Name: Non-רדיואקטיבי באתרו הכלאה פרוטוקול ישים עבור נורווגיה Spruce ומגוון של מיני צמחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: למד פרוטוקול הכלאה באתרו לא רדיואקטיבי לביטוי גנים בצמחים. השיטה מותאמת לאשוחית נורווגית ומינים נוספים, עם שינויים בטיפול RNase ובחלבון K לתוצאות אופטימליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מאוד אנדרס Bovin שסיפק את המוזיקה לסרט שלנו על מניות מייקל אליוט להתנדבות להיות הקול הדובר. תמיכה סופק על ידי קרל Trygger קרן, תוכנית אסטרטגית המחקר Genomics פונקציונלית חקלאי (AgriFunGen) באוניברסיטת שוודית למדעי החקלאות, מועצת המחקר השוודי (VR), ומועצת המחקר השוודי לאיכות הסביבה, למדעי החקלאות, תכנון מרחבי (FORMAS ).

<ol><li>Carr, S. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+homeotic+gene+expression+defines+developmental+arrest+stages+in+Brassica+oleracea+L.+vars.+botrytis+and+italica%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica.</a> Planta. 201 (2), 179-188 (1997).</li>
<li>Coen, E. S., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+war+of+the+whorls%3A+genetic+interactions+controlling+flower+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development.</a> Nature. 353 (6339), 31-37 (1991).</li>
<li>Jackson, D. In situ hybridization in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJackson%2C+D+%22Molecular+Plant+Patology%3A+a+practical+approach%22">Molecular Plant Patology: a practical approach</a>. Gurr, S. J., McPherson, M. J., Bowles, D. J. , University Press. Oxford. (1991).</li>
<li>Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeitch%2C+AR+%22In+situ+hybridization%3A+a+practical+guide%22">In situ hybridization: a practical guide</a>. , BIOS Scientific Publishers Limited. Oxford. (1994).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li>
<li>Azevedo, H., Lino-Neto, T., Tavares, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+high-quality+RNA+isolation+from+needles+of+adult+maritime+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">An improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. , 333-338 (2003).</li>
<li>Sundstrom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MADS-box+genes+active+in+developing+pollen+cones+of+Norway+spruce+%28Picea+abies%29+are+homologous+to+the+B-class+floral+homeotic+genes+in+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genet%22%5BJournal%5D)">MADS-box genes active in developing pollen cones of Norway spruce (Picea abies) are homologous to the B-class floral homeotic genes in angiosperms.</a> Dev Genet. 25 (3), 253-266 (1999).</li>
<li>Tandre, K., Svenson, M., Svensson, M. E., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+gene+structure+and+activity+in+the+regulation+of+reproductive+organ+development+of+conifers+and+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Conservation of gene structure and activity in the regulation of reproductive organ development of conifers and angiosperms.</a> Plant J. 15 (5), 615-623 (1998).</li>
<li>Winter, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MADS-box+genes+reveal+that+gnetophytes+are+more+closely+related+to+conifers+than+to+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MADS-box genes reveal that gnetophytes are more closely related to conifers than to flowering plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (13), 7342-7347 (1999).</li>
<li>Savard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+and+nuclear+gene+sequences+indicate+late+Pennsylvanian+time+for+the+last+common+ancestor+of+extant+seed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chloroplast and nuclear gene sequences indicate late Pennsylvanian time for the last common ancestor of extant seed plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (11), 5163-5167 (1994).</li>
<li>Jack, T., Brockman, L. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeotic+gene+APETALA3+of+Arabidopsis+thaliana+encodes+a+MADS+box+and+is+expressed+in+petals+and+stamens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens.</a> Cell. 68 (4), 683-697 (1992).</li>
<li>Bowman, J. L., Smyth, D. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+directing+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Genes directing flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 1 (1), 37-52 (1989).</li>
<li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399 (6732), 144-148 (1999).</li>
<li>Sundstrom, J., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conifer+reproductive+development+involves+B-type+MADS-box+genes+with+distinct+and+different+activities+in+male+organ+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia.</a> Plant J. 31 (2), 161-169 (2002).</li>
<li>Carlsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+altered+expression+of+a+large+number+of+nuclear+genes+in+developing+cytoplasmic+male+sterile+Brassica+napus+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers.</a> Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).</li>
<li>Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+levels+of+meristem+identity+and+homeotic+genes+are+modified+by+nuclear-mitochondrial+interactions+in+alloplasmic+male-sterile+lines+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus.</a> Plant J. 42 (5), 731-742 (2005).</li>
<li>Ying, S., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technique+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The technique of in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).</li>
</ol>

שני היבטים של פ אשוח פרוטוקול היו אופטימיזציה לעומת A. thaliana / B. napus פרוטוקול, RNase טיפול וריכוז proteinase K. RNase מסיר אותות רקע ובכך מגביר את האות 17 סגוליות. הטיפול K proteinase יש צורך permeabilize הרקמות כך לחקור את יכולה להיכנס לבריכה להכליא RNA של עניין. Antisense DAL13 בדיקה נתן את האות גבוה ללא RNase הטיפול (איור 3C, E, G) לעומת סעיפים שטופלו RNase למשך 30 דקות (איור 2 ד, F ו-H). מאז RNase טיפול לא לשפר את האות הוא הוסר מן הפרוטוקול. הטיפול K proteinase נבדקו בשלושה ריכוזים שונים: 1, 3 ו - 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל. במקרה של פ אשוח אות נמוך או לא נצפתה באמצעות 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל proteinase K (איור 3C-D). איתות חזק הושג עם 3 מיקרוגרם הן / מ&quot;ל ​​(איור 3E-F) 5 ​​מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(איור 3G-H) proteinase ק מאז שום הבדל ניכר עוצמת האות נמצא בשימוש 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​proteinase K לעומת 3 מיקרוגרם / מ&quot;ל, בחרנו להשתמש 3 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בפרוטוקול שלנו. סביר להניח כי הצורך של ריכוז גבוה proteinase K ב פ האצטרובלים הזכריים אשוח לעומת A. thaliana ו-B ניצנים napus פרחוני בשל רקמת יותר קומפקטי עם רמות גבוהות יותר של phenolics ופוליסכרידים. במהלך קיבעון והטבעה כמה הבדלים בין א &#39; thaliana / B. napus פרוטוקול פ אשוח פרוטוקול ניכרים. הרקמה עניין קבוע לספק שמירה רנ&quot;א זה הוא שלב קריטי שכן חומרים קבועים גרוע עשוי לתת אות נמוכה או בלתי מורגשת אף mRNA הוא נרחב ביותר. רקמה היא התייבשות, מפונה מוטבע שעווה שינויים הדרגתיים כדי למנוע נזק לרקמות, ובחלק NaCl פרוטוקולים 0.85% מתווסף אתנול של התייבשות נוספת למנוע הצטמקות ונפיחות של התאים 3. צעד התייבשות במהלך הטבעה יכול להתבצע על קרח כדי לשמור על פעילות RNase לפחות. ב פ אשוח פרוטוקול לתקן את 4% פתרון paraformaldehyde מכיל glutaraldehyde 0.25%, שאמור לתת שימור טוב יותר RNA 17 אף כי יש הטוענים כי זה כנראה לא ישנה 3. לאחר חתך את החומר הוא קבוע על גבי שקופיות pretreated (כלומר dewaxed, rehydrated, permeabilized, טיפול להפחתת הלא ספציפית מחייב בדיקה ומיובש סוף סוף) לפני הכלאה. בפרוטוקול המובא כאן הליך זיהוי כל יכול להתבצע במעבדות רגילות, אות מתפתחת בדרך כלל בתוך 1-3 ימים ואת היחס בין אות על רקע יכול להיות במעקב רציף. DIG שכותרתו בדיקות בדרך כלל לתת איתות מובהק יותר לעומת בדיקות שכותרתו רדיואקטיבי, יציבים יותר, וניתן לעשות בה שימוש חוזר בניסויים עוקבים. מצד שני, רגישות מופחתת לעומת בדיקות רדיואקטיבית 17. הכלאה In situ מזהה ביטוי באמצעות תוויות בדיקה ספציפית mRNA מסוים. רדיו תיוג היא שיטת תיוג חזקים רגיש אבל זה דורש טיפול של רדיואקטיביות וזה לוקח כמה שבועות לפני התוצאות ניתן לאתרם. Antigen שכותרתו בדיקות מצד שני, הם יציבים יותר, מסוכנים פחות דורשים חשיפה בינונית גילוי לכמה ימים רק 17. לפיכך, אנטיגן תיוג שיטות כרגע שולט. השלב הקריטי ביותר ללא תלות בפרוטוקול הוא העיצוב בדיקה. יש להקפיד על מנת לוודא בדיקה יש סגוליות גבוהה התווית UTPs באיכות גבוהה. לפעמים הטמפרטורה הכלאה ו / או אורך התגובה צריך להיות מותאם בדיקות ספציפיות. פרוטוקול שונה שלנו מבוסס על DIG שכותרתו בדיקות יקל לוקליזציה של ביטוי mRNA בו זמנית מינים החל א thaliana ל פ אשוח, ויש עם שינויים קלים להיות שמיש בכל מיני צמחים אחרים. יש פרוטוקול, ליד האצטרובלים הזכריים, גם נבדק על שלבים שונים של צמח יורה ועל שניהם עוברים zygotic ו סומטיים מ פ אשוח עם תוצאות טובות (תוצאות לא פורסם;. Karlgren ואח&#39;).

<table><tbody><tr><td>אצטיל אנהידריד (Acetic anhydride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6404-200ml</td><td>מינימום 98%</td></tr><tr><td>אקרילאמיד, ליניארי (Acrylamide, linear)</td><td>Ambion</td><td>9520</td><td></td></tr><tr><td>נוגדני Anti-DIG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ריאגנט חסימה (Blocking reagent)</td><td>Roche Group</td><td>11 175 041 910 or 11 096 176 001</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין מסרום בקר (Bovine serum albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-50g</td><td>מינימום 98%</td></tr><tr><td>פורממיד דה-יוני (Deionized formamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת דנהרט (Denhardts solution)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532-5ml</td><td></td></tr><tr><td>DEPC, דיאתילפירוקרבונט (diethylpyrocarbonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דקסטראן סולפט (Dextran sulfate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכה לסימון RNA ב-DIG (SP6/T7)</td><td>Roche Group</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>גלוטראלדהיד (25%)</td><td>Histolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן (Glycogen)</td><td>Ambion</td><td>9510G</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear II</td><td>Histolab</td><td></td><td>ניתן להשתמש ב-Tissue-clear, Histoclear II, קסילן או בחומר דומה בעת הטמעת הרקמה.</td></tr><tr><td>Histowax</td><td>Histolab</td><td></td><td>ניתן להשתמש ב-Histowax או ב-Paraplast לצורך הטמעה.</td></tr><tr><td>פראפורמלהיד (Paraformaldehyde)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500g</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683-1kg</td><td>ניתן להשתמש ב-Histowax או ב-Paraplast לצורך הטמעה.</td></tr><tr><td>DNA Polymerase בעלת נאמנות גבוהה Phusion&amp;#8482;</td><td>Finnzymes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שקופיות Probe-on Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K (Proteinase K)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-5mg</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-clear</td><td>Sakura Finetek</td><td></td><td>ניתן להשתמש ב-Tissue-clear, Histoclear II, קסילן או בחומר דומה בעת הטמעת הרקמה.</td></tr><tr><td>טריאתנולאמין (Triethanolamine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1377-100ml</td><td>מינימום 98%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>השתמשו במוצר הסטנדרטי במעבדה שלכם</td><td></td><td>השתמשו ב-Triton X-100, ב-Tween-20, או בשניהם.</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83853-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>השתמשו במוצר הסטנדרטי במעבדה שלכם</td><td></td><td>השתמשו ב-Triton X-100, ב-Tween-20, או בשניהם.</td></tr><tr><td>Western Blue</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-רדיואקטיבי באתרו הכלאה פרוטוקול ישים עבור נורווגיה spruce ומגוון של מיני צמחים

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

תפוקה גבוהה ניתוח טכנולוגיות ביטוי הזמינים כיום לתת למדענים הצפת פרופילים הביטוי אך ההחלטה שלהם במונחים של הביטוי רקמות ספציפיות מוגבל בגלל בעיות לנתח רקמות הפרט. נתונים הביטוי צריך להיות אישר השלימו עם דפוסי ביטוי באמצעות למשל הכלאה באתרו, טכניקה המשמשת למקם mRNA התא ביטוי ספציפי. בשיטת הכלאה באתרו הוא מייגע, זמן רב ולעיתים קרובות דורש אופטימיזציה נרחב בהתאם מינים ורקמות. בניסויים באתרו יחסית קשה יותר לבצע מינים עציים, כגון נורווגיה כוניפאר אשוחית (Picea אשוח). כאן אנו מציגים DIG שונה בפרוטוקול הכלאה באתרו, אשר הוא מהיר החלים על מגוון רחב של מיני צמחים כולל פ אשוח. עם רק כמה התאמות, כולל שינה RNase טיפול וריכוז proteinase K, אנחנו יכולים להשתמש בפרוטוקול ללמוד ביטוי רקמות ספציפיות של גנים הומולוגיים איברי הרבייה הגברית gymnosperm אחד ושני מינים angiosperm: פ אשוח, thaliana ארבידופסיס ו Brassica napus. פרוטוקול עבדו באותה מידה עבור מינים גנים למד. AtAP3 ו BnAP3 נצפו השני והשלישי איברים פרחים במערבולת א &#39; thaliana ו-B napus ו DAL13 ב microsporophylls של האצטרובלים הזכריים מ פ אשוח. עבור פ אשוח K proteinase ריכוז, המשמש permeablize הרקמות, היה צריך להיות גדל ל 3 גרם / מ&quot;ל במקום 1 גרם / מ&quot;ל, ככל הנראה בשל רקמות יותר קומפקטי רמות גבוהות יותר של phenolics ופוליסכרידים. עבור כל המינים הטיפול RNase הוסר בשל עוצמת האות מופחת ללא גידול מקביל סגוליות. על ידי השוואת ספציפיים רקמות ביטוי דפוסים של גנים הומולוגיים משני הצמחים ועץ מחטניים אנו מראים כי ה-DIG בפרוטוקול באתרו שהוצגו כאן, רק עם שינויים מזעריים, ניתן ליישם במגוון רחב של מיני צמחים. לפיכך, פרוטוקול נמנע גם אופטימיזציה של מינים ספציפיים נרחב ושימוש מייגע של בדיקות שכותרתו רדיואקטיבית לטובת בדיקות DIG שכותרתו. בחרנו להדגים את השלבים טכנית בדרישה של פרוטוקול בסרט שלנו. אנה Karlgren וג&#39;ני Carlsson תרמו באופן שווה על מחקר זה. המחברים מקבילים: אנה Karlgren ב Anna.Karlgren @ ebc.uu.se ו Jens Sundström פ ב Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

אנו מתארים DIG שונה<em&gt; באתרו</em&gt; פרוטוקול הכלאה, אשר הוא מהיר החלים על מגוון רחב של מיני צמחים כולל נורבגיה אשוח. עם רק כמה התאמות, כולל שינה RNase טיפול וריכוז proteinase K, הפרוטוקול ניתן להשתמש במחקרים של רקמות מינים שונים.

Non-רדיואקטיבי באתרו הכלאה פרוטוקול ישים עבור נורווגיה Spruce ומגוון של מיני צמחים

טכנולוגיות ניתוח הביטוי בעלת התפוקה הגבוהה הזמינות כיום מספקות למדענים שפע של פרופילי ביטוי, אך הרזולוציה שלהם במונחים של...

פרוטוקול היברידיזציה באתר (in situ hybridization) לא רדיואקטיבי שניתן ליישום עבור אשוח נורווגי ומגוון מיני צמחים. Carre Etal. שלום, שמי AM GaN, ואנו עובדים באוניברסיטת OBS ובאוניברסיטה השוודית למדעי החקלאות ב-obs שוודיה.ביססנו פרוטוקול ביקור בתוך רקמה (inset visitation) הפועל על מספר מיני צמחים שונים. היום נדגים לכם כמה מהשלבים המאתגרים. בפרוטוקול זה, נציג לכם את שלבי ההטמעה (embedding), החיתוך (sectioning) ושלבים שונים בניסוי ביקור הרקמה בפועל.נעבור למעבדה אחת, שלבי קיבוע והטמעה 9 עד 11 בפרוטוקול. שלב 9, חימום מוקדם של צלחות פטרי ותבניות ל-60 °C. שלב 10, חימום פינצטה ופיזור הרקמות באופן שווה בצלחת.הוסיפו עוד שעוות היסטולוגית כך שהרקמות יהיו מכוסות. בשלב 11, הניחו לשעווה להתקשות בטמפרטורת החדר. בצעו את שלבים 12 עד 19 בפרוטוקול.הפעילו את לוחות החימום והכינו שעוות היסטולוגיה מומסת. הוציאו את הדגימות מהחדר הקר. בשלב 13, השתמשו בסכין מנתחים כדי לחתוך בזהירות בלוק שעווה של רקמה.עצבו את החתיכה כדי להקל על הפריסה. שלב 14, חממו את הבלוק ואת העקב והמיסו אותם יחד. הניחו לדגימה להתקשות בטמפרטורה של 4 °C.שלב 15, חתכו את בלוק השעווה לחתכים בעובי של ששה עד שמונה מיקרומטר. באמצעות מיקרוטום, החתכים מקושרים לסרט אחד ארוך. חתכו את הסרט והעבירו אותו לנייר.בשלב זה, ניתן לבחון את החתכים הבודדים תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לבחור את החתכים הרלוונטיים. הבחינה תהיה קלה יותר עם רקמות או כאלו שנצבעו ב-eosin. שלב 17: טפטפו מי Milli Q נקיים מ-RNA על השקופיות.גזרו את הסרט לחלקים קטנים יותר והניחו אותם על העגיות. העבירו את העגיות לפלטה החמה. שלב 17, אפשרו לסרטים להישטח על פלטה בטמפרטורה של 42 °C למשך דקה עד שתי דקות.סננו את המים באמצעות נייר סופג (Kimwipe). בשלב 19, דגרו את השקופיות בטמפרטורה של 42 °C למשך לילה כדי שהרקמות יידבקו לשקופיות עבור היברידיזציה in situ 4.1 חיתוך in-situ. שלבי טיפול מקדים 36 עד 48 בפרוטוקול.שלב 36: דפראקציה (deparaffinization) של חתכים בשכבת היסטולוגיה. השקופיות מרווחות באופן שווה ומונחות במעמד כדי להקל על התנועה בין המכלים השונים, לאחר מכן מייבשים את החתכים. בסדרה של אתנול, מוסיפים acetic anhydrate תוך כדי ערבוב נמרץ.שלב 45, הכנה לטיפול באצטט אנהידריד 4.2 היברידיזציה in situ. שלבים 49 עד 52 בפרוטוקול. שלב 51, יישון של שקופיות pro one plus.התמיסה צמיגית. יש לנסות להימנע מהיווצרות בועות. יש לדגור את השקופיות בתא לחות.4.3 אתחול. לאחר ההיברידיזציה, בצעו את שלבים 53 עד 72 בפרוטוקול. בשלב 62, דגרו את השקופיות עם בלוק החסימה (buffer block) בתוך מכל פלסטיק.שלב 63, הוסיפו תמיסת חסימה בכמות המספיקה לכיסוי השקופיות. הנוגדנים מתווספים לשקופיות באמצעות יישון (aging). היישון עובד רק עם שקופיות מסוג prob bon plus. עבור שקופיות בעיצוב דומה, שלב 65, אפשרו לכוחות קפילריים למשוך למעלה את תמיסת הנוגדן anti dig.שלב זה חוזר על עצמו. שלב 70, כפי שנעשה קודם לכן, יש לבצע "סנדוויץ'" ולשאוב את תמיסת ה-Western blue. שימו לב שתמיסת ה-Western blue נשאבת פעמיים, בדיוק כפי שעשינו עבור תמיסת הנוגדן anti-dig.ובשלב 65, שלב 71 הדגירה של השקופיות תתבצע בחשיכה למשך יום אחד עד חמישה ימים. בטמפרטורת החדר, ניתן לבצע ניטור של אותות ההיברידיזציה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. בעוד השקופיות עדיין דחוסות זו לזו, ניתן להבחין בכתמים בצבע סגול עד חום.כך נראות התוצאות מהניסוי בתחנת CW. ניתן לראות כאן את האות כצביעה סגולה או חומית.

non-radioactive-situ-hybridization-protocol-applicable-for-norway

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

פרוטוקול זה משמש בהצלחה כמותית לזהות רמות ודפוסים מרחביים של ביטוי mRNA של מספר סוגי רקמות על פני בעלי החוליות. השיטה יכולה לזהות תעתיקי שפע נמוך ומאפשר עיבוד של מאות שקופיות בו זמנית. אנו מציגים את הפרוטוקול באמצעות פרופיל הביטוי של היווצרות העופות המוח העוברי כדוגמה.

רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות

על ידי שילוב של כל שיטות להר...

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

אנו מתארים כאן הקרינה פשוטה בשיטת הכלאה באתר (FISH) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים ברקמות חרקים וצמחים. פרוטוקול זה יכול להתארך להדמיה של ה-mRNA בהר שלם וחתכים מיקרוסקופיים.

פלואורסצנציה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאות (דגים) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים Endosymbiotic בצמח ורקמות חרקים

פרוטוקול זה מתאר שיטת חיתוך רקמות פשוטה של חיתוך היברידי שימושית עבור רקמות צמחים סרבניות. קטעי רקמה באיכות טובה מאפשרים מחקרים אנטומיים ומחקרים ביולוגיים אחרים כולל הכלאה באתרה (ISH).

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

בעיות בעיבוד דגימות ביולוגיות לתצפית מיקרוסקופ אלקטרונים סורק כוללות קריסת תאים, טיפול בדגימות ממיקרו-סביבות רטובות והרס תאים. פרוטוקולים בעלות נמוכה ומהירים יחסית המתאימים להכנת דגימות מאתגרות כגון מריסטמים פרחוניים, ציסטות אומיצט ופטריות (Agaricales) נאספים ומפורטים כאן.

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק הפרוטוקולים (SEM) עבור בעייתי הצמח, Oomycete, וכן דוגמאות פטרייתיים

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתית (SBEM) מוחלת על תמונה ולנתח קוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס המורין.

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה טורית של פרצוף בלוק (SBEM) לחקר קוצים דנדריטים

פרוטוקול זה מציע תהליך עבודה יעיל להדמיית מיקרוסקופיה בלוקליזציה בודדת של גרעיני ארבידופסיס מבודדים, תוך שימוש בבידוד, קיבוע ותיוג אופטימליים להשגת ויזואליזציה ננומטרית אמינה של כרומטין ו-RNA פולימראז II. גישה זו ניתנת להתאמה קלה לחלבונים אחרים הקשורים לכרומטין או לשינויים בהיסטונים להדמיה ברזולוציה גבוהה.

פרוטוקול יעיל למיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת בגרעעיני ארבידופסיס

למד פרוטוקול הכלאה באתרו לא רדיואקטיבי לביטוי גנים בצמחים. השיטה מותאמת לאשוחית נורווגית ומינים נוספים, עם שינויים בטיפול RNase ובחלבון K לתוצאות אופטימליות.

Non-רדיואקטיבי באתרו הכלאה פרוטוקול ישים עבור נורווגיה Spruce ומגוון של מיני צמחים

גלה סרטונים נוספים