם Coomassie G-250 (ביו-בטוח)	ביו-ראד	1610786
צינורות אפנדורף כהים (1.5 מ"ל)	USA Scientific	1415-2507
דיתיותרייטול (DTT)	רוש	10197777001	מטריד
קל nLC 1000	תרמו פישר סיינטיפיק	קל nLC 1000	מערכת LC בשימוש עם Q Exactive HF
דיסקי חילוץ פאזה מוצקה של Empore	חברת 3M	2215-C18 (אוקטדציל)	משמש להכנת StageTips להסרת מלח פפטידים; מופעל עם 100% מתנול
ערכת כימילומינסנציה משופרת (ECL)	תרמו פישר סיינטיפיק	32209
צינורות אפנדורף (1.5 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	05-408-129
חומצה פורמית (FA) אופטימה	פישר סיינטיפיק	A117-10X1AMP	דרגת LC/MS
g:Profiler (e111_eg58_p18_f463989d)	BIIT Group-Tartu & Uuml; ליקול	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost	העשרת שבילים
גליצרול	ביוריאגנט פישר	BP229-1	דרגת ביולוגיה מולקולרית
גליצין	ביוריאגנט פישר	BP381-5	אבקה גבישית
נוגדן משני מצורף HRP נגד עכבר (RRID: AB_2619742)	סותרן ביוטק	1030-05	משני לנוגדן H90-10
נוגדן משני מנוגד HRP נגד ארנבים (RRID: AB_2632593)	סותרן ביוטק	4010-05	משני ל-HSP90α ונוגדני HOP
נוגדן משני מנוגד נגד עכברים ל-HRP (RRID: AB_2716837)	סותרן ביוטק	3030-05	משני לנוגדן HSC70
רועד אורביטלי מחומם	אפנדורף	ThermoMixer C (2231001127)
חלבון HeLa Digest סטנדרטי-פירס	תרמו פישר סיינטיפיק	88329	משמש להערכת בקרת איכות של LC-MS
נוגדן HOP (RRID: AB_10828378)	איתות סלולרי	5670	עבור PU-beads בקרת איכות
נוגדן HSC70 (RRID: AB_10617277)	אנזו	SPA-815	עבור PU-beads בקרת איכות
נוגדן HSP90 (H90-10) (RRID: AB_854214)	סטרסמרק	SMC-107	עבור PU-beads בקרת איכות
נוגדן אלפא HSP90 (RRID: AB_303423)	אבקאם	Ab2928	לנרמול לפי סעיף 1.2
קו תאים אנושי: ASPC1 (RRID:CVCL_0152)	ATCC	CRL-1682	קו תאים בקרה, אפיכפרום נמוך/צ'פרון גבוה
קו תאים אנושי: MDA-MB-468 (RRID: CVCL_0419)	ATCC	HTB-132	קו תאים בקרה, אפיכפרום גבוה/שומר גבוה
ImageJ (v1.54p)	ויין רסבנד	https://imagej.net/ij/	צפיפות
יודואצטמיד (IAA)	סיגמא-אלדריץ'	I1149-5G	רעיל
צינורות מיקרוצנטריפוגה קושרים דלת חלבון	סארסטדט	72.706.600
פרוטאז Lys-C	פרומגה	VA1170	דרגת LC/MS
כלוריד מגנזיום	סיגמא-אלדריץ'	63068	דרגת ביולוגיה מולקולרית
MaxQuant (v2.1.1.0)	מכון מקס פלאנק לביוכימיה	https://www.maxquant.org/	תהליך עבודה של MaxDIA לזיהוי פפטידים/חלבונים וכימות אינטנסיבי ללא תוויות
מתנול	פישר כימיקל	A454-4	דרגת HPLC, דליק, רעיל
טבליית קוקטייל מעכב פרוטאז מיני (מלאה)	רוש	4693124001
תא העברה אלקטרופורטי Mini Trans Blot	ביו-ראד	1703930
מיכל אלקטרופורזה מיני-ג'ל	תרמו פישר סיינטיפיק	A25977	משמש לג'לים מוכנים של Novex
תא אלקטרופורזה אנכי Mini-PROTEAN Tetra	ביו-ראד	1658004	משמש לג'לים חלבון מוכנים מיני-פרוטיאן או ג'לים יצוקים ביד
מיני-פרוטיאן ג'לי חלבון TGX Precast (4– 20%)	ביו-ראד	4561094
ננודרופ	אג'ילנט	BioTek Synergy H1	משמש להערכת ריכוז פפטידים לפני הזרקת LC-MS
ננו-אלוט 2	ברוקר	https://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdf	בשימוש בתהליך עבודה של diaPASEF
מקור Nanospray Flex	תרמו פישר סיינטיפיק	ES071	לצימוד ESI בננוספריי
מטרה חדשה פיקוטיפ אמיטר/פיקופריט SELF/P	ניו אובייקטיבית בע"מ.	PF360-75-10-N-5	מלא בתערובת C18 עד אורך 20 ס"מ
ממברנת ניטרוצלולוז	סיטיבה אמרשם	10600006
חלב יבש דל שומן	מעבדה מדעית	M0841
ג'לים מוכנים של Novex 8% Tris-Glycine	תרמו פישר סיינטיפיק	XP00080BOX
NP-40	רוש	11754599001
סליין עם בופר זרחן (PBS)	גיבקו	10010023
טבליית קוקטייל מעכב פוספטאז PhosSTOP	רוש	4906837001
ערכת בדיקת חלבון Pierce BCA	תרמו פישר סיינטיפיק	23225
מיכלים מפלסטיק	פישר סיינטיפיק	FB0875711A
נדנד פלטפורמה	קורנינג	6705
כלוריד אשלגן	ביוריאגנט פישר	BP366-1	קריסטלים לבנים
ספק כוח אוניברסלי של PowerPac	ביו-ראד	1645070
תקן חלבון קליידוסקופ Precision Plus Prestained Protein	ביו-ראד	1610375
חרוזי PU	מעבדת כיוזיס	לא זמין	טלדונה ואח' (PMID: 21459002)
Q ספקטרומטר מסה אקסקטיבי HF Orbitrap	תרמו פישר סיינטיפיק	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdf	משמש ל-DIA-MS
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 ומיקרו; m	Dr. Maisch GmbH, גרמניה	R13.aq	מדיום סיליקה להפרדת פפטידים; תערובת אבקה/מתנול (1:3, v/v)
יחידת סיבוב (רוטטור קצה-על-קצה)	ברנסטד בינלאומי	400110
מחסניות Sep-Pak C18 (100 מ"ג)	תאגיד ווטרס	WAT023590
נתרן דודציל סולפט (SDS)	ביוריאגנט פישר	BP166-500	דרגת אלקטרופורזה
סוניקטור	ברנסון	2510
קורא מיקרופלט רב-מצבי של SpectraMax Paradigm	מכשירים מולקולריים	פרדיגמת ספקטרמקס
ספקטרונאוט	ביוגנוזיס	https://biognosys.com/software/spectronaut/	תהליך עבודה של directDIA
מרכז SpeedVac	תרמו פישר סיינטיפיק	סאוואנט SPD111V
ואקום יניקה	קרדינל הלת'	CDL-65651-320
ספקטרומטר מסה TimsTOF HT	ברוקר	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.html	משמש לניתוח diaPASEF
חומצה טריפלואורקטית (TFA) אופטימה	סיגמא-אלדריץ'	T6508-10AMP	דרגת LC/MS (קורוזיבי, דליק)
טריס	ביוריאגנט פישר	BP152-5	אבקה גבישית; דרגת ביולוגיה מולקולרית
טריס, pH 6.8 (1 מ')	טקנובה	T1068
טריס, pH 7.5 (1 מ')	ביוריאגנט פישר	BP1757-500	דרגת ביולוגיה מולקולרית
בופר מלח טריס-בופר (20 TBS)	VWR, מדעי החיים	97064-338
טריס-גליסין-SDS (TGS 10x) עם בופר ג'ל רץ	ביוריאגנט פישר	BP13414	אלקטרופורזה
Trypsin	פרומגה	V5111	דרגת ריצוף
טריפסין גולד	פרומגה	V5280
גיל 20	ביוריאגנט פישר	BP337-100
אוריאה	סיגמא-אלדריץ'	U0631-500G
מערבולת	פישר סיינטיפיק	02-215-414
מים	פישר סיינטיפיק	W6-1	דרגת LC/MS

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liu, Z., Miller, D., Li, F., Liu, X., Levy, S. F. A large accessory protein interactome is rewired across environments. Elife. 9, e62365(2020).
Omranian, S., Nikoloski, Z., Grimm, D. G. Computational identification of protein complexes from network interactions: Present state, challenges, and the way forward. Comput Struct Biotechnol J. 20, 2699-2712 (2022).
Ginsberg, S. D., Sharma, S., Norton, L., Chiosis, G. Targeting stressor-induced dysfunctions in protein-protein interaction networks via epichaperomes. Trends Pharmacol Sci. 44 (1), 20-33 (2023).
Nussinov, R. Pioneer in molecular biology: Conformational ensembles in molecular recognition, allostery, and cell function. J Mol Biol. 437 (11), 169044(2025).
Lacoste, J., et al. Pervasive mislocalization of pathogenic coding variants underlying human disorders. Cell. 187 (23), 6725-6741.e13 (2024).
Liu, X., Abad, L., Chatterjee, L., Cristea, I. M., Varjosalo, M. Mapping protein-protein interactions by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. , (2024).
Luck, K., Sheynkman, G. M., Zhang, I., Vidal, M. Proteome-scale human interactomics. Trends Biochem Sci. 42 (5), 342-354 (2017).
Greenblatt, J. F., Alberts, B. M., Krogan, N. J. Discovery and significance of protein-protein interactions in health and disease. Cell. 187 (23), 6501-6517 (2024).
Gonzalez-Avendano, M., Lopez, J., Vergara-Jaque, A., Cerda, O. The power of computational proteomics platforms to decipher protein-protein interactions. Curr Opin Struct Biol. 88, 102882(2024).
Komives, E. A., Chiosis, G. Editorial overview: Protein networks in health and disease. Curr Opin Struct Biol. 90, 102953(2025).
Botticelli, L., et al. Chemical cross-linking and mass spectrometry enabled systems-level structural biology. Curr Opin Struct Biol. 87, 102872(2024).
Chakrabarty, S., Wang, S., Roychowdhury, T., Ginsberg, S. D., Chiosis, G. Introducing dysfunctional protein-protein interactome (dfppi) - a platform for systems-level protein-protein interaction (ppi) dysfunction investigation in disease. Curr Opin Struct Biol. 88, 102886(2024).
Pasala, C., et al. Epichaperomes: Redefining chaperone biology and therapeutic strategies in complex diseases. RSC Chem Biol. 6 (5), 678-698 (2025).
Chu, F., Sharma, S., Ginsberg, S. D., Chiosis, G. PTMs as molecular encoders: Reprogramming chaperones into epichaperomes for network control in disease. Trends Biochem Sci. , (2025).
Chiosis, G., Digwal, C. S., Trepel, J. B., Neckers, L. Structural and functional complexity of hsp90 in cellular homeostasis and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (11), 797-815 (2023).
Rodina, A., et al. The epichaperome is an integrated chaperome network that facilitates tumour survival. Nature. 538 (7625), 397(2016).
Rodina, A., et al. Systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation. Nat Commun. 14 (1), 26(2023).
Inda, M. C., et al. The epichaperome is a mediator of toxic hippocampal stress and leads to protein connectivity-based dysfunction. Nat Commun. 11 (1), 19(2020).
Joshi, S., et al. Pharmacologically controlling protein-protein interactions through epichaperomes for therapeutic vulnerability in cancer. Commun Biol. 4 (1), 20(2021).
Bay, S., et al. Systems-level interactome mapping reveals actionable protein network dysregulation across the alzheimer's disease spectrum. Res Sq. , (2025).
Moulick, K., et al. Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by HSP90. Nat Chem Biol. 7 (11), 818-826 (2011).
Kishinevsky, S., et al. Hsp90-incorporating chaperome networks as biosensor for disease-related pathways in patient-specific midbrain dopamine neurons. Nat Commun. 9, 15(2018).
Roychowdhury, T., et al. Phosphorylation-driven epichaperome assembly is a regulator of cellular adaptability and proliferation. Nat Commun. 15 (1), 8912(2024).
Roychowdhury, T., et al. Use of native-page for the identification of epichaperomes in cell lines. Methods Mol Biol. 2693, 175-191 (2023).
Taldone, T., et al. synthesis, and evaluation of small molecule HSP90 probes. Bioorg Med Chem. 19 (8), 2603-2614 (2011).
Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).
Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using stagetips. Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).
Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. Flashpack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS. Mol Cell Proteomics. 18 (2), 383-390 (2019).
Sinitcyn, P., et al. Maxdia enables library-based and library-free data-independent acquisition proteomics. Nat Biotechnol. 39 (12), 1563-1573 (2021).
DiscoveryLibraries. , The Max Planck Institute of Biochemistry. Available from: https://datashare.biochem.mpg.de/s/qe1IqcKbz2j2Ruf?dir=/DiscoveryLibraries (2025).
Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75 (3), 663-670 (2003).
Meier, F., et al. Diapasef: Parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods. 17 (12), 1229-1236 (2020).
Lou, R., et al. Benchmarking commonly used software suites and analysis workflows for dia proteomics and phosphoproteomics. Nat Commun. 14 (1), 94(2023).
Demichev, V., et al. Dia-pasef data analysis using fragpipe and dia-nn for deep proteomics of low sample amounts. Nat Commun. 13 (1), 3944(2022).
Wen, C., et al. Evaluation of DDA library-free strategies for phosphoproteomics and ubiquitinomics data-independent acquisition data. J Proteome Res. 22 (7), 2232-2245 (2023).
Bowler-Barnett, E. H., et al. Uniprot and mass spectrometry-based proteomics-A 2-way working relationship. Mol Cell Proteomics. 22 (8), 100591(2023).
Demichev, V., Messner, C. B., Vernardis, S. I., Lilley, K. S., Ralser, M. Dia-nn: Neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nat Methods. 17 (1), 41-44 (2020).
Wang, T., Digwal, C. S., Alam, A., Chiosis, G. R. script epichaperomics - systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation. Zenodo. , https://doi.org/10.5281/zenodo.7416220 (2022).
Chaperomics_ad_2019. , Chiosislab. https://github.com/chiosislab/Chaperomics_AD_2019 (2019).
Chaperomics_controllability_2020. , Chiosislab. https://github.com/chiosislab/Chaperomics_controllability_2020 (2019).
Alam, A., Wang, T., Chiosis, G. Cytoscape files - systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation [data set]. Zenodo. , https://doi.org/10.5281/zenodo.7433980 (2022).
Kolberg, L., et al. G:Profiler-interoperable web service for functional enrichment analysis and gene identifier mapping (2023 update). Nucleic Acids Res. 51 (W1), W207-W212 (2023).
Yan, P. R., et al. Molecular stressors engender protein connectivity dysfunction through aberrant n-glycosylation of a chaperone. Cell Reports. 31 (13), 27(2020).
Castelli, M., et al. How aberrant n-glycosylation can alter protein functionality and ligand binding: An atomistic view. Structure. 31 (8), 987-1004.e8 (2023).
Sharma, S., et al. Unraveling the mechanism of epichaperome modulation by zelavespib: Biochemical insights on target occupancy and extended residence time at the site of action. Biomedicines. 11 (10), 2599(2023).
Guzman, U. H., et al. Ultra-fast label-free quantification and comprehensive proteome coverage with narrow-window data-independent acquisition. Nat Biotechnol. 42 (12), 1855-1866 (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PPI

מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים