מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

השמרים הניצנים Croce Visi שימשו רבות לחקר הביולוגיה של ההזדקנות. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול כללי למדידת תוחלת החיים המשוכפלת של תאי אם שמרים. היי, אני קריסטן סטפן מהמעבדה של בריאן קנדי במחלקה לביוכימיה באוניברסיטת וושינגטון.

היום נראה לכם נוהל למדידת תוחלת חיים משוכפלת של תאי אם שמרים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור גנים המשפיעים על תוחלת החיים של תאי שמרים. אז בואו נתחיל.

לצורך ניסוי תוחלת החיים המשכפל והכנת תאי שמרים לניתוח תוחלת חיים, יש להכין לוחות YEPD מוצקים לעשות זאת. השתמש בטכניקה סטרילית מתאימה להכנת צלחות אגר YEPD אלה. הכן לפחות שתי צלחות לכל ארבעה עד חמישה זנים לניתוח בניסוי תוחלת החיים.

יש להכין את הצלחות הללו לפחות יומיים לפני ניסוי תוחלת החיים ולהניח להן להתייבש לפני תחילת בדיקת תוחלת החיים. אם הניסוי לא יתקיים תוך ארבעה עד חמישה ימים מרגע מזיגת הצלחות, יש לעטוף אותן בניילון פרה או פלסטיק ולהניח אותן באינקובטור מקורר כדי למנוע התייבשות. הסר את זני השמרים מהצירים הקפואים ופס למושבות בודדות.

על צלחות האגר של YEPD. ניתן בקלות לפספס עד שישה זנים על אותה צלחת YEPD על ידי חלוקת הצלחת לטריזים בצורת פאי בגודל שווה. דגרו על התאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים.

לאחר הדגירה, הוציאו את התאים מהאינקובטור והדביקו תאים ממושבה אחת על צלחת YEPD טרייה. בשלב זה, יש לצפות את הזנים שיש לנתח כדי להבטיח שניסוי תוחלת החיים המשכפל יבוצע עיוור. כאשר הדיסקטורים אינם יודעים את זהותם של זנים בודדים. שרשראות.

לאחר מכן, דגרו על התאים המצופים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד למחרת בערב. הסר את התאים וחלק קלות תאים מכל זן מצופה לצלחות YEPD טריות. אלה ישמשו כלוחות הניסוי המשמשים לתוחלת החיים המשוכפלת.

יש לתקן את תאי הניתוח לאורך קו אנכי בצד שמאל של לוחית ה-YEPD. אל תעביר יותר מדי תאים לצלחת YEPD טרייה אחת. מכיוון שהדבר יגרום לצמיחה עבה של התאים במהלך הדגירה הלילה וישפיע על תוחלת החיים המשכפלת שלהם, כשלושה עד חמישה טלאים לצלחת הם אופטימליים.

בהנחה שניתוח תוחלת חיים משוכפל יבוצע על 20 תאים מכל טלאי, כעת ניסוי תוחלת החיים מוכן לחלוטין וכל מה שהם צריכים לעשות הוא לדגור למשך הלילה על הספסל. ואז מחר נוכל להתחיל את המיקרו דיסקציה כדי למקם את תאי השמרים על הצלחת ולקבל תאי בת בתוליים. לניתוח תוחלת חיים משוכפל

השתמש במיקרוסקופ המצויד במנגנון דיסקציה מיקרו המתאים לשמרים. העבר כ-50 תאים מזן המדבקה הראשון למיקום על הצלחת הדיסטלי לתאים המתוקנים. אם שלב המיקרוסקופ שלך מדורג, ניתן להשתמש בהדרגתיות זו כדי להבטיח שיהיה קל למצוא את התאים במהלך האיטרציות הבאות.

לפעמים תאים יכולים להיתקע במחט, מה שיכול להוות בעיה אם הם יוצאים בזמן הלא נכון. כדי לוודא שהמחט נקייה וללא תאים, גע בה שוב ושוב במשטח האגר. לאחר מכן צור חור באגר על ידי דחיפה של המחט דרך משטח האגר.

חור זה ישמש כסמן שיכוון אותך על הצלחת במהלך איטרציות עוקבות של דיסקציה והסרת תאי נקודה. היזהר לא להכניס תאי שמרים לחור, אחרת הם יגדלו ויצרו מושבה ממש מעל החור. תאי שמרים בודדים מיושרים אנכית ל-20 מיקומים במרווחים שווים עם קוטר מחט אחד עד שלושה בין כל מיקום תא.

עבור כל כמה תאים, מקם שני תאים זה ליד זה באותו מיקום בשורה במקום אחד. זה מאפשר יתירות במהלך בחירת תאי בת בתולים. אם אחד התאים המועברים לא מצליח להתחלק בין המיקום ה-10 וה-11 בשורה, צור סדרה אופקית של שבעה עד שמונה חורים באגר.

זה ישמש כסמן שיכוון אותך על הצלחת במהלך נתיחות והסרת תאי בת לאחר מכן. שוב, היזהר לא להכניס תאי שמרים לחורים או שהם יגדלו ויהוו מושבה. חזור על הליך זה עבור כל טלאי בצלחת, והמשך לסדר את התאים אנכית לאורך אותו ציר.

חשוב לזכור שבעת יצירת החור ב-AER מספר החורים שנוצרו יתאים למספר התיקון כך שיהיה חור אחד לתיקון הראשון, ושני חורים לשני. לאחר שהתאים מסודרים עבור כל טלאי, יש לעצב את הצלחת ולדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך כשעתיים. זכור, מנקודה זו ואילך, יש לצלם את כל הלוחות למעט כאשר הם עוברים נתיחה.

על מנת למנוע התייבשות, חזור על הליך זה עבור כל צלחת. בניסוי. לניתוח תוחלת החיים, חשוב לוודא שכל תא מתחיל כתא בת בתולי.

כדי לעשות זאת תחילה, הסר את הלוחות מהחממה וודא שרוב תאי המערך עברו חלוקת תאים. אז מה שיש לנו כאן זה תאים שהיו מיושרים בעבר, ואתם יכולים לראות שאחרי שעתיים באינקובטור, הם התחילו להתחלק. ועכשיו יש לנו תא אם, הגדול יותר המחובר לגופו, תא הבת הבתולי, ותא הבת הבתולי הזה הוא תא שישמש להתחלת תוחלת החיים.

אם יש צורך בזמן נוסף כדי לאפשר השלמת חלוקת תאים, החזר את הצלחת לחממה. החל מתא המערך הראשון. השתמש במחט כדי לנתק תאי בת מתא האם על ידי הנחת המחט בעדינות על גבי התאים המחוברים.

לפעמים מועיל להקיש על צד בסיס המיקרוסקופ בזמן שהמחט מונחת על התאים. לאחר מכן, מקם את תא הבת המנותק בשורה האנכית של התאים, והחליף את תא האם ותאי בת נוספים והזיז אותם הצידה באופן זמני. חזור על שלבים אלה עבור כל אחד מתאי המערך.

אם תא לא מצליח להתחלק, קח תא בת מאחד התאים המיותרים הממוקמים ליד תא הבדיקה. בסיום, אמורים להיות לך 20 תאי בת עבור כל תיקון מיושרים אנכית על לוחית תוחלת החיים. אספו את כל תאי האם ותאי הבת הנוספים לערימה והעבירו אותם בחזרה לאזור ליד הטלאים שנקרא בית הקברות.

חשוב להרחיק תאים לא רצויים מהתאים העוברים ניתוח תוחלת חיים כדי למנוע היווצרות מושבות מיקרו ודלדול של חומרים מזינים מקומיים. לאחר הפרדת התאים, יש לפרוש מהצלחת ולדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך כשעתיים. חזור על שלבים אלה עבור כל צלחת בניסוי.

כדי למדוד את יכולת השכפול של תאים בודדים, תצטרך להכין גיליונות נתונים של תוחלת חיים. גליון נתונים של תוחלת חיים יכול להיות רשת פשוטה שבה כל שורה מתאימה לתא אם בודד וכל עמודה מתאימה לנקודת גיל. הקפד לתייג כל גיליון נתונים בהתאם למספר הזנים שיש לנתח.

כדי להתחיל, ראשית, הסר את הלוחות מהחממה וודא שרוב תאי המערך עברו לפחות חלוקת תא אחת. אם יש צורך בזמן נוסף כדי לאפשר את השלמת חלוקת התאים, החזר את הצלחת לחממה. התחל עם תא המערך הראשון בלוח הראשון, והתבונן חזותית באם ובבת, בתא או בתים כדי לקבוע את מספר חלוקות התאים שהתרחשו.

בדרך כלל קל לקבוע כמה תאי בת ייצרה האם על סמך דפוסים אופייניים של סידורי תאים. זה ממש פשוט לראות כמה תאים הוא ייצר כי יש שם שניים והם באותו גודל ושניהם קטנים יותר מהאם. רשום את מספר תאי הבת המיוצרים על ידי תא האם בתיבה המתאימה בגיליון הניקוד של תוחלת החיים.

לאחר מכן, השתמשו במחט כדי לנתק תאי בת מתא האם כפי שתואר קודם לכן על ידי הנחת המחט בעדינות על גבי התאים המחוברים והקשה על צד בסיס המיקרוסקופ בזמן שהמחט מונחת על התאים. השאר את תא האם במיקומו בקו האנכי והזז את תא הבת או את תאי הבת הצידה באופן זמני. חזור על שלבים אלה עבור כל אחד מתאי המערך.

לבסוף אספו את כל תאי הבת שהושלכו והעבירו אותם לבית הקברות הממוקם ליד הטלאים המקוריים. מצלמים את הצלחת ודוגרים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שעתיים-שלוש. חזור על השלכת תאי הבת והדגירה.

שלב לכל צלחת בניסוי. חזור על כל ההליך הזה עד שכל תאי האם יפסיקו להתחלק. יש לזכור שככל שתאי האם מזדקנים, התקדמות מחזור התא הופכת איטית יותר ורצוי לדגור על הצלחת לפרקי זמן ארוכים יותר בין נקודות גיל לאחר מכן, ניתן למקם את הלוחות בארבע מעלות צלזיוס בן לילה.

הנתונים הגולמיים המופקים על ידי ניסוי תוחלת חיים משוכפל הם רשימה של מספרים המתאימים לתאי בת המיוצרים על ידי כל תא אם בכל נקודת גיל. כפי שניתן לראות כאן. על ידי סיכום כל שורה בגיליון הניקוד, מתקבל תוחלת החיים המשוכפלת עבור כל תא אם.

ניתן לאגד נתונים מתאים אחרים מאותה קבוצת ניסוי כדי ליצור עקומת הישרדות ולבצע חישובים סטטיסטיים. העקומה צריכה להיות עקבית פחות או יותר עם הקינטיקה של גומפרטס מק אם, ומראה צורה סיגמואידית עם תמותה מוקדמת נמוכה, ואחריה ירידה מהירה יחסית בהישרדות והשטחה של העקומה בגילאים מאוחרים יותר. זה עתה הראינו לך כיצד לבצע ניסוי תוחלת חיים של שכפול שמרים.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שהתאים ימשיכו להתחלק בכל פעם שהם לא בקור. אז זכרו לשים את הצלחות על ארבע מעלות למשך הלילה כדי שלא תמצאו יותר מדי תאי בת לספור בבוקר. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.