Non-רדיואקטיבי באתרו הכלאה פרוטוקול ישים עבור נורווגיה Spruce ומגוון של מיני צמחים
17 באפריל 2009
אנו מתארים DIG שונה באתרו פרוטוקול הכלאה, אשר הוא מהיר החלים על מגוון רחב של מיני צמחים כולל נורבגיה אשוח. עם רק כמה התאמות, כולל שינה RNase טיפול וריכוז proteinase K, הפרוטוקול ניתן להשתמש במחקרים של רקמות מינים שונים.
פרוטוקול היברידיזציה באתר (in situ hybridization) לא רדיואקטיבי שניתן ליישום עבור אשוח נורווגי ומגוון מיני צמחים. Carre Etal. שלום, שמי AM GaN, ואנו עובדים באוניברסיטת OBS ובאוניברסיטה השוודית למדעי החקלאות ב-obs שוודיה.
ביססנו פרוטוקול ביקור בתוך רקמה (inset visitation) הפועל על מספר מיני צמחים שונים. היום נדגים לכם כמה מהשלבים המאתגרים. בפרוטוקול זה, נציג לכם את שלבי ההטמעה (embedding), החיתוך (sectioning) ושלבים שונים בניסוי ביקור הרקמה בפועל.
נעבור למעבדה אחת, שלבי קיבוע והטמעה 9 עד 11 בפרוטוקול. שלב 9, חימום מוקדם של צלחות פטרי ותבניות ל-60 °C. שלב 10, חימום פינצטה ופיזור הרקמות באופן שווה בצלחת.
הוסיפו עוד שעוות היסטולוגית כך שהרקמות יהיו מכוסות. בשלב 11, הניחו לשעווה להתקשות בטמפרטורת החדר. בצעו את שלבים 12 עד 19 בפרוטוקול.
הפעילו את לוחות החימום והכינו שעוות היסטולוגיה מומסת. הוציאו את הדגימות מהחדר הקר. בשלב 13, השתמשו בסכין מנתחים כדי לחתוך בזהירות בלוק שעווה של רקמה.
עצבו את החתיכה כדי להקל על הפריסה. שלב 14, חממו את הבלוק ואת העקב והמיסו אותם יחד. הניחו לדגימה להתקשות בטמפרטורה של 4 °C.
שלב 15, חתכו את בלוק השעווה לחתכים בעובי של ששה עד שמונה מיקרומטר. באמצעות מיקרוטום, החתכים מקושרים לסרט אחד ארוך. חתכו את הסרט והעבירו אותו לנייר.
בשלב זה, ניתן לבחון את החתכים הבודדים תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לבחור את החתכים הרלוונטיים. הבחינה תהיה קלה יותר עם רקמות או כאלו שנצבעו ב-eosin. שלב 17: טפטפו מי Milli Q נקיים מ-RNA על השקופיות.
גזרו את הסרט לחלקים קטנים יותר והניחו אותם על העגיות. העבירו את העגיות לפלטה החמה. שלב 17, אפשרו לסרטים להישטח על פלטה בטמפרטורה של 42 °C למשך דקה עד שתי דקות.
סננו את המים באמצעות נייר סופג (Kimwipe). בשלב 19, דגרו את השקופיות בטמפרטורה של 42 °C למשך לילה כדי שהרקמות יידבקו לשקופיות עבור היברידיזציה in situ 4.1 חיתוך in-situ. שלבי טיפול מקדים 36 עד 48 בפרוטוקול.
שלב 36: דפראקציה (deparaffinization) של חתכים בשכבת היסטולוגיה. השקופיות מרווחות באופן שווה ומונחות במעמד כדי להקל על התנועה בין המכלים השונים, לאחר מכן מייבשים את החתכים. בסדרה של אתנול, מוסיפים acetic anhydrate תוך כדי ערבוב נמרץ.
שלב 45, הכנה לטיפול באצטט אנהידריד 4.2 היברידיזציה in situ. שלבים 49 עד 52 בפרוטוקול. שלב 51, יישון של שקופיות pro one plus.
התמיסה צמיגית. יש לנסות להימנע מהיווצרות בועות. יש לדגור את השקופיות בתא לחות.
4.3 אתחול. לאחר ההיברידיזציה, בצעו את שלבים 53 עד 72 בפרוטוקול. בשלב 62, דגרו את השקופיות עם בלוק החסימה (buffer block) בתוך מכל פלסטיק.
שלב 63, הוסיפו תמיסת חסימה בכמות המספיקה לכיסוי השקופיות. הנוגדנים מתווספים לשקופיות באמצעות יישון (aging). היישון עובד רק עם שקופיות מסוג prob bon plus. עבור שקופיות בעיצוב דומה, שלב 65, אפשרו לכוחות קפילריים למשוך למעלה את תמיסת הנוגדן anti dig.
שלב זה חוזר על עצמו. שלב 70, כפי שנעשה קודם לכן, יש לבצע "סנדוויץ'" ולשאוב את תמיסת ה-Western blue. שימו לב שתמיסת ה-Western blue נשאבת פעמיים, בדיוק כפי שעשינו עבור תמיסת הנוגדן anti-dig.
ובשלב 65, שלב 71 הדגירה של השקופיות תתבצע בחשיכה למשך יום אחד עד חמישה ימים. בטמפרטורת החדר, ניתן לבצע ניטור של אותות ההיברידיזציה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. בעוד השקופיות עדיין דחוסות זו לזו, ניתן להבחין בכתמים בצבע סגול עד חום.
כך נראות התוצאות מהניסוי בתחנת CW. ניתן לראות כאן את האות כצביעה סגולה או חומית.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול שונה של היברידיזציה in situ מסוג DIG, אשר הוא יעיל וניתן להתאמה למגוון מיני צמחים, כולל אשוח נורווגי. הפרוטוקול כולל התאמות ספציפיות, כגון שינויים בטיפול ב-RNase ובריכוז של proteinase K, כדי לשפר את יכולת היישום שלו ברקמות ובמינים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של הצמח
- ביולוגיה מולקולרית
- טכניקות של היברידיזציה in situ
רקע
- היברידיזציה במקום (In situ hybridization) היא טכניקה בעלת ערך לבחינת ביטוי גנים ברקמות.
- שיטות מסורתיות עלולות להיות גוזלות זמן ותלויות במין ספציפי.
- שינויים בפרוטוקולים קיימים יכולים לשפר את היעילות ואת הרב-גוניות.
- מחקר זה מתמקד בפרוטוקול המתאים למגוון מיני צמחים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול היברידיזציה in situ מהיר וסתגלן יותר.
- הדגמת השמישות של הפרוטוקול עבור אשוח נורווגי ומיני צמחים אחרים.
- אספקת שלבי ביצוע מפורטים עבור חוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הטמעה וחיתוך של רקמות צמחים.
- שלבי קדם-טיפול והיברידיזציה לצורך אנליזה in situ.
- שימוש בריאגנטים ובתנאים ספציפיים לאופטימיזציה של התוצאות.
- ניטור של אותי היברידיזציה תחת מיקרוסקופ.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול המעודכן מקל בהצלחה על ביצוע היברידיזציה במקום (in situ hybridization) במגוון מיני צמחים.
- התאמות בטיפול ב-RNase ובריכוז של proteinase K משפרות את התאימות לרקמות.
- הושגה ויזואליזציה ברורה של אותות ההיברידיזציה.
- הפרוטוקול יעיל וניתן לשחזור עבור יישומים שונים.
מסקנות
- פרוטוקול ההיברידיזציה באתר (in situ hybridization) המשופר באמצעות DIG הוא כלי בעל ערך למחקר בצמחים.
- הוא מאפשר ניתוח מהיר ואפקטיבי של ביטוי גנים ברקמות צמחים מגוונות.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על פרוטוקול זה ליישומים נרחבים יותר בביולוגיה של הצומח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ניתוח ביטוי גנים מרחבי ברזולוציה גבוהה במערכות צמחים, ותומך בתיקוף מטרות בשלבי גילוי מוקדמים על ידי אישור דפוסי ביטוי ספציפיים לרקמה. הוא מפחית את ההסתמכות על רדיו-איזוטופים ועל אופטימיזציה נרחבת הספציפית למין, ובכך משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) עבור מחקרים השוואתיים בין מינים. השיטה מספקת ערך של הפחתת סיכונים מכניסטית עבור סריקה פנוטיפית וגילוי סמנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים בקווי ייצור של ביו-פארמה מבוססי צמחים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאשר לוקליזציה של mRNA ספציפית לרקמה כדי לבחון היפותזות טיפוליות ולהבהיר את תפקוד הגנים במסלולי התפתחות רבייית.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות ויזואליזציה ישירה של ביטוי גנים באיברי רבייה זכריים במודלים של Gymnosperms ו-Angiosperms.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון הניבוי על ידי הדגמת דפוסי ביטוי שמורים של גנים הומולוגיים (למשל, הומולוגים של AP3) במבנים פרחוניים של Arabidopsis, Brassica ו-Norway spruce.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת חתכי רקמה סטנדרטיים לבדיקות היברידיזציה בהמשך, עם זיהוי אות עקבי באמצעות גשושים המסומנים ב-DIG.
- שחזוריות: ביטול הטיפול ב-RNase והתאמת ריכוז ה-proteinase K לשיפור עוצמת האות והפחתת השונות בין מינים שונים.
- יכולת הרחבה: מאפשר יישום בתפוקה גבוהה על פני מיני צמחים מגוונים עם התאמות מינימליות לפרוטוקול, מה שמאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה בגנומיקה השוואתית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מדגים ישימות ממודלים של צמחים מסתובבים (angiosperms) לצמחים עירומים (gymnosperms), ובכך תומך בהשלכת הממצאים למערכות רב-שנתיות עציות הרלוונטיות לייצור ביומסה וביופולימרים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מפחית את העמימות בהשמה של תפקודי גנים על ידי קישור הומולוגיה של רצפים לביטוי מרחבי במבנים התפתחותיים שמורים.
- הלימה של סממנים ביולוגיים: מאפשר מתאם מרחבי של ביטוי גנים עם תכונות פנוטיפיות ברקמות רבייה, ובכך תומך בגילוי סממנים ביולוגיים בחקלאות מולקולרית של צמחים.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בשלב הביולוגיה הגילויית, ומאפשרת זיהוי מטרות מונחה-השערה לפני סריקת תרכובות מובילות במערכות ביטוי מבוססות צמחים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות באמצעות תיקוף הביטוי המרחבי של גנים מועמדים ברקמות ספציפיות ובשלבי התפתחות שונים.
- סריקה: מייצרת תוצאות מרחביות כמותיות המשמשות לתכנון בדיקות לניטור השפעת תרכובות ברקמות טרנסגניות או מטופלות.
- אנליטיקה: מייצרת אותות כרומוגניים גלויים (סגול עד חום) המתאימים לדימוי ולניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תבניות ביטוי גנים לפנוטיפים התפתחותיים באיברי הרבייה, ובכך תומכת בהחלטות קידום במסלולי תיקוף תכונות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת תזרים עבודה סטנדרטי וסתגלן לניתוח ביטוי גנים בין מינים שונים, ובכך מפחיתה מאמצי אופטימיזציה כפולים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה באמצעות זיהוי ישיר של mRNA ברזולוציה מרחבית, ללא סכנות רדיואקטיביות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות על ידי ביטול הטיפול ב-RNase וסטנדרטיזציה של השימוש ב-proteinase K, ובכך מפחית את שיעורי הכישלון של הפרוטוקול.
- ערך אסטרטגי: מאיץ החלטות go/no-go בבחירת מטרות על ידי אספקת נתוני ביטוי חד-משמעיים בשלב מוקדם של תהליך הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון בהתבסס על תבניות ביטוי שמורות בין מינים, ובכך משפר את שיעורי ההצלחה ביישומים המשכיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהיסטולוגיה, הטמעה של רקמות וחיתוך של חומרים צמחיים.
- תלוי בגישה למיקרוטומים, תנורי היברידיזציה ומערכות גילוי כרומוגניות.
- מחייב סטנדרטיזציה של ריכוז proteinase K בהתבסס על צפיפות הרקמה ותכולת הפנולים.
- כולל התאמה של זמני וטמפרטורות האינקובציה עבור מינים שונים ואורכי פרוbes שונים.
- מוגבל על ידי אוטופלורסצנציה של הרקמה וחדירות של תרכובות בדגימות בעלות ליגניפיקציה גבוהה או עשירות במטבוליטים משניים.
