שיטה פשוטה ספציפי הודגם תיוג פלורסנט וזיהוי מוגברת של חלבונים פני התא ללא צעד חלוקה. שפע דיפרנציאלי חלבונים פני התא נותח באמצעות אלקטרופורזה דו מימדי (2-D) ו Ettan טכנולוגיית ™ DIGE.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Labelling סלקטיבי של חלבונים על פני קרום התא באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי
במאמר זה
סיכום
תקציר
חלבונים Surface הם מרכזי ביכולתו של התא להגיב על סביבתו כדי אינטראקציה עם תאים שכנים. הם ידועים להיות מעוררים כל איתות של כמעט תאיים. יתרה מזאת, הם ממלאים תפקיד חשוב בהתאמת הסביבה טיפול תרופתי, לעתים קרובות מעורבים בהיווצרות המחלה והפתולוגיה (1). חלבונים הם אינטראקציות מהותי מסלולי איתות, ולקבל תובנה יותר אלה תהליכים ביולוגיים מורכבים, שיטות רגיש ואמין יש צורך ללמוד משטח חלבונים בתא. דו מימדי (2-D) אלקטרופורזה נעשה שימוש נרחב לגילוי של סמנים ביולוגיים ויעדים אחרים בדגימות חלבון מורכב ללמוד שינויים ההפרש. שטח פני התא חלבונים, בין היתר בשל שפע הנמוכה שלהם (1 2% של חלבונים תאיים), קשה לזהות בתוך ג'ל 2-D ללא חלוקה או סוג אחר של העשרה. לעתים קרובות הם גם ייצגו גרוע 2-D ג'לים בשל אופי הידרופובי שלהם משקל מולקולרי גבוה (2). במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול חדש של תאים שלמים באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי עבור תיוג זיהוי ספציפי של קבוצה חשובה זו של חלבונים. התוצאות הראו תיוג ספציפית של מספר רב של חלבונים פני התא עם תיוג מינימלי של חלבונים תאיים. פרוטוקול זה הוא מהיר, פשוט לשימוש, וכל שלושת CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי (סי 2, סי 3 וסי 5) ניתן להשתמש בתווית על פני קרום התא חלבונים. תכונות אלו מאפשרות ריבוב באמצעות 2-D ההבדל Fluorescence ג'ל אלקטרופורזה (2-D DIGE) עם טכנולוגיית DIGE Ettan וניתוח של שינויים בביטוי החלבונים באמצעות DeCyder 2-D ניתוח תוכנה דיפרנציאלי. רמת פני קרום התא חלבונים לוותה במהלך רעב סרום של תאים CHO עבור אורכי זמן שונים (ראה טבלה 1). שינויים קטנים שפע התגלו עם דיוק גבוה, והתוצאות נתמכים על ידי שיטות סטטיסטיות מוגדר.
פרוטוקול
תא תרבות
- לגדל אוגר סיני השחלות תאים (CHO-K1) באמצעות תקן תרבות נהלים תא בינוני F-12 חם עם GlutaMAX אני המכילה 10% נסיוב עגל עוברית, 50 U / ml פניצילין, ו -50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין סולפט (Invitrogen).
- הבורסה בינוני תרבות סרום ללא התקשורת. התא תווית חלבונים פני השטח היו בנקודות זמן שונות עם CyDye DIGE פלואוריד Cy3 או Cy5 צבעים מינימלי (ראה סעיף Cell Surface תיוג, להלן).
- בריכת מספר שווה של התאים מנקודת כל הזמן עם תווית CyDye DIGE פלואוריד Cy2. השתמש אלה כסטנדרט פנימי עבור ג'ל 2-D כל אחד.
- רוב הניסויים ניתן לבצע עם CHO-K1 תאים, אבל העובר עכבר fibroblasts (L1 3T3) ו מיימת עכבר לימפומה lymphoblasts (EL4) יכול גם בשימוש (מידע לא מוצג).
- לגדל את שני סוגי התאים האחרונים ב DMEM בינוני עם GlutaMAX השנייה, אבל, אחרת, השתמש התנאים זהים המשמשים את CHO-K1 תאים.
משטח נייד תיוג
- בזהירות לנתק תאים חסיד שאינו enzymatically, לספור חלוקת לתוך aliquots של x106 תאים 5-10. עבור תאים הגדלים ההשעיה, להשמיט את הצעד ניתוק.
- צנטריפוגה השעיות התא XG על 800 במשך 5 דקות. הסר את supernatants המכיל את המדיום.
- לשטוף את כדורי ידי resuspendion בתוך תמיסת מלח מאוזן 1 מ"ל קרח קר של האנק (HBSS) pH 8.5. Centrifuged ב XG 800 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 200 μl חיץ תיוג קרים כקרח (HBSS pH 8.5, 1 M אוריאה).
- לייבל בתאים שלמים עם 600 pmol CyDye צבעים DIGE פלואוריד מינימלית במשך 20 דקות על הקרח בחושך.
- להרוות את התגובה על ידי הוספת 20 μl 10 mM ליזין. דגירה במשך 10 דקות.
- שטפו את פני השטח שכותרתו תאים פעמיים resuspension ב-pH 500 HBSS μl 7.4, ואחריו צנטריפוגה ב XG 800 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
Cell ו תמוגה חלוקה
- Lyse את פני השטח שכותרתו תאים חיץ תמוגה μl 150 קרים (7 אוריאה M, 2 M thiourea, בחורים 4%, 30 מ"מ טריס, 5 mM מגנזיום אצטט pH 8.5). השאירו על הקרח עבור שעות לפחות 1 עם vortexing מזדמנים.
- צנטריפוגה lysates XG ב 000 10 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מעבירים את supernatant לצינור חדש. מדגם זה הוא מדגם שאינם מופרדים המכיל את כל חלבוני התא.
- במקביל, לשטוף כדורי התא, כאמור לעיל, fractionate אז (באמצעות ערכת חלוקה קרום, פירס) לתוך הממברנה שברים cytosolic לפני ג'ל אלקטרופורזה 2-D. חלק הממברנה מכילה פנימיים קרום התא חלבונים השטח.
- לשם השוואה, בצע את ההליך הסטנדרטי Ettan DIGE 3, lyse, התווית, ולבסוף, fractionate התאים. קביעת ריכוז חלבון בדגימות באמצעות 2 - ד קוואנט Kit (GE Healthcare).
2-D אלקטרופורזה
- רעננותם ג'לים Immobiline DryStrip, pH 3-11NL (24 ס"מ) באמצעות מגש DryStrip Immobiline Reswelling, 24 ס"מ 450 פתרון DeStreak μl Rehydration (0.5% IPG Buffer) לילה.
- החל את CyDye שכותרתו דגימות (המקביל ל 50 מיקרוגרם חלבון בסה"כ) כדי Immobiline ג'לים DryStrip ידי טעינת כוס anodic ב סעפת ולבצע התמקדות isoelectric (IEF) באמצעות Ettan IPGphor מערכת II IEF על פי ההוראות.
- לאחר IEF, לאזן את רצועות בשני שלבים ומקום על גבי (26 x 20 ס"מ) ג'לים גדול polyacrylamide 12.5% (SDS-PAGE). שכבת עם agarose 0.5% (בניהול מאגר המכיל כחול bromophenol). Run 2-D באמצעות אלקטרופורזה Ettan מערכת DALTtwelve אנכי גדול ב 5 W / ג'ל למשך 30 דקות ולאחר מכן ב 15 W / ג'ל עד בחזית לצבוע מגיע לתחתית הג'ל.
הדמיה וניתוח נתונים
- לאחר השלמת 2-D אלקטרופורזה, לסרוק את הג'לים עבור Cy2, Cy3 או Cy5 באמצעות Imager טייפון 9410 מצב משתנה.
- השווה מפות במקום שברים של הממברנה, שברים cytosolic, שאינם מופרדים באמצעות דגימות DeCyder 2-D ניתוח דיפרנציאלי תוכנה 4.
פוסט מכתים
- לאחר הדמיה, כסף הכתם ג'ל על פי הנוהל המקובל 5.
חלבון זיהוי
- לגדול, קציר, לרחוץ lyse כמויות preparative (כ 1 מ"ג חלבון הכולל 10 x106 בתאי CHO) של תאים, כפי שתואר לעיל למדגם הלא מופרדים. השתמש Cy5 פני התא מדגם שכותרתו (ראה לעיל) כמו ספייק, ולהחיל יחד עם כמויות תווית preparative של חלבון.
- ביצוע אלקטרופורזה 2-D כפי שתואר לעיל, אך הפעם, aplly תא 600 מיקרוגרם ללא תווית lysate יחד עם משטח 50 מיקרוגרם תא שכותרתו ספייק ידי יישום כוס anodic. השתמש בסמנים כדי לאפשר התייחסות לקטוף במקום הנכון, במקום להיותtween הזכוכית צלחות לפני יציקת ג'ל על פי המלצות 3.
- סרוק את הג'ל בערוץ Cy5 כדי לקבל את פני התא Cy5 נקודה במפה, ואחריו מכתים חלבון סך הכל באמצעות חלבון סגול עמוק כתם 3.
- התאמה יחד את שתי מפות נקודה באמצעות DeCyder 2-D התוכנה ליצור רשימה לבחור עבור כל המקומות המתאימים 5 סיי חלבונים השטח שכותרתו התא. פיק פני התא חלבונים באמצעות נקודה Ettan תחנת הטיפול, לחלץ את המצתים ג'ל, ו trypsinate באמצעות digester Ettan. זיהוי באמצעות MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה.
טבלה 1. DIGE Ettan הניסוי בוצע באמצעות דגימות מתאי מדולדל בסרום סומנו על פי הפרוטוקול על פני קרום התא חלבון תיוג באיור 1.
| מדגם | זמן של דלדול בסרום | מדביקים לו תווית עם CyDye | ג'ל מספר |
| 1 | - | סי 3, סי 2 | 1 |
| 2 | 30 דקות | סי 5, סי 2 | 1 |
| 3 | 2 שעות | סי 3, סי 2 | 2 |
| 4 | 4 שעות | סי 5, סי 2 | 2 |
| 5 | 16 שעות | סי 5, סי 2 | 3 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ריכוז חלבון
סקירה של שני workflows תיוג מוצג באיור 1. מאז התאים הם עדיין שלם שכותרתו כאשר על פי פרוטוקול פני קרום התא תיוג חלבון, רק פני חלבונים בתא נחשפים לצבוע. ב תקן Ettan DIGE פרוטוקול, התאים lysed לפני תיוג חלבונים בתוך כמו גם מחוץ לתא מסומנים (איור 1). הסכום היחסי של צבען חלבון הפרוטוקול על פני קרום התא תיוג החלבון אינו ידוע, שכן על פני קרום התא חלבונים לא ניתן ונרשמת במיוחד. עם זאת, ידוע כי חלבונים בתא השטח ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
אנו מודים פרופ Dontscho Kerjaschki, קורינה מיירהופר ו סיגורד קריגר במכון לפתולוגיה קלינית, אוניברסיטת וינה, אוסטריה על שיתוף הפעולה שלהם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | ריאגנט | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| ערכת כימות דו-ממדית (2-D Quant Kit) | ריאגנט | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| בופר IPG pH 3-11NL | ריאגנט | GE Healthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 ס"מ | ריאגנט | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | כלי | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| ערכת IPGbox | כלי | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| תמיסת רהידרציה של DeStreak | ריאגנט | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| נוזל כיסוי ל-Immobiline DryStrip | ריאגנט | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| יחידת IEF מדגם Ettan IPGphor 3 | מכשיר | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| סוללת Ettan IPGphor | רכיב מכשיר | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| מכשיר יציקת ג'לים Ettan DALTtwelve | כלי | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| יחידת הפרדה ויחידת ספק כוח/בקרה של Ettan DALTtwelve | מכשיר | GE Healthcare | 80-6466-46 | יחידה של 230 V: 80-6466-27 |
| מדמם בעל מצב משתנה Typhoon 9410 | מכשיר | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | מכשיר | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| מערכת עיכול Ettan | מכשיר | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | מכשיר | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | מכשיר | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| תוכנת DeCyder 2-D לניתוח דיפרנציאלי | אחר | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| תוכנת ניתוח ImageQuant | אחר | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| urea | ריאגנט | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | ריאגנט | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | ריאגנט | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| ברומופנול כחול | ריאגנט | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| טריס (Tris) | ריאגנט | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| סודיום דודציל סולפט (SDS) | ריאגנט | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | ריאגנט | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | ריאגנט | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | ריאגנט | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | ריאגנט | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | ריאגנט | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| הכנת דגימה דו-ממדית (2-D) עבור חלבונים מממברנה | ריאגנט | Pierce, Thermo Scientific | 89864 | |
| סטרפטומייצין סולפט | ריאגנט | Invitrogen | 15140-122 |
מקורות
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
