מאמר שיטה

הכנת חרוזי פיצוי כלכליים ואוניברסליים התואמים לנוגדנים מרובי מינים

117 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70114

⸱

17 באפריל 2026

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, 2Center for gene and immunotherapy, The Second Qilu Hospital of Shandong University, 3Department of Radiology, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 4Department of Urology, The second hospital of Tianjin Medical University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה חסכונית להכנת חרוזי פיצוי תואמים למספר מינים לפיצוי פלואורסצנציה בציטומטריית זרימה באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן מקושרות חלבון A/G/L רקומביננטיות.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר שיטה חסכונית וניתנת לשחזור להכנת חרוזי פיצוי תואמים למספר מינים לפיצוי פלואורסצנציה בציטומטריית זרימה רב-צבעית. כאן, החלבון הקושר לאימונוגלובולין A/G/L (חלבון A/G/L) המכיל מספר תחומי קישור לאימונוגלובולין, התבטא ב-E. coli, טוהר באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה ניקל, וקשור קוולנטית למיקרוספירות פוליסטירן קרבוקסיליאטיות באמצעות כימיה EDC/NHS. החרוזים המתקבלים קושרים נוגדנים ממינים ותתי-מחלקות מגוונים, ומייצרים אותות פלואורסצנציה חזקים ומובחנים המתאימים להקמת פיצוי. תוצאות אלו מספקות הנחיות מעשיות לבחירת קוטר החרוזים ועומס החלבון להשגת עוצמות פלואורסצנציה המתאימות לדרישות פיצוי שונות. ביצוע מוצלח של הפרוטוקול מתבטא בטיהור חלבונים יעיל ושיא פלואורסצנציה ברור ועוצמתי של חרוזים מצומדים בהשוואה לחרוזי ביקורת במהלך ניתוח ציטומטריית זרימה. גישה פשוטה וניתנת להרחבה זו מאפשרת הכנה שוטפת של חרוזי פיצוי יציבים ורב-שימושיים במעבדות סטנדרטיות, תוך הפחתת עלויות ושיפור הגמישות ביישומי ציטומטריית זרימה.

מבוא

ציטומטריית זרימה הפכה לכלי חיוני באימונולוגיה, ביולוגיה תאית ומחקר קליני לניתוח רב-פרמטרי של אוכלוסיות תאים 1,2,3. אתגר קריטי בציטומטריית זרימה רב-צבעונית מסורתית הוא פליטת פלואורסצנציה, שבה ספקטרום הפליטה של פלואורוכרום חופף לערוצי גלאי מרובים, מה שמוביל לזיהום אותות ולפרשנות שגויה 4,5. לכן, פיצוי נכון הוא חיוני לפרשנות מדויקת של הנתונים.

מסורתית, בקרות פיצוי מוכנות באמצעות תאים מוצבעים בצבע אחד. עם זאת, מספר תאים מוגבל, ביטוי אנטיגן משתנה וקישור שונה של נוגדנים לתאים מציבים אתגרים6. כתוצאה מכך, חרוזים סינתטיים שעברו התאמה לקשירת נוגדנים מצומדים בפלואורוכרום הופיעו כחלופה מעשית 7,8. חרוזים מציעים יתרונות של יכולת קשירה עקבית, עוצמת פלואורסצנציה גבוהה ועצמאות מרמות ביטוי אנטיגן תאי9. בהשוואה למגבבי לכידה למין יחיד או מוגבלים ב-FC, שילוב של מספר תחומי קישור לאימונוגלובולין (חלבון A, G ו-L) מרחיב את כיסוי המינים ואת תאימות פורמט הנוגדנים, ומאפשר להכנת חרוז יחיד להכיל נוגדנים מגוונים עם פלואורוכרום.

מבין החרוזים המשמשים לפיצוי, חיבור חלבונים הקושרים לאימונוגלובולין כגון חלבון A, חלבון G וחלבון L מספק תאימות רחבה לאיזוטיפים של נוגדנים ממינים שונים. חלבון A ו-G נקשרים לאזור ה-Fc של תת-מחלקות IgG רבות, בעוד שחלבון L נקשר ל-κ שרשראות קלות של אימונוגלובולינים וכך מרחיב את יכולת הקשר למקטעי Fab ולנוגדנים חד-שרשרת10,11.

למרות שקיימים חרוזי פיצוי מסחריים, עלותם הגבוהה יחסית עלולה להיות גבוהה מאוד עבור מעבדות עם תקציבים מוגבלים, מה שמגביל את השימוש הנרחב שלהם3. בהתחשב באתגרים אלו, יש צורך בפלטפורמות חרוזים גמישות ומותאמות אישית המאפשרות לחוקרים להגדיר את גודל החרוזים, תחום קישור הנוגדנים וסוגי נוגדנים המשמשים לבקרת פיצוי. מטרת הפרוטוקול היא לספק שיטה פשוטה, חסכונית וניתנת לשחזור להכנת חרוזי פיצוי תואמים למספר מינים עבור ציטומטריית זרימה רב-צבעית. פרוטוקול זה מתאר את העיצוב, הביטוי והטיהור של חלבון מיזוג רקומביננטי המכיל מספר תחומי קישור לאימונוגלובולין מחלבונים A, G ו-L, ואחריו הצמידות הקוולנטיות שלו לחרוזי פוליסטירן שעברו שינוי קרבוקסיל בקוטר מוגדר.

הפרוטוקול מפרט את העיצוב המולקולרי של חלבון המיזוג, את ביטויו וטיהורו ב-E. coli, ואת הכנת תגובות פיצוי מבוססות חרוזים התואמים למספר נוגדנים מצומדים פלואורוכרום. פרוטוקול זה מיועד למעבדות המבצעות ציטומטריית זרימה רב-צבעונית במגוון סביבות מחקר, כולל אימונולוגיה, אונקולוגיה ומחקרים תרגומיים, במיוחד כאשר נדרשים הפחתת עלויות, תאימות בין מינים ובקרות פיצוי גמישות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: הכינו את כל המאגרים והריאגנטים טריים כפי שמפורט בטבלה 1. הכינו פתרונות EDC ו-NHS מיד לפני השימוש; אל תאחסן אותם. לכל שאר הבופרים (Lysis, Binding, Washing, Elution, MES, PBS, Tris), הכינו מראש פתרונות מלאי ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. איזון בופרים מאוחסנים לטמפרטורת התגובה המתאימה (טמפרטורת חדר או 4 מעלות צלזיוס) לפני השימוש. ודא שבופר FACS ובופ האחסון מוכנים טריים או מאוחסנים בטמפרטורה של 4°C.

1. ביטוי וטיהור של חלבון רקומביננטי A/G/L

  1. ביטוי של חלבון רקומביננטי A/G/L
    1. המרת פלסמיד pET28-חלבון A/G/L לתאים מיומנים ל-E. coli BL21(DE3) באמצעות פרוטוקול הלם חום סטנדרטי.
    2. הפלטה את התאים המומרת על אגר LB המכילים 50 מיקרוגם·מ"ל-1 קאנאמיצין ודגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    3. הזרקו מושבה אחת לתוך 5–10 מ"ל מרק LB המכיל קאנאמיצין (50 מיקרוגרם·מ"ל-1) ותרבות ללילה בטמפרטורה של 37°C עם ניעור ב-200 × גרם.
    4. העבר את תרבית הלילה ל-200 מ"ל LB המכיל קאנאמיצין (ריכוז סופי 50 מיקרוג·מ"ל-1) בדילול של 1:100.
    5. גדלו את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שצפיפות האופט ב-600 ננומטר (OD600) מגיעה ל-0.6–0.8.
    6. השרה ביטוי חלבון על ידי הוספת איזופרופיל β-D-1-תיוגלאקטופירנוסיד (IPTG) לריכוז סופי של 0.5 מ"מ ומאגר בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 12–16 שעות.
    7. קצור את התאים בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 4000 × גרם למשך 10 דקות.
    8. זרוק את הסופרנטנט ותשהה מחדש את כדור התא בבופר ליזיס. המשך מיד או אחסן את הכדורים בטמפרטורה של -80°C.
      נקודת הפסקה: ניתן לאחסן כדורי תאים בטמפרטורה של מינוס 80°C במשך מספר שבועות לפני הליזה.
  2. פירוק תאים
    1. החזירו את הכדור החיידקי ל-10 מ"ל של בופר ליזיס לכל גרם מסה של תא רטוב.
    2. לעבור את התאים באמצעות הומוגניזר בלחץ גבוה שמוגדר ל-1000 בר, ומעביר את המתלה לאורך 2–3 מחזורים עד שהתמיסה הופכת לפחות צמיגה ושקופה.
      הערה: לחילופין, ניתן לבצע הפרעות תא באמצעות סוניקציה על קרח באמצעות מצב פולס (5 שניות דלוק / 10 שניות כבוי) למשך 8–12 מחזורים, כדי למנוע התחממות יתר. ודא ליזיס מלא על ידי בדיקת אליקו קטן תחת מיקרוסקופ.
    3. צנטריפוגה את הליזאט ב-12000 × גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. אסוף את הסופרנטנט כחלק חלבוני מסיס לצורך טיהור.
  3. טיהור זיקה Ni-NTA
    1. איזון עמודה וטעינת דגימות
      1. איזון את עמודת Ni-NTA עם 10 נפחי עמודות (CV) של בופר קישור המכיל 10 mM אימידזול.
      2. מסננים את הליזאט המובהק דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר, מוסיפים אימידאזול לריכוז סופי של 10 מ"מ, וטעינו אותו על העמודה ב-0.5 CV·min-1.
      3. אסוף את שבר הזרימה כדי לעקוב אחרי יעילות הקישור.
    2. כביסה
      1. שטוף את העמודה עם 10 CV של בופר קישור ובופר שטיפה המכיל 20 מ"מ אימידאזול בקצב זרימה של 1 CV·min-1.
    3. Elution
      1. מפעיל את החלבון המטרה עם בופר שחרור בקצב זרימה של 1 CV·דקה-1.
      2. אסוף שברים ומנטר את A280 כדי לזהות שברים המכילים חלבון.
    4. החלפת בופר ואחסון חלבונים
      1. העבר את תמיסת החלבון המטוהרת לצינור אולטרסילטרציה צנטריפוגלי של 50 kDa עם חיתוך משקל מולקולרי (MWCO).
      2. צנטריפוגה ב-3,500 × גרם למשך 15–20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שמגיעים לריכוז הרצוי.
      3. השליכו את ה-flow-through והוסיפו נפח שווה של בופר PBS (pH 7.4) ל-retentate לצורך החלפת מאגר.
      4. חזרו על הצנטריפוגה והחלפת PBS 2–3 פעמים כדי להחליף לחלוטין את הבופר המקורי ב-PBS.
      5. לאחר שלב הריכוז הסופי, אסוף את הרנטאט ומדד את ריכוז החלבון.
      6. אמת את השברים המוחלטים על ידי SDS-PAGE; המשקל המולקולרי הצפוי של חלבון A/G/L הוא כ-90 kDa.
      7. עליקו את החלבון המטוהר ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
        הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה. חלבון מטוהר A/G/L עשוי להישמר בטמפרטורה של -80°C לצורך צמידת חרוזים מאוחרת יותר. לאחר הריכוז, התקבלו כ-10 מ"ג חלבון מטוהר A/G/L מ-200 מ"ל תרבית חיידקים, בריכוז סופי של 2–5 מ"ג·מ"ל⁻1.

2. מצמיד את החרוזים לחלבון A/G/L

  1. שטיפה מוקדמת של חרוזים
    1. קת חרוזי מערבולת במהירות מקסימלית למשך 20–30 שניות בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס) כדי להחזיר את עצמה באופן שווה. העבר חרוז של 0.2 מ"ל 8 מיקרומום (5 מ"ג) לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    2. חרוזי פלט בצנטריפוגה, 5000 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
    4. הוסף 1 מ"ל בופר MES של 0.1 מטר, הושעה בעדינות על ידי פיפטינג או מערבולת עדינה, צנטריפוגה שוב 5000 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, והסרת סופרנטנט. חזור על השטיפה הזו פעם אחת (סך הכל שתי שטיפות MES).
  2. הפעלה עם EDC/NHS
    אזהרה: EDC ו-NHS הם מגרים ויש לטפל בהם עם ציוד מגן אישי מתאים בתוך מכסה אדים.
    1. מחזירים חרוזים בבופר MES של 0.5 מ"ל, ואז מוסיפים ברצף 50 מיקרוליטר 50 מ"ג·מ"ל-1 NHS ו-100 מיקרוליטר של 50 מ"ג·מ"ל-1 EDC.
      הערה: יש להכין פתרונות EDC ו-NHS טריים מיד לפני השימוש.
    2. חרוזי המערבולת מדוגרים על שייקר סיבובי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי להפעיל.
  3. הסר את מגבי ההפעלה ושטוף
    1. חרוזי פלט: 5000 × גרם, 3 דקות, בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את ה-Supernatant.
    2. הוסיפו 1 מ"ל בופר PBS, החזירו בעדינות, צנטריפוגות (5000 × גרם, 3 דקות, בטמפרטורת החדר), והסירו את הסופרנטנט. בצע שטיפת PBS אחת להסרת מגיבים להפעלה.
  4. קישור חלבונים
    1. החזירו את כדור החרוזים המופעל ב-0.4–0.5 מ"ל PBS (יעד נפח התגובה הסופי 0.5–0.6 מ"ל). שמור על נפח נמוך כדי להגדיל את ריכוז החלבון האפקטיבי.
    2. הוסיפו 100 מיקרוגרם חלבון A/G/L. מערבבים בעדינות.
    3. דגרו את התגובה על שייקר מתגלגל בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לחיבור מהיר, או 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. שמור על גלגול עדין כדי למנוע שקיעת חרוזים.
  5. תגובת כיבוי/סיום
    1. חרוזי פלט (5000 × גרם, 3 דקות) והסרת סופרנטנט.
    2. הוסף 1 מ"ל 0.1 M Tris (pH = 7.4) כדי לכבות את שאר האסטרים של NHS. תשתה מחדש ודגרה על שייקר מתגלגל 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. חרוזי פלט ושטיפה עם 1 מ"ל PBS באותו צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה שוב (5000 × גרם, 3 דקות) וזרוק את הסופרנטנט. לאחר מכן, תלה מחדש חרוזים עם בופר אחסון של 0.5 מ"ל.
      נקודת הפסקה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה. ניתן לאחסן חרוזים תלויים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  6. ערבב ואחסן
    1. ספירת חרוזים צמודים וחרוזים לא צמודים. מערבבים את החרוזים הצמודים והלא מצומדים ביחס של 25%–75% בצינור המיקרוצנטריפוגה החדש בנפח 1.5 מ"ל.
    2. השהיי את תערובת החרוזים ב-1 מ"ל של בופר אחסון (PBS המכיל 1% BSA ו-0.05% חומר משמר אנטימיקרוביאלי).
    3. העבר את המתלה לצינור מסומן ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הגנה מפני אור אינה נדרשת. תלוש בעדינות לפני השימוש כדי להבטיח חלוקת חרוזים אחידה. בתנאים אלה, החרוזים נשארים יציבים לפחות 6 חודשים.

3. נציג QC

  1. דגרו 10 מיקרוליטר של חרוזים מצומדים עם 1 מיקרוליטר נוגדן פלואורסצנטי בבופר FACS של 100 מיקרוליטר למשך 15–30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: כל צינור צריך להכיל נוגדן פלואורסצנטי אחד בלבד.
  2. שטיפה של חרוזים עם 1 מ"ל PBS, תלויה מחדש ב-300–500 מיקרוליטר PBS ומריצים על ציטומטר הזרימה.
  3. הגדר את ערוץ הזיהוי לפי הפלואורופור המקושר לנוגדן (למשל, לייזר 488 ננומטר עם גלאי FITC לנוגדנים מצומדים ב-FITC). טווח מתח של צינור פוטומולטיפלייר (PMT) מייצג של 0–200 וולט יכול לשמש כנקודת התחלה ולכוונן בהתאם לביצועי המכשיר. אסוף לפחות 10,000 אירועים לכל דגימה.
  4. שער על חרוזים על ידי FSC/SSC. חרוזים חיוביים צריכים להראות שיא חד ברור עם MFI גבוה בערוץ הפלואורופור; שליטה שלילית צריכה להראות רקע בלבד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חלבון המיזוג הרקומביננטי A/G/L מורכב מ-816 חומצות אמינו עם משקל מולקולרי מחושב של 90.5 kDa (קובץ משלים 1). חלבון מיזוג זה שומר על חמישה דומיינים של IgG-קישור B מחלבון A, שני דומיינים קושרים ל-IgG מחלבון G, וחמישה דומיינים של κ קושר שרשרת אור B מחלבון L, בעוד שדומיין קישור אלבומין הוסר (איור 1A, טבלת תוסף 1). שארית ציסטאין נוספה לקצה C כדי להקל על החיבור הקוולנטי, ו-6× הוכנס תג שלו כדי לאפשר טיהור יעיל באמצעות כרומטוגרפיית זי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה מעשי ויעיל להכנת חרוזי פיצוי פלואורסצנטיים המבוססים על חלבון רקומביננטי A/G/L. ההליך כולל ביטוי חיידקים, טיהור זיקה Ni-NTA וקישור קוולנטי של החלבון המטוהר למיקרוספירות פוליסטירן מותאמות קרבוקסיל באמצעות כימיה של EDC/NHS. החרוזים שנוצרים יכולים לקשור נוגדנים ממינים ותתי-מחלקות שונים, ומספקים כלי רב-שימושי וחסכוני לפיצוי פלואורסצנציה בציטומטריית זרימה.

השימוש במיקרוספירות שעברו התאמה מסחרית לקרבוקסיל מפשט משמעותית את התהליך הזה. במעב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים ואין להם מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר המדעי של ועדת החינוך של טיאנג'ין (2021KJ224).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AF647 Rat Ig2aביולג'נד141711
עכבר APC IgG1ביולג'נד353311
BL21(DE3) תאים מיומניםסאנגוןB528414
BSAסולרביולוגיהA8010
EDCתרמו פישר22980CAS: 1892-57-5
FITC אוגר ארמני IgGביולג'נד400905
אימידאזולסיגמא-אלדריץ'I202CAS: 288-32-4
IPTGGoldBioI2481CCAS: 367-93-1
Kanamycin סאנגוןA600286CAS: 8063-07-8
KClאלדיןP112134CAS: 7447-40-7
KH2PO4אלדיןP434010CAS: 7778-77-0
MESסיגמא-אלדריץ'M3671CAS: 145224-94-8
Na2HPO4אלדיןS274390CAS: 7558-79-4 
NaClאלדיןC111549CAS: 7647-14-5
ה-NHSתרמו פישר24500CAS: 6066-82-6
Ni NTA Beads 6FFמדעי החיים החכמיםSA005005
עכבר PE IgG2aביולג'נד362603
ProClean 300ביוטייםST853
Tris סיגמא-אלדריץ'252859CAS: 77-86-1 
טריפטוןאוקסואידLP0042
מסנן אולטרה צנטריפוגלי, 50 קילו-דלטון MWCOמיליפורUFC9050
מיקרוספירות קרבוקסיל פוליסטירן אחידותטומיקרו ביוטכנולוגיה10 מ"ל, 25 מ"ג/מ"לשנחאי, סין
תמצית שמריםאוקסואידLP0021

מקורות

  1. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2005).
  2. Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
  3. Bhowmick, D., Lowe, S. K., Ratliff, M. L. Side-by-side comparison of compensation beads used in polychromatic flow cytometry. Immunohorizons. 7 (12), 819-833 (2023).
  4. Szaloki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 982-985 (2015).
  5. Tang, H., et al. Economical and efficient protocol for isolating and culturing bone marrow-derived dendritic cells from mice. J Vis Exp. (185), e63125(2022).
  6. Sun, J., Kroeger, J. L., Markowitz, J. Introduction to multiparametric flow cytometry and analysis of high-dimensional data. Methods Mol Biol. 2194, 239-253 (2021).
  7. Blazer, L. L., Roman, D. L., Muxlow, M. R., Neubig, R. R. Use of flow cytometric methods to quantify protein-protein interactions. Curr Protoc Cytom. 53, 13.11-13.15 (2010).
  8. Zheng, Z., Chinnasamy, N., Morgan, R. A. Protein l: A novel reagent for the detection of chimeric antigen receptor (car) expression by flow cytometry. J Transl Med. 10, 29(2012).
  9. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), 612-620.e5 (2018).
  10. Patella, V., Casolaro, V., Bjorck, L., Marone, G. Protein l. A bacterial ig-binding protein that activates human basophils and mast cells. J Immunol. 145 (9), 3054-3061 (1990).
  11. Eliasson, M., et al. Chimeric igg-binding receptors engineered from staphylococcal protein a and streptococcal protein g. J Biol Chem. 263 (9), 4323-4327 (1988).
  12. Hattori, T., et al. Multiplex bead binding assays using off-the-shelf components and common flow cytometers. J Immunol Methods. 490, 112952(2021).
  13. Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic press. (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Protein A G LEDC NHS

מאמרים קשורים