מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה
25 ביוני 2009
במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת חיים replicative טווח של תאים אמא שמרים.
השמר השמרנית *Saccharomyces cerevisiae* שימש באופן נרחב לחקר הביולוגיה של ההזדקנות. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול כללי למדידת תוחלת החיים הרפליקטיבית של תאי אם של שמרים. שלום, אני קריסטן סטפן מהמעבדה של בריאן קנדי במחלקה לביוכימיה באוניברסיטת וושינגטון.
היום נדגים בפניכם פרוצדורה למדידת תוחלת החיים השכפולית של תאי אם של שמרים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור גנים המשפיעים על תוחלת החיים של תאי שמרים. אז בואו נתחיל.
עבור ניסוי אורך החיים השכפולי והכנת תאי שמרים לניתוח אורך חיים, יש להכין מצעי YEPD מוצקים. השתמשו בטכניקה סטרילית מתאימה להכנת מצעי אגר YEPD אלו. הכינו לפחות שני מצעים עבור כל ארבעה עד חמישה זנים שייבחנו בניסוי אורך החיים.
יש להכין את המצעים הללו לפחות יומיים לפני ניסוי תוחלת החיים ולאפשר להם להתייבש לפני תחילת הבדיקה. אם הניסוי לא יתבצע תוך ארבעה עד חמישה ימים מיציקת המצעים, יש לעטוף אותם ב-para film או בניילון ולהניחם באינקובטור מקורר כדי למנוע התייבשות. הוצא את זני השמרים מהמלאים הקפואים ובצע מריחה לקבלת מושבות בודדות.
על צלחות אגר YEPD. ניתן לזרוע בקלות עד שישה זנים על אותה צלחת YEPD על ידי חלוקת הצלחת לפרוסות דמויות פלחים בגודל שווה. דגרו את התאים בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים.
לאחר הדגירה, הוצא את התאים מהאינקובטור והעבר תאים מקולוניה בודדת לצלחת YEPD טרייה. בשלב זה, יש לסמן את הזנים המיועדים לניתוח כדי להבטיח שניסוי אורך החיים השכפולי יבוצע באופן עיוור, כך שהמנתחים לא ידעו את זהות הזנים הבודדים.
בשלב הבא, דגרו את התאים המצופים שסודרו בבטבלה בטמפרטורה של 30 °C עד למחרת בערב. הוציאו את התאים והעבירו בבטבלה (patch) בעדינות תאים מכל זן מצופה לצלחות YEPD טריות. אלו ישמשו כצלחות הניסוי שבהן יימדד אורך החיים השכפולי (replicative lifespan).
יש להעביר את תאי הניתוח בקו אנכי בצדו השמאלי של מצע ה-YEPD. אין להעביר תאים רבים מדי למצע YEPD טרי בודד. מכיוון שפעולה זו תגרום לצמיחה עבה של התאים במהלך הדגירה בלילה ותשפיע על אורך חייהם הרפליקטיבי, מספר אופטימלי של כשלושה עד חמישה פאטצ'ים למצע הוא המומלץ.
בהנחה שניתוח אורך חיים רפליקטיבי יבוצע על 20 תאים מכל פאטץ', כעת ניסוי אורך החיים מוכן במלואו וכל שעליהם לעשות הוא לדגרה למשך הלילה על משטח העבודה. ומחר נוכל להתחיל במיקרו-דיסקציה כדי למקם את תאי השמרים על הפיתח ולהשיג תאי בת בתולים לצורך ניתוח אורך חיים רפליקטיבי.
השתמשו במיקרוסקופ המצויד במכשיר למיקרו-דיסקציה המתאים לשמרים. העבירו כ-50 תאים מהזן שבפטץ' הראשון למיקום על הפלטה המרוחק מהתאים שהועברו. אם במה המיקרוסקופ שלכם מדורגת, ניתן להשתמש בסימונים אלו כדי להבטיח שהתאים יהיו קלים לאיתור במהלך חזרות עוקבות.
לעתים תאים עלולים להיתקע במחט, דבר שעלול להוות בעיה אם הם ישתחררו בזמן שגוי. כדי לוודא שהמחט נקייה ותיקח ללא תאים, יש לגעת בה שוב ושוב במשטח האגר. לאחר מכן, צרו חור באגר על ידי דחיקת המחט דרך משטח האגר.
חור זה ישמש כסימן להכוונתכם על הפלטה במהלך סבבי הדיסקציה והסרת תאי הדוטר (dotter cells) הבאים. היזהרו שלא יחדרו תאי שמרים לחור, שכן הם יגדלו וייצרו מושבה ישירות מעליו. יישרו אנכית תאי שמרים בודדים ב-20 מיקומים במרווחים שווים, עם מרחק של קוטר מחט אחד עד שלושה בין מיקום תא אחד למשנהו.
עבור כל כמה תאים, מקמו שני תאים זה לצד זה באותה עמדה בקו, במקום תא אחד. הדבר מאפשר יתירות במהלך בחירת תאי בת בתוליים. אם אחד התאים שהועברו אינו מתחלק בין העמדה ה-10 ל-11 בקו, צרו סדרה אופקית של שבעה עד שמונה חורים באגר.
פעולה זו תשמש כסימון להכוונתכם על הצלחת במהלך דיסקציות עוקבות והסרות של תאי בת. שוב, היזהרו שלא להכניס תאי שמרים לחורים, שכן הם יגדלו ויהפכו למושבה. חזרו על הליך זה עבור כל טלאי על הצלחת, תוך המשך סידור התאים בצורה אנכית לאורך אותו ציר.
חשוב לזכור בעת יצירת החור ב-AER כי מספר החורים שנוצרים צריך להתאים למספר ה-patch, כך שיהיה חור אחד עבור ה-patch הראשון, ושני חורים עבור השני. לאחר שסידרו את התאים במערך עבור כל patch, יש לכסות את הפלטה ב-Parafilm ולהדגיר בטמפרטורה של 30 °C למשך כשעתיים. זכרו, מהנקודה זו והלאה, יש לכסות את כל הפלטות ב-Parafilm, למעט בעת ביצוע הדיסקציה.
על מנת למנוע התייבשות, חזור על הליך זה עבור כל צלחת. בניסוי, עבור ניתוח תוחלת החיים, חשוב לוודא שכל תא מתחיל כתא בת בתולי.
כדי לבצע זאת, ראשית הוציאו את הצלחות מהאינקובטור וודאו שרוב תאי המערך עברו חלוקה תאית. מה שיש לנו כאן הם תאים שסודרו מראש, וניתן לראות שלאחר שעתיים באינקובטור, הם החלו להתחלק. כעת יש לנו תא אם, הגדול יותר, המחובר לתא הבת הצעיר, ותא בת צעיר זה הוא התא שישמש לתחילת מדידת משך החיים.
אם נדרש זמן נוסף כדי לאפשר את השלמת חלוקות התאים, החזירו את הפלטה לאינקובטור. החל מתא המערך הראשון, השתמשו במחט כדי להפריד את תאי הבת מהתא האם על ידי הנחת המחט בעדינות מעל התאים המחוברים.
לעיתים מומלץ להקיש על דופן בסיס המיקרוסקופ בעוד המחט נחה על התאים. לאחר מכן, מקמו את תא הבת שהופרד בתוך השורה האנכית של התאים, במקום תא האם וכל תאי בת נוספים, והזיזו אותם זמנית הצידה. חזרו על שלבים אלו עבור כל אחד מתאי המערך.
אם תא נכשל בחלוקה, קחו תא בת ממספר התאים העודפים הממוקמים לצד תא הבדיקה. בסיום הפעולה, צריכים להיות בידיכם 20 תאי בת עבור כל טלאי (patch) המסודרים אנכית על לוחית מעקב אורך החיים. אספו את כל תאי האם ותאי הבת העודפים לערימה אחת והעבירו אותם חזרה לאזור הסמוך לטלאים המכונה "בית הקברות" (graveyard).
חשוב להרחיק תאים לא רצויים מהתאים העוברים ניתוח אורך חיים כדי למנוע היווצרות של מיקרו-מושבות ואת דלדול חומרי המזון המקומיים. לאחר הפרדת התאים, הוצאו אותם מהפלטה והדגירו בטמפרטורה של 30 °C למשך כשעתיים. חזרו על שלבים אלו עבור כל פלטה בניסוי.
כדי למדוד את יכולת השכפול של תאים בודדים, יהיה עליך להכין גיליונות נתוני אורך חיים. גיליון נתוני אורך חיים יכול להיות טבלה פשוטה שבה כל שורה תואמת לתא אם בודד וכל עמודה תואמת לנקודת גיל. הקפד לסמן כל גיליון נתונים בהתאם למספר הזנים שיש לנתח.
כדי להתחיל, ראשית, הוציאו את הצלחות מהאינקובטור וודאו שרוב תאי המערך עברו לפחות חלוקה תאית אחת. אם נדרש זמן נוסף כדי לאפשר את השלמת החלוקה התאית, החזירו את הצלחת לאינקובטור. התחילו בתא המערך הראשון בצלחת הראשונה, ובחנו ויזואלית את תא האם ואת תאי הבת כדי לקבוע את מספר החלוקות התאית שהתרחשו.
בדרך כלל קל לקבוע כמה תאי בת ייצרה תא אם על בסיס דפוסי סידור תאים אופייניים. במקרה זה, קל מאוד לראות כמה תאים נוצרו מכיוון שישנם שם שניים, הם באותו גודל ושניהם קטנים יותר מהתא האם. רשמו את מספר תאי הבת שייצרה תא האם בתיבה המתאימה בגיליון ניקוד תוך החיים.
בשלב הבא, השתמש במחט כדי להפריד את תאי הבת מהתא האם כפי שתואר קודם לכן, על ידי הנחת המחט בעדינות על התאים המחוברים והקשה על דופן בסיס המיקרוסקופ בזמן שהמחט נחה על התאים. השאר את התא האם במיקומו בקו האנכי והזז את תא הבת או תאי הבת זמנית הצידה. חזור על שלבים אלה עבור כל אחד מתאי המערך.
לבסוף, אספו את כל תאי הבת שהוסרו והעבירו אותם ל"בית הקברות" הממוקם סמוך למוקדים המקוריים. אטמו את הצלחת באמצעות Para film והדגירו בטמפרטורה של 30 °C למשך שעתיים עד שלוש שעות. חזרו על תהליך הסרת תאי הבת וההדגירה.
שלב עבור כל צלחת בניסוי. חזור על כל ההליך עד שכל תאי האם יפסיקו להתחלק. שים לב שככל שתאי האם מזדקנים, התקדמות מחזור התא הופכת לאטית יותר, ויהיה רצוי לדגור את הצלחת לפרקי זמן ארוכים יותר בין נקודות הגיל; לאחר מכן, ניתן להניח את הצלחות בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius למשך הלילה.
הנתונים הגולמיים המופקים מניסוי של תוחלת חיים רפליקטיבית הם רשימה של מספרים המתאימים לתאי הבת המופקים על ידי כל תא אם בכל נקודת גיל. כפי שניתן לראות כאן. על ידי סיכום כל שורה בגיליון הציונים, מתקבלת תוחלת החיים הרפליקטיבית עבור כל תא אם.
ניתן לאחד נתונים מתאים אחרים מאותה קבוצת ניסוי כדי להפיק עקומת הישרדות ולבצע חישובים סטטיסטיים. העקומה צריכה להיות עקבית בקירוב עם קינטיקת Gomperts Mac am, ולהראות צורה סיגמואידית עם תמותה מוקדמת נמוכה, ואחריה ירידה מהירה יחסית בהישרדות והשטחה של העקומה בגילאים מאוחרים יותר. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע ניסוי של אורך חיים רפליקטיבי של שמרים.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שהתאים ימשיכו להתחלק כל עוד הם אינם נמצאים בקור. לכן, זכרו להניח את הצלחות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה, כדי שלא תגלו בבוקר מספר רב מדי של תאי בת לספירה. זהו כל התהליך.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול כללי למדידת תוכל replicative lifespan של תאי אם של שמרים, המהווים מודל מרכזי לחקר ההזדקנות. הנוהל משמש במחקרים לבדיקת גנים המשפיעים על אורך החיים של תאי שמרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- מחקר הזדקנות
- אורגניזמי מודל של שמרים
רקע
- שמרים ניצניים הם מודל נפוץ למחקרים על הזדקנות.
- הבנת תוכל השכפול (replicative lifespan) עשויה לספק תובנות לגבי מנגנוני הזדקנות תאית.
- תאי אם של שמרים עוברים חלוקה אסימטרית, מה שהופך אותם לאידיאליים למחקרי אורך חיים.
- מחקר בתחום זה עשוי לספק מידע על תהליכי הזדקנות ביולוגיים רחבים יותר.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול מהימן למדידת אורך החיים של תאי אם של שמרים.
- בחינת גורמים גנטיים שעשויים להשפיע על אורך החיים של תאי שמרים.
- תרומה להבנת תהליכי ההזדקנות באורגניזמים איקריוטים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד תאי אם של שמרים למדידת אורך חיים.
- מעקב אחר חלוקת תאים וחיוניות לאורך זמן.
- ניתוח של השפעות גנטיות על אורך החיים.
- שימוש בטכניקות של מיקרוסקופיה וספירת תאים.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר מדידה עקבית של תוחלת החיים של תאי אם של שמרים.
- הממצאים מצביעים על גנים ספציפיים שעשויים להשפיע על תוחלת החיים.
- התוצאות תורמות להבנה רחבה יותר של מנגנוני ההזדקנות.
- הוכשילו את התועלת בשמרים כמודל למחקר הזדקנות.
מסקנות
- הפרוטוקול המבוסס יעיל למחקרי תוחלת חיים בשמרים.
- גורמים גנטיים ממלאים תפקיד משמעותי בקביעת תוחלת החיים.
- מחקר זה מעמיק את ההבנה של תהליכי הזדקנות באורגניזמים פשוטים יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידת תוחלת חיים רפליקטיבית בשמרים בתנבובים מספקת מערכת ניתנת לטיפול גנטי לבחינת מנגנוני הזדקנות שמורים הרלוונטיים לתאים פעילים מיטוטית באיקריוטים גבוהים יותר. בדיקה זו מאפשרת תיקוף של מטרות והסרת סיכונים מנגנונית על ידי קישור הפרעות גנטיות לפנוטיפים של הזדקנות תאית מדידים. השיטה תומכת בתהליכי גילוי מוקדמים באמצעות הפקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך ניתוח מסלולים וזיהוי מועמדים בתחומים טיפוליים הקשורים להזדקנות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של קובעים גנטיים של הזדקנות תאית באמצעות מדידה ישירה של ייצור תאי בת על ידי תאי אם.
- ערך תפעולי: מספק תהליך עבודה סטנדרטי וסמיך (blinded) למעקב אחר קיבולת רפליקטיבית בין זנים שונים באמצעות מיקרו-מניפולציה ידנית ומיקרוסקופיה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים המופרדים לפי גיל, המתאימים לבניית עקומות הישרדות ולניתוח סטטיסטי של התפלגויות אורך חיים.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות הליכי patching, סידור במערכים והסרת תאי בת מוגדרים כדי להבטיח הדירות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מציע מערכת רלוונטית למחלה לחקר מסלולי אריכות ימים שמורים שזוהו בשמרים ומתבטאים גם בתולעים, זבובים ועכברים.
- ערך תפעולי: מקדם את הרציפות של מודלים פרה-קליניים על ידי אספקת פרדיגמה של הזדקנות מיטוטית המשלימה בדיקות של תוחלת חיים כרונולוגית.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
בדיקת תוחלת החיים השכפולית משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרה ועד לזיהוי מוביל, במיוחד עבור מסלולי הזדקנות בעלי שימור בין-מיני.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בהבהרת מסלולים על ידי קישור תפקוד גנים לשינויים בתוצרי הזדקנות מיטוטית.
- סריקה: מאפשרת הערכה מהימנה של תרכובות או הפרעות גנטיות באמצעות ספירה כמותית של תאי בת לכל תא אם.
- אנליטיקה: מייצרת תוצאות מבוססות ספירה המאפשרות איגוד נתונים ויצירת עקומות הישרדות לצורך ניתוח תנאים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: מקשר לתיקוף פרה-קליני באמצעות מנגנוני הזדקנות שמורים הנצפים באאוקריוטים רב-תאיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר למחקרי הזדקנות אורכיים על פני רקעים גנטיים או תנאי טיפול מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בניתוח נתיבי הזדקנות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות הכנה סטנדרטית של תאים, בידוד תאי בת בתוליים ושלבי אינקובציה מתוזמנים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך/עצירה (go/no-go) על ידי אספקת פנוטיפים של הזדקנות מוקדמים ומקושרים גנטית לצורך מיון פורטפוליו.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר החלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על מודיפיקטורים של אריכות ימים שמורים שזוהו בשמרים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה של שמרים ובמיקרו-מניפולציה ידנית לטיפול מדויק בתאים.
- תלוי בטכניקה סטרילית ובדגירה מבוקרת למניעת זיהומים והתייבשות במהלך בדיקות הנמשכות מספר שבועות.
- מחייב שימוש בגיליונות נתונים סטנדרטיים וסימון עיוור של הזנים כדי להבטיח מדידה אובייקטיבית של תוחלת החיים.
- כולל שיקולי התאמה בעת שינוי צפיפות הכתמים (patch density) או שינוי גאומטריית המערך עבור התנהגויות של זנים שונים.
- כולל מגבלות מעשיות, כגון הצורך בניטור תכוף עקב התקדמות משתנה של מחזור התא בתאי אם מזדקנים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:26
Introduction
0:49
Prepare Strains and Plates for Replicative Life Span Analysis
3:35
Position Cells for Replicative Life Span Analysis
6:22
Obtain Virgin Daughter Cells for Life Span Analysis
8:37
Measuring the Replicative Capacity of Individual Cells
11:18
Representative Results
12:10
Conclusion
