Name: מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: למדו פרוטוקול למדידת תוחלת החיים התאית בשמרים אם באמצעות מיקרודיסקציה ומעקב אחר חלוקת תאים. שיטה זו מאפשרת לחקור גנים המשפיעים על הזדקנות תאית באורגניזמים איקריוטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק לח&quot;כ ו BKK מהמרכז הרפואי אליסון קרן. ח&quot;כ הוא רפואי אליסון קרן מלומד חדש הזדקנות. ברצוננו להודות Soumya Kotireddy לסיוע במהלך הצילומים.

חלק 1: הכן זנים וצלחות לניתוח תוחלת החיים replicative סעיף זה מתאר את הכנת לוחות YEPD מוצק לשימוש הניסוי תוחלת החיים replicative והכנת בתאי שמרים לניתוח תוחלת החיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טכניקה סטרילי המתאים, להכין צלחות אגר YEPD (1% תמצית שמרים, 2% bacto-peptone, אגר 2%, גלוקוז 2%) אשר ישמשו עבור בתאי שמרים culturing ו לניתוח החיים replicative תוחלת. אתה צריך להכין לפחות 2 צלחות לכל 4-5 זנים להיות מנותח בניסוי תוחלת החיים. פלטות צריכים להיות מוכנים לפחות 2 ימים לפני הניסוי תוחלת החיים להתייבש לפני תחילת assay תוחלת החיים. אם הניסוי לא יחל בתוך 4-5 ימי לשפוך את הצלחות, הם צריכים להיות ממוקם בתוך חממה בקירור עטוף parafilm או פלסטיק כדי למנוע dessication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר זני שמרים ממניות קפוא פס עבור מושבות אחת על גבי צלחות אגר YEPD. עד 6 זנים יכול בקלות להיות מפוספס על הצלחת YEPD אותו על ידי חלוקת העוגה לתוך צלחת בצורת פלחי בגודל שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים מן החממה תאים תיקון מהמושבה יחיד על צלחת YEPD טריים. שני תיקונים משתי מושבות שונות צריכה להיות שנוצר עבור כל זן. בשלב זה, זנים כדי להיות מנותח צריך להיות מקודד כדי להבטיח את חיי replicative הניסוי תוחלת מתבצעת &quot;עיוורת&quot;, שם dissectors אינם יודעים את זהותו של זנים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תוקנו, תאים מקודדים ב 30 ° C עד הערב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים תאים קלות תיקון מהמאמץ כל מקודד על צלחות YEPD טריים, אשר תשמש את הצלחות ניסיוני המשמש ניתוח תוחלת החיים replicative. תאים צריכים להיות תוקנו לאורך קו אנכי בצד שמאל של הצלחת YEPD (איור 1). כ 3-5 טלאים לכל צלחת הוא אופטימלי, בהנחה ניתוח תוחלת החיים replicative על 20 תאים כל תיקון. אין צורך (וגם לא רצוי) כדי להעביר מספר גדול של תאים הצלחת YEPD טריים, כמו זה יגרום לתאים לצמוח עבה במהלך הדגירה לילה, אשר עלול להגביל את תוחלת החיים שלהם בעקבות replicative. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות תוקנו טרי לילה על גבי הספסל. </li></ol> חלק 2: תאים מיקום לניתוח החיים replicative תוחלת. בחלק זה אנו מתארים כיצד למקם את התאים השמרים על הצלחת ואיך להשיג לתאי הבת בתולה לניתוח החיים replicative תוחלת. מנקודה זו ואילך, צלחות כל צריך להיות parafilmed, למעט כאשר עובר לנתיחה, על מנת למנוע dessication. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ המצויד במנגנון microdissection מתאים שמרים, להעביר כ 50 תאים מהלחץ תוקנו הראשון עמדה על הצלחת דיסטלי לתאי תוקנו. אם בשלב מיקרוסקופ שלך מדורגת, דרגות אלה יכולים לשמש כדי להבטיח התאים יהיה קל למצוא במהלך חזרות עוקבות. ביום Axioscope Zeiss 40, תאים מן המאמץ תוקנו הראשון יכול להיות ממוקם בבית הקואורדינטות x 90 10 ו ערוכים אנכית משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את המחט של תאים שוב ושוב על ידי נגיעה במשטח אגר, ולאחר מכן ליצור חור אגר על ידי לאלץ את המחט דרך השטח אגר. חור זה ישמש כסמן כדי לכוון אותך על הצלחת במהלך חזרות עוקבות של דיסקציה של התא הסרת בתו. היזהר שלא לקבל תאים שמרים לחור, או שהם יגדלו בצורה המושבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממש מעל החור, ליישר אנכית לתוך תאים בודדים שמרים 20 עמדות מחולקת באופן שווה, עם קוטר מחט 1-3 (~ 100 מיקרומטר) בין העמדה כל תא (איור 1). כל כמה תאים, מקום שני תאים סמוכים זה לזה באותה תנוחה בשורה ולא אחד. זה מאפשר יתירות במהלך בחירת תא בתולה בת, אם אחד התאים הועברו נכשל לחלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין ה 10 ו ה 11 עמדות בקו, ליצור סדרה האופקי של 7-8 חורים אגר. זה ישמש כסמן כדי לכוון אותך על הצלחת במהלך חזרות עוקבות של דיסקציה של התא הסרת בתו. היזהר שלא לקבל תאים שמרים החורים, או שהם יגדלו בצורה המושבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.1-2.4 עבור תיקון זה על הצלחת, ממשיכים התאים במערך אנכי לאורך ציר זהה. צעד עבור 2.2, מספר חורים שנוצרו צריכה להתאים למספר התיקון (חור אחד עבור התיקון הראשון, שני חורים של השני וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים היו ערוכים על כל תיקון, parafilm את הצלחת לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך כ 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.1-2.6 על כל צלחת בניסוי. </li></ol> חלק 3: השג בת בתולה תאים לניתוח תוחלת החיים בסעיף זה אנו יוזמים את תוחלת החיים על ידי ניתוח להבטיח כי כל תא מתחיל כמו בת בתולההתא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחות מן האינקובטור ולוודא כי רוב התאים ערוכים עברו חלוקת התא. אם נדרש זמן נוסף כדי לאפשר חלוקת התא להסתיים, להחזיר את הצלחת אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל התא ערוכים הראשונה, להשתמש במחט לנתק לתאי הבת מן התא על ידי אמו בעדינות הצבת מחט על גבי תאים המצורפת. לפעמים זה מועיל כדי לנצל את הצד של הבסיס מיקרוסקופ בעוד המחט מונח על התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא הבת מנותקת בקו אנכי, להחליף את תא האם כל התאים בת נוספת להעביר אותם באופן זמני בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.2 ו - 3.3 עבור כל אחד תאים מסודרים. אם התא נכשל לחלק, לקחת תא הבת מאחד התאים מיותר ממוקם בשלב 2.3. בסיום, אתה צריך 20 לתאי הבת עבור תיקון כל מיושרים אנכית על צלחת את תוחלת החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף כל התאים האם לתאי הבת נוסף לערימה ולהעבירם חזרה לשטח ליד התיקונים (&quot;בית הקברות&quot;). חשוב לשמור על תאים לא רצויים בהרבה מהתאים שעברו ניתוח תוחלת חיים כדי למנוע היווצרות של microcolonies ודלדול של חומרים מזינים המקומית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm את הצלחת לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך כ 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.2-3.6 על כל צלחת בניסוי. </li></ol> חלק 4: מדידת קיבולת replicative של תאים בודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תוחלת החיים גיליונות נתונים. תוחלת החיים של גיליון הנתונים יכול להיות רשת פשוט שבו כל שורה מתאימה לתא אמא הפרט כל עמודה מקבילה לנקודת בגיל (איור 2). לייבל כל גיליון נתונים על פי מספר זנים להיות מנותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחות מן האינקובטור ולוודא כי רוב התאים ערוכים עברו לפחות חלוקת התא. אם נדרש זמן נוסף כדי לאפשר חלוקת התא להסתיים, להחזיר את הצלחת אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל התא ערוכים הראשון על הצלחת הראשונה, מבחינה ויזואלית לבחון את התא אמא ובת (ים) ו לקבוע את מספר חלוקות תא שהתרחשו. זה בדרך כלל קל לקבוע כמה תאים הבת לאם הפיק, בהתבסס על תבניות אופייניות של הסדרים התא. רשום את מספר התאים בת המיוצר על ידי תא האם במשבצת המתאימה על גיליון תוחלת החיים ציון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מחט לנתק לתאי הבת מן התא אמא כמתואר בשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמר את התא אמא בעמדה שלו בקו אנכי ולעבור לתא הבת (ים) באופן זמני בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.3-4.5 לכל אחד התאים ערוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף כל התאים בת זרוקים ולהעביר אותם אל &quot;בית קברות&quot;, הממוקם בסמוך טלאים המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm את הצלחת לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.3-4.8 על כל צלחת בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים עד 4.2-4.9 כל התאים אמא הפסיקו להתחלק. כמו גיל האם התאים, את התקדמות מחזור התא הופך איטי יותר וזה יהיה רצוי כדי לדגור על צלחת עבור תקופות זמן ארוכות יותר בין גיל נקודות. פלטות ניתן להציב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג. הנתונים הגולמיים המיוצר על ידי ניסוי תוחלת החיים replicative היא רשימת מספרים המקביל לתאי הבת המיוצר על ידי תא האם בנקודה בגיל זה (איור 2). על ידי סיכום כל שורה של הגיליון את הציון, תוחלת החיים replicative עבור כל תא האם מתקבל. הנתונים עבור תאים אמא של קבוצת הניסוי אותו ניתן ונקווה כדי ליצור עקומת ההישרדות (איור 3A) וכן כדי לבצע חישובים סטטיסטיים, כגון תוחלת החיים כלומר, תוחלת החיים הממוצע, וסטיית התקן. בדיקת אי - פרמטריים, כגון מבחן Wilcoxon דרגה-Sum, ניתן לבצע כדי לקבוע אם הבדלים משמעותיים בתוחלת החיים התגלו בין קבוצות הניסוי. כאשר הניסוי פועל כראוי, עקומת ההישרדות צריך להיות עקבי עם בערך Gompertz-Makeham קינטיקה מראה shap sigmoidal עם תמותה מוקדמת נמוך לאחר ירידה מהירה יחסית הישרדות החוצה השטחת העקום הגילאים מאוחר יותר. רוב wild-type זנים יש תוחלת חיים replicative הערכים בטווח 20-30 הדור, אף מחוץ וריאציה של טווח זה דווחה. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="דמות 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="איור 1.5" /> באיור 1. תרשים של צלחת replicative טיפוסי תוחלת החיים. הערב לפני תחילת microdissection של תאים שמרים, 3-5 זנים הם תוקנו קלות לאורך צד אחד של הצלחת על פני השטח של צלחת YEPD (תיבות אדום) בקו אנכי. בעקבות הצמיחה בין לילה, כ -30 תאים בודדים מתוך כל המתח הם מסודרים במאונך לתוך הקו המכיל 20 עמדות. תוחלת החיים analysiזה יבוצע על תאים v בתולה בת המתקבל תאים אלה הראשונית. תאים עודפים microdissection המתקבל במהלך הניסוי (למשל לתאי הבת לא רצויות) ממוקמים &quot;בית הקברות&quot; (סגלגל אפור), הנמצא הרחק מתאי הניסוי על מנת למנוע דלדול מקומי של חומרים מזינים כמו מושבות נוצרים. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="דמות 2" /> איור 2. תוחלת החיים replicative גיליון מספר הנקודות. נתונים גולמיים ניסוי תוחלת החיים replicative מוצג. כל שורה מקבילה תא שמרים בודד האם כל עמודה מקבילה לנקודת גיל. מספר נכנס בתיבה כל את מספר התאים בת המיוצר על ידי תא האם בנקודה בגיל זה. זן כל תווית עם מספר מקודדים כך הפרט לנתח בתאי שמרים אין ידע על זהותם של זנים להיות מנותח. עשרים תאים assayed עבור כל זן. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="דמות 3" /> איור 3. נציג הישרדות עקומות גדילה של ניסוי תוחלת החיים replicative. (א) עקומות הישרדות מתקבלים על ידי זוממים את החלק היחסי של תאים אמא עדיין בחיים כפונקציה של גיל replicative (מספר חלוקות תא. (ב) עקומות גדילה מתקבלים על ידי התוויית המספר הממוצע של לתאי הבת המיוצר על ידי זן מסוים כפונקציה של נקודה הגיל. בדוגמה זו, זן # 2 ארוך ימים אבל הוא איטי הגוברת, כפי שמעידים המדרון הראשונית מופחת של העלילה את הצמיחה.

<ol><li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+yeast+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109-120 (2006).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li>
<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).</li>
<li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sir2-independent+life+span+extension+by+calorie+restriction+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast.</a> PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).</li>
<li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>אגר (Agar)</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>בקטו-פפטון (Bacto-Peptone)</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים (Yeast Extract)</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

הזדקנות היא תהליך ניוונית המאופיינת הידרדרות מתקדמת של רכיבים סלולריים האברונים וכתוצאה מכך התמותה. שמרים ניצני<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; כבר בשימוש נרחב כדי לחקור את הביולוגיה של ההזדקנות, אריכות ימים הקובעים כמה שמרים הוכחו להשתמר אאוקריוטים תאיים, כולל תולעים, זבובים ועכברים<sup&gt; 1</sup&gt;. בשל העדר גיל הקשורים פנוטיפים לכמת בקלות, הזדקנות בשמרים כבר assayed באופן כמעט בלעדי על ידי מדידת אורך החיים של תאים בהקשרים שונים, עם שתי פרדיגמות שונות תוחלת החיים השימוש הנפוץ<sup&gt; 2</sup&gt;. תוחלת החיים כרונולוגית מתייחס למשך הזמן כי תא האם יכול לשרוד במצב הלא חלוקת קפאון דמוי, והוא הציע לשמש מודל עבור הזדקנות שלאחר mitotic תאים אאוקריוטים רב תאיים. תוחלת החיים replicative, לעומת זאת, מתייחס את מספר התאים בת המיוצר על ידי תא האם לפני הזדקנות, והוא נחשב לספק מודל של הזדקנות תאים פעילים mitotically. כאן אנו מציגים פרוטוקול כללית למדידת replicative תוחלת החיים של תאים אמא נבגי שמרים. המטרה של assay תוחלת החיים replicative הוא לקבוע כמה פעמים כל תא ניצנים אמא. התאים אמא ובת יכול להיות מובחן בקלות על ידי חוקר מנוסה באמצעות מיקרוסקופ אור רגיל (הכולל הגדלה 160X), כגון Axioscope Zeiss 40 או דגם אחר להשוואה. הפרדה פיזית של תאים מתאי הבת אמא מושגת באמצעות micromanipulator ידני מצויד במחט סיבים אופטיים. זני שמרים אופייני במעבדה לייצר תאים בת 20-30 לכל אמא אחת תוחלת החיים הניסוי דורש 2-3 שבועות.

במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת חיים replicative טווח של תאים אמא שמרים.

הזדקנות היא תהליך דגנרטיבי המאופיין בהידרדרות הדרגתית של רכיבים תאיים ואברונים, המובילה למשמעות של תמותה. השמרים המנצנים...

השמר השמרנית *Saccharomyces cerevisiae* שימש באופן נרחב לחקר הביולוגיה של ההזדקנות. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול כללי למדידת תוחלת החיים הרפליקטיבית של תאי אם של שמרים. שלום, אני קריסטן סטפן מהמעבדה של בריאן קנדי במחלקה לביוכימיה באוניברסיטת וושינגטון.היום נדגים בפניכם פרוצדורה למדידת תוחלת החיים השכפולית של תאי אם של שמרים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור גנים המשפיעים על תוחלת החיים של תאי שמרים. אז בואו נתחיל.עבור ניסוי אורך החיים השכפולי והכנת תאי שמרים לניתוח אורך חיים, יש להכין מצעי YEPD מוצקים. השתמשו בטכניקה סטרילית מתאימה להכנת מצעי אגר YEPD אלו. הכינו לפחות שני מצעים עבור כל ארבעה עד חמישה זנים שייבחנו בניסוי אורך החיים.יש להכין את המצעים הללו לפחות יומיים לפני ניסוי תוחלת החיים ולאפשר להם להתייבש לפני תחילת הבדיקה. אם הניסוי לא יתבצע תוך ארבעה עד חמישה ימים מיציקת המצעים, יש לעטוף אותם ב-para film או בניילון ולהניחם באינקובטור מקורר כדי למנוע התייבשות. הוצא את זני השמרים מהמלאים הקפואים ובצע מריחה לקבלת מושבות בודדות.על צלחות אגר YEPD. ניתן לזרוע בקלות עד שישה זנים על אותה צלחת YEPD על ידי חלוקת הצלחת לפרוסות דמויות פלחים בגודל שווה. דגרו את התאים בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים.לאחר הדגירה, הוצא את התאים מהאינקובטור והעבר תאים מקולוניה בודדת לצלחת YEPD טרייה. בשלב זה, יש לסמן את הזנים המיועדים לניתוח כדי להבטיח שניסוי אורך החיים השכפולי יבוצע באופן עיוור, כך שהמנתחים לא ידעו את זהות הזנים הבודדים.בשלב הבא, דגרו את התאים המצופים שסודרו בבטבלה בטמפרטורה של 30 °C עד למחרת בערב. הוציאו את התאים והעבירו בבטבלה (patch) בעדינות תאים מכל זן מצופה לצלחות YEPD טריות. אלו ישמשו כצלחות הניסוי שבהן יימדד אורך החיים השכפולי (replicative lifespan).יש להעביר את תאי הניתוח בקו אנכי בצדו השמאלי של מצע ה-YEPD. אין להעביר תאים רבים מדי למצע YEPD טרי בודד. מכיוון שפעולה זו תגרום לצמיחה עבה של התאים במהלך הדגירה בלילה ותשפיע על אורך חייהם הרפליקטיבי, מספר אופטימלי של כשלושה עד חמישה פאטצ'ים למצע הוא המומלץ.בהנחה שניתוח אורך חיים רפליקטיבי יבוצע על 20 תאים מכל פאטץ', כעת ניסוי אורך החיים מוכן במלואו וכל שעליהם לעשות הוא לדגרה למשך הלילה על משטח העבודה. ומחר נוכל להתחיל במיקרו-דיסקציה כדי למקם את תאי השמרים על הפיתח ולהשיג תאי בת בתולים לצורך ניתוח אורך חיים רפליקטיבי.השתמשו במיקרוסקופ המצויד במכשיר למיקרו-דיסקציה המתאים לשמרים. העבירו כ-50 תאים מהזן שבפטץ' הראשון למיקום על הפלטה המרוחק מהתאים שהועברו. אם במה המיקרוסקופ שלכם מדורגת, ניתן להשתמש בסימונים אלו כדי להבטיח שהתאים יהיו קלים לאיתור במהלך חזרות עוקבות.לעתים תאים עלולים להיתקע במחט, דבר שעלול להוות בעיה אם הם ישתחררו בזמן שגוי. כדי לוודא שהמחט נקייה ותיקח ללא תאים, יש לגעת בה שוב ושוב במשטח האגר. לאחר מכן, צרו חור באגר על ידי דחיקת המחט דרך משטח האגר.חור זה ישמש כסימן להכוונתכם על הפלטה במהלך סבבי הדיסקציה והסרת תאי הדוטר (dotter cells) הבאים. היזהרו שלא יחדרו תאי שמרים לחור, שכן הם יגדלו וייצרו מושבה ישירות מעליו. יישרו אנכית תאי שמרים בודדים ב-20 מיקומים במרווחים שווים, עם מרחק של קוטר מחט אחד עד שלושה בין מיקום תא אחד למשנהו.עבור כל כמה תאים, מקמו שני תאים זה לצד זה באותה עמדה בקו, במקום תא אחד. הדבר מאפשר יתירות במהלך בחירת תאי בת בתוליים. אם אחד התאים שהועברו אינו מתחלק בין העמדה ה-10 ל-11 בקו, צרו סדרה אופקית של שבעה עד שמונה חורים באגר.פעולה זו תשמש כסימון להכוונתכם על הצלחת במהלך דיסקציות עוקבות והסרות של תאי בת. שוב, היזהרו שלא להכניס תאי שמרים לחורים, שכן הם יגדלו ויהפכו למושבה. חזרו על הליך זה עבור כל טלאי על הצלחת, תוך המשך סידור התאים בצורה אנכית לאורך אותו ציר.חשוב לזכור בעת יצירת החור ב-AER כי מספר החורים שנוצרים צריך להתאים למספר ה-patch, כך שיהיה חור אחד עבור ה-patch הראשון, ושני חורים עבור השני. לאחר שסידרו את התאים במערך עבור כל patch, יש לכסות את הפלטה ב-Parafilm ולהדגיר בטמפרטורה של 30 °C למשך כשעתיים. זכרו, מהנקודה זו והלאה, יש לכסות את כל הפלטות ב-Parafilm, למעט בעת ביצוע הדיסקציה.על מנת למנוע התייבשות, חזור על הליך זה עבור כל צלחת. בניסוי, עבור ניתוח תוחלת החיים, חשוב לוודא שכל תא מתחיל כתא בת בתולי.כדי לבצע זאת, ראשית הוציאו את הצלחות מהאינקובטור וודאו שרוב תאי המערך עברו חלוקה תאית. מה שיש לנו כאן הם תאים שסודרו מראש, וניתן לראות שלאחר שעתיים באינקובטור, הם החלו להתחלק. כעת יש לנו תא אם, הגדול יותר, המחובר לתא הבת הצעיר, ותא בת צעיר זה הוא התא שישמש לתחילת מדידת משך החיים.אם נדרש זמן נוסף כדי לאפשר את השלמת חלוקות התאים, החזירו את הפלטה לאינקובטור. החל מתא המערך הראשון, השתמשו במחט כדי להפריד את תאי הבת מהתא האם על ידי הנחת המחט בעדינות מעל התאים המחוברים.לעיתים מומלץ להקיש על דופן בסיס המיקרוסקופ בעוד המחט נחה על התאים. לאחר מכן, מקמו את תא הבת שהופרד בתוך השורה האנכית של התאים, במקום תא האם וכל תאי בת נוספים, והזיזו אותם זמנית הצידה. חזרו על שלבים אלו עבור כל אחד מתאי המערך.אם תא נכשל בחלוקה, קחו תא בת ממספר התאים העודפים הממוקמים לצד תא הבדיקה. בסיום הפעולה, צריכים להיות בידיכם 20 תאי בת עבור כל טלאי (patch) המסודרים אנכית על לוחית מעקב אורך החיים. אספו את כל תאי האם ותאי הבת העודפים לערימה אחת והעבירו אותם חזרה לאזור הסמוך לטלאים המכונה "בית הקברות" (graveyard).חשוב להרחיק תאים לא רצויים מהתאים העוברים ניתוח אורך חיים כדי למנוע היווצרות של מיקרו-מושבות ואת דלדול חומרי המזון המקומיים. לאחר הפרדת התאים, הוצאו אותם מהפלטה והדגירו בטמפרטורה של 30 °C למשך כשעתיים. חזרו על שלבים אלו עבור כל פלטה בניסוי.כדי למדוד את יכולת השכפול של תאים בודדים, יהיה עליך להכין גיליונות נתוני אורך חיים. גיליון נתוני אורך חיים יכול להיות טבלה פשוטה שבה כל שורה תואמת לתא אם בודד וכל עמודה תואמת לנקודת גיל. הקפד לסמן כל גיליון נתונים בהתאם למספר הזנים שיש לנתח.כדי להתחיל, ראשית, הוציאו את הצלחות מהאינקובטור וודאו שרוב תאי המערך עברו לפחות חלוקה תאית אחת. אם נדרש זמן נוסף כדי לאפשר את השלמת החלוקה התאית, החזירו את הצלחת לאינקובטור. התחילו בתא המערך הראשון בצלחת הראשונה, ובחנו ויזואלית את תא האם ואת תאי הבת כדי לקבוע את מספר החלוקות התאית שהתרחשו.בדרך כלל קל לקבוע כמה תאי בת ייצרה תא אם על בסיס דפוסי סידור תאים אופייניים. במקרה זה, קל מאוד לראות כמה תאים נוצרו מכיוון שישנם שם שניים, הם באותו גודל ושניהם קטנים יותר מהתא האם. רשמו את מספר תאי הבת שייצרה תא האם בתיבה המתאימה בגיליון ניקוד תוך החיים.בשלב הבא, השתמש במחט כדי להפריד את תאי הבת מהתא האם כפי שתואר קודם לכן, על ידי הנחת המחט בעדינות על התאים המחוברים והקשה על דופן בסיס המיקרוסקופ בזמן שהמחט נחה על התאים. השאר את התא האם במיקומו בקו האנכי והזז את תא הבת או תאי הבת זמנית הצידה. חזור על שלבים אלה עבור כל אחד מתאי המערך.לבסוף, אספו את כל תאי הבת שהוסרו והעבירו אותם ל"בית הקברות" הממוקם סמוך למוקדים המקוריים. אטמו את הצלחת באמצעות Para film והדגירו בטמפרטורה של 30 °C למשך שעתיים עד שלוש שעות. חזרו על תהליך הסרת תאי הבת וההדגירה.שלב עבור כל צלחת בניסוי. חזור על כל ההליך עד שכל תאי האם יפסיקו להתחלק. שים לב שככל שתאי האם מזדקנים, התקדמות מחזור התא הופכת לאטית יותר, ויהיה רצוי לדגור את הצלחת לפרקי זמן ארוכים יותר בין נקודות הגיל; לאחר מכן, ניתן להניח את הצלחות בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius למשך הלילה.הנתונים הגולמיים המופקים מניסוי של תוחלת חיים רפליקטיבית הם רשימה של מספרים המתאימים לתאי הבת המופקים על ידי כל תא אם בכל נקודת גיל. כפי שניתן לראות כאן. על ידי סיכום כל שורה בגיליון הציונים, מתקבלת תוחלת החיים הרפליקטיבית עבור כל תא אם.ניתן לאחד נתונים מתאים אחרים מאותה קבוצת ניסוי כדי להפיק עקומת הישרדות ולבצע חישובים סטטיסטיים. העקומה צריכה להיות עקבית בקירוב עם קינטיקת Gomperts Mac am, ולהראות צורה סיגמואידית עם תמותה מוקדמת נמוכה, ואחריה ירידה מהירה יחסית בהישרדות והשטחה של העקומה בגילאים מאוחרים יותר. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע ניסוי של אורך חיים רפליקטיבי של שמרים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שהתאים ימשיכו להתחלק כל עוד הם אינם נמצאים בקור. לכן, זכרו להניח את הצלחות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה, כדי שלא תגלו בבוקר מספר רב מדי של תאי בת לספירה. זהו כל התהליך.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

measuring-replicative-life-span-in-the-budding-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת אורך החיים של נמטודות שמרו על התקשורת עם מזון מוצק-UV הרג חיידקים.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח על מדיה מוצק

הזדקנות בשמרים כרונולוגית מתייחס לאובדן של כדאיות התא הקשורים זמן בשלב נייח. כאן אנו מתארים את שיטת תפוקה גבוהה עבור כמותית בקביעת תוחלת החיים בשמרים כרונולוגי.

כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה...

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

כאן אנו מתארים קבוצה של מוטציה מבחני DNA כי ניתן בשילוב עם המודל הכרונולוגי שמרים תוחלת החיים כדי לחקור את הגנים / מסלולים המווסתים או לתרום יציבות הדנ"א הגנומי במהלך ההזדקנות.

לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

סרטון זה מתאר שיטה מסורתית מבוססת לוחות למדידת תוחלת החיים של C. elegans. הפרוטוקול לדוגמה מודד את תוחלת החיים של תולעים שטופלו ב-RNAi.

ניתוח תוחלת חיים: מדידת אריכות ימים של C. elegans

אנו מתארים כאן את הפעולה של מכשיר microfluidic המאפשר הדמיה מיקרוסקופית רציפה ורזולוציה גבוהה של תאי שמרי ניצנים בודדים במהלך replicative המלא ו / או תוחלת החיים כרונולוגית.

תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה

מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לייצור שבבי microfluidic ואת ההתקנה של ניסויים microfluidic כדי למדוד את אורך החיים פנוטיפים הסלולר של תאי שמרים בודד.

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

כאן נתאר שיטת עותקים משוכפלים, גישה באופן כמותי מודדים C. elegans תוחלת החיים/הישרדות, healthspan באופן תפוקה גבוהה וחזק, ובכך לאפשר הקרנה של מצבים רבים מבלי להתפשר על איכות הנתונים. פרוטוקול זה מפרט את האסטרטגיה, ומספק כלי תוכנה לניתוח של נתונים המשוכפלים.

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

הנה פרוטוקול לזיהוי אינטראקציות גנטיות באמצעות מסך מדכא מספר עותק מוגבר ב Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות, לשבט ולבדוק מדכאי מוטנטים שמרים קצרי מועד. אנו בודקים את ההשפעה של הגדלת מספר עותק של SIR2 על תוחלת החיים במוטציה null autophagy.

מסך מדכא לאפיון קישורים גנטיים ויסות תוחלת חיים כרונולוגית ב Saccharomyces cerevisiae

אנו מתארים שני פרוטוקולים משלימים לקביעה מדויקת של משך שלב ה-S ב-S. cerevisiae באמצעות EdU, אנלוגי של תימידין, המשולב ב-vivo ומזוהה באמצעות כימיה של קליק על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. היא מאפשרת אפיון קל של משך שכפול הדנ"א והתעלמות מפגמי שכפול במוטציות.

קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae

למדו פרוטוקול למדידת תוחלת החיים התאית בשמרים אם באמצעות מיקרודיסקציה ומעקב אחר חלוקת תאים. שיטה זו מאפשרת לחקור גנים המשפיעים על הזדקנות תאית באורגניזמים איקריוטיים.

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

גלה סרטונים נוספים