Name: תיוג של פלורסנט תסיסנית לב מבנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-13T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: למדו פרוטוקול לתיוג פלורסנטי של מבני לב בזבובי פירות Drosophila melanogaster בדרגות חיים שונות. שיטה זו מאפשרת ניתוח מורפולוגי מפורט של צינורות הלב באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנטית וקונפוקלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים SI ברנשטיין (סן דייגו סטייט) לקריאה ביקורתית הצעות מועילות לגבי הכנת כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים SI ברנשטיין, SDSU, וכן ר בודמר, BIMR, ועל ידי אחווה פוסט דוקטורט מ שותפים המערבי הברית של איגוד הלב האמריקני אל G. Vogler ו א Cammarato.

<html> לפני שתתחיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ מרגיע (מלאכותי תסיסנית hemolymph (ADH) (ראה &quot;לדמיין את הלב הפועם תסיסנית&quot;) המכיל 10 mM EGTA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקבע (פורמלין 4% 1x PBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBSTx (PBS המכיל 0.1% Triton-X-100) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל כראוי נוגדנים ראשוניים מינים ספציפיים משני שכותרתו fluorescently ב PBSTx </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תסיסנית לחשוף את צינורות הלב (של זבובים בוגרים ו / או זחלים) הבא <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חצי שלם הכנה תסיסנית לב פרוטוקול &quot;לדמיין את הלב הפועם תסיסנית&quot;, או </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסיסנית הזחל NMJ Dissection פרוטוקול 1 בשינויים הבאים: השתמש מחומצן ADH במהלך דיסקציה הזחל וכן לעקור את הסיכה האחורי מעט קו האמצע הגחון. הזחלים נחתכים לאורך קו האמצע הגחון. אין להסיר את כל רקמת לפני קיבעון. </li></ol></li></ol> פלורסנט מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כי כל הלבבות הם בקצב פועם ADH מחומצן. מהר להחליף ADH עם מרגיעה חיץ. לבחון כל צינור לב כדי להבטיח התכווצויות מעוכבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את ליבם על ידי החלפת חיץ מרגיע עם מקבע. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עם רעד עדין. (לקבלת לוחץ הכנה הזחל אין צורך בשלב כלשהו, ​​יכולה להיחשב מזיק שלמות רקמת לב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות שלוש פעמים במשך עשר דקות עם PBSTx בטמפרטורת החדר עם רעד מתמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למבוגרים, בזהירות לקצץ שוב את הקצוות הגחון של לציפורן בטן כזאת מה שנותר הוא אליפטי יותר מעוגל פחות. בנוסף, עם חתך בודד בין הבטן לבין בית החזה, בזהירות למשעי נפרדים בשני מגזרים הגוף להבטיח נזק מינימלי באזור הקדמי של הלב. עבור לבבות הזחל, בזהירות להסיר את השומן בגוף באמצעות מלקחיים בסדר. הסרת שומן חייב להתבצע בזהירות רבה, שכן לב הזחל הוא שברירי במיוחד ויש לו תמיכה מועטה מאוד שרירים אחרים או רקמת חיבור. אין להסיר את הענפים קנה הנשימה כמו זה עלול לגרום נזק ללב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את אזור הגב גזוז לציפורן של הבטן על ידי הקצוות, הימנעות ממגע עם הצינור לב במיקום מרכזי, לתוך צלחת 96 היטב עם בארות המכילים 50-100 μl של נוגדן ראשוני מדולל PBSTx. המקום לא יותר מ 12 דגימות בכל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות עם תסיסה מתמדת. דגירה יכול להיעשות גם בין לילה ב -4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון נוגדן ראשוני. לשטוף את הלבבות שלוש פעמים במשך עשר דקות עם PBSTx 100 μl בטמפרטורת החדר עם רעד מתמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הסרת החיץ לשטוף הסופי, להוסיף 100 μl של נוגדנים משני PBSTx, בתוספת Alexa594-phalloidin (1:1000). דגירה במשך שעה אחת עם רעד מתמשך בטמפרטורת החדר. שמור דגימות מכוסה כדי למנוע הלבנת fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה משנית, לשטוף את הלבבות שלוש פעמים במשך עשר דקות עם 100 μl של PBSTx בטמפרטורת החדר עם רעד מתמשך. שמור את דגימות מכוסה בכל הצעדים כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למען הסר של טריטון-X-100, יש לשטוף את ליבם בפעם האחרונה בשנת 100 μl של PBS למשך 10 דקות. דגימות ניתן לאחסן בחושך על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לפני הרכבה. </li></ol> הרכבה של לבבות למבוגרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציית two 18 x 18 מ&quot;מ מכסה מחליק כדי להחליק מיקרוסקופ עם 10 μl של המדיום Vectashield גובר. Coverslips צריכה להיות מחולקת ~ 10-15 מ&quot;מ זה מזה. המקום טיפה קטנה של third הרכבה בינונית, בין שתי coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 20 μl של Vectashield במרכז coverslip שלישי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להסיר כל הלבבות מפתרון לשטוף PBS על ידי הקצוות הקיצוניים של לציפורן, ומניחים בעדינות להם לב בצד למטה על ירידה של המדיום גובר על coverslip השלישי. המקום לא יותר מחמישה לבבות לכל טיפה על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח לבבות כל פונה כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפוך את coverslip המכיל את הלבבות במהירות למקם אותו על השקופית המכילה את צמד coverslips כזה אגל עם נתיכים צינורות לב עם אגל Vectashield בין זוג coverslip. &quot;גשר&quot; צריך להיות שנוצר על ידי coverslips. לבבות יושעה בין coverslip לבין שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח ליבם כי הם עכשיו פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן coverslips בקצוות שלהם עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבבות מוכנים כעת להיות צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal. </li></ol>ילדה = &quot;jove_title&quot;&gt; הרכבה עבור לבבות הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טיפה (~ 20 μl) Vectashield בשקופית מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות עד שתי דגימות הזחל אל צד להם Vectashield ו להתמצא הגב למטה באמצעות מחטים טונגסטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד לגרור את דגימות מתוך המדיום הרכבה וליישר כל במקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip על צדדים מנוגדים של הדגימה. בעזרת מלקחיים, במקום השלישי coverslip העליון, תחילה על ידי הנחת צד אחד על coverslip האחורי והורדת אותו עד coverslip הקדמי ובכך ליצור גשר. כוחות נימי יגרום לזרימת Vectashield מן האחורי אל הקדמי אשר מסייע יישור תקין של הלב הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן כל coverslips במקום, בקצוות שלהם, עם לק בזהירות למלא את החלל בין coverslips עם Vectashield 20-30 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם עם לק ולאחסן ב 4 ° C, או לצורך אחסון לטווח ארוך ב -20 ° C. </li></ol> נציג תוצאות כאשר מבוצע כראוי, את כל המרכיבים והרקמות הקשורים כלי הגבי צריך להישאר שלם להיות דמיינו בקלות. הקרינה רקע צריך להיות מינימלי. למבוגרים, הגחון האורך שכבת השריר כתמים היטב מייצר אות ממשי (איור 1 ואיור 2). Cardiomyocytes מעגלי הבסיסית לעומת זאת, נוטים שלא להפיק אות אינטנסיבי כמו זה של השכבה שמעליה הגחון. Myocytes של &quot;תא חרוטי&quot; הקדמי של הלב למבוגרים מכילים כמות משמעותית של חומר כויץ, וכתוצאה מכך, האזור הזה מופיע ביחס החזקה ביותר שארית הצינור לב. הלב הזחל מראה ההסדר מתפתלת myofibrillar דומה לזה של cardiomyocytes כויץ מבוגר (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1atmb.jpg" alt="איור 1a" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1btmb.jpg" border="0" alt="איור 1b" /> איור 1: למעלה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה את הצינור כולו לב של מבוגר תסיסנית melanogaster המבטא שרירן-GFP. התמונה צולמה עם מיקרוסקופ Imager Z1 Zeiss פלורסנט מצויד מודול הזזה Apotome. שרירן-GFP מוצג בירוק, אקטין הוא מוכתם AlexaFluor ® 594 phalloidin (אדום) α-actinin מתויג עם נוגדן אנטי-α actinin (כחול). הערה הליך preparative היתרי התאוששות של דגימות לב עם המבנים השתמרו היטב. CC = חרוטי קאמרית: AM = שריר כנפי: V = שסתום פנימי; VLL = שריר הגחון שכבת האורך. בוטום. באזור של הצינור לב מבוגר מ CC דרך קטע הבטן 3 הלב פשוט מתחת לשכבת אורך הגחון מראה את ההסדר מתפתלת myofibril של cardiomyocytes התכווצות. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1a.jpg">לחץ כאן</a> עבור גרסה גדולה יותר של איור 1a ו <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1b.jpg">כאן</a> עבור גרסה גדולה יותר של דמות 1b <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig2tmb.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: ערימות confocal נציג החלק הקדמי של הלב המבוגר מוכתם AlexaFluor ® 594 phalloidin (אדום) אנטי Pericardin (קולגן מסוג IV) (ירוק) נוגדן. Pericardin קשורה בלב פני השטח הגחון, סביר להניח שמקורו myofibrils אוריינטציה longitudinally של שכבת השריר הגחון. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig2.jpg">לחץ כאן</a> עבור גרסה גדולה יותר של הדמות 2. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig3tmb.jpg" alt="איור 3" /> איור 3: מיקרוסקופ פלואורסצנטי של קטע A7 הלב התקין של הזחל שלושה שלבים תסיסנית. התמונה צולמה עם מיקרוסקופ Imager Z1 Zeiss פלורסנט מצויד מודול הזזה Apotome. אקטין התווית AlexaFluor ® 594 phalloidin (ירוק) ו α-actinin הוא מוכתם נוגדן אנטי-α actinin (אדום). אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig3.jpg">לחץ כאן</a> עבור גרסה גדולה יותר של הדמות 3.

<ol><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ostia%2C+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart%2C+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mech Dev. 1, 51-59 (2001).</li>
<li>Dulcis, D., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+innervation+of+the+heart+initiates+retrograde+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 2, 271-280 (2005).</li>
<li>Zeitouni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+adult+heart+formation+revealed+by+gene+expression+profiling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila.</a> PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).</li>
<li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%2C+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change.</a> J. Morphol. 2, 351-399 (1936).</li>
<li>Miller, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster%22">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster</a>. , Wiley. New York. (1950).</li>
<li>Rizki, T. M. The circulatory system and associated cells and tissues. , Academic Press. New York. (1978).</li>
<li>Cammarato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+transducer+mutations+differentially+affect+motor+function%2C+myofibril+structure%2C+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).</li>
<li>Taghli-Lamallem, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+deficiency+in+Drosophila+reduces+lifespan+and+causes+a+dilated+cardiomyopathy+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype.</a> Aging Cell. 2, 237-249 (2008).</li>
<li>Kelso, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+database+documenting+a+GFP+protein-trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).</li>
<li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 7150, 151-156 (2007).</li>
<li>Mery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+muscle+LIM+protein%2C+Mlp84B%2C+is+essential+for+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).</li>
</ol>

כאן אנו מציגים פרוטוקול שימושי עבור הכנת מכתים את כלי melanogaster תסיסנית הגב ורקמות הקשורים עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal. אנו מספקים דיווח תמציתי על הפעולות מעודן על ידי והעסיק נפוץ מכתים יעיל המאפשר היטב נפתרה הדמיה באתרו של הזחל והמבוגר צינורות תסיסנית לב במעבדה שלנו. אחרים תיארו בשיטות דומות בצורה מקוצרת 2, 3, 4. פרטים נוספים דורשים שיקול...

<table><tbody><tr><td>אתילן גליקול-ביס (2-אמינו-אתיל אתר)-N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;חומצה אתילנגליקול-טטרה-אצטית (EGTA)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד, 10%, נקי ממטנול, Ultra Pure</td><td>ריאגנט</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;#174; 594 פלואורסצנט פאלואידין (594 phalloidin)</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield&amp;#174; תוסף הרכבה לפלואורסצנציה עם DAPI</td><td>ריאגנט</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>פיני טונגסטן</td><td>ריאגנט</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק פינים</td><td>ריאגנט</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr></tbody></table>

תיוג של פלורסנט תסיסנית לב מבנים

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; כלי הגבי, או לב, הוא מבנה צינורי מורכבת בשכבה אחת של cardiomyocytes כויץ, תאים קרום הלב כי ליישר משני צדי הקיר הלב, השרירים כנפי תומכת, אצל מבוגרים, שכבת הגחון לתאי שריר האורך. בית סיבי התכווצות שימור מרכיבי cytoarchitecture השריר כולל חבילות בצפיפות של myofibrils ו קומפלקסים חלבונים cytoskeletal / submembranous, אשר אינטראקציה עם הומולוגיים הרכיבים של המטריצה ​​תאיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול קיבעון ואת תיוג פלורסנט של אלמנטים שריר הלב בפרט מלב הזחלים גזור למחצה שלם מבוגר<em&gt; תסיסנית</em&gt;. באופן ספציפי, אנחנו מדגימים את התיוג של sarcomeric F-אקטין של α-actinin בלב הזחל. בנוסף, אנו מבצעים תיוג של ה-F-אקטין α-actinin שרירן ב-GFP להביע זבובים בוגרים של α ו-actinin pericardin, סוג IV תאי מטריקס קולגן, בלב מבוגר בר סוג. תשומת לב מיוחדת ניתנת אסטרטגיה הרכבה למחצה שלם לבבות מבוגר זה ממזער טיפול מייעל את ההזדמנות לשמירה על שלמות הצינורות לב הרקמות קשור. תכשירים אלה מתאימים עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. ככלל, הליך זה מאפשר ניתוח זהיר ומפורט של מאפיינים מבניים של הלב ממערכת מודל גנטי חזק צייתן.

כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי תיוג הניאון של אלמנטים שונים של צינורות הלב של הזחל והמבוגר<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt;. דגימות אלו הן היטב מתאים דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מבני מפורט של התכונות של לבבות מן אורגניזם מודל עוצמה.

הכלי הגבי (dorsal vessel), או הלב, של *Drosophila melanogaster* הוא מבנה צינורי המורכב משכבה אחת של קרדיומיוציטים (תאי שריר לב) מתכווצים, תאי פריקארד...

שלום, אני ניקיטה ארי מהמעבדה של רלף בור בתוכנית לפיתוח והזדקנות במכון ברנהאם למחקר רפואי. אני גיל, גם אני מהמעבדה של בור. היום נראה לכם את הפרוצדורות לסימון פלואורסצנטי של מבני לב עובריים ובוגרים של זבב הפירות.אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי להכין את צינורות הלב לאנליזה מורפולוגית ומבנית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או פלואורסצנטית, במטרה לסמן פלואורסצנטית מבני לב ב-drosophila בוגרת. ראשית, בצעו חתך יחיד בין החזה לבטן בבוגר חלקי-שלם כדי להפריד בין מקטעי הגוף. לאחר מכן, גזרו את הקצוות הוונטרליים הבולטים של הקוטיקולה של הבוגר.בשלב הבא, העבירו וסמנו דגימות של בוגרים או זחלים מנותחים באמצעות נוגדנים ראשוניים ושניוניים. לאחר הסימון, בצעו הרכבה של דגימות בוגרים שטופות על ידי החזקת קצוות הקוטיקולה והנחתן, כאשר צד הלב פונה כלפי מטה, על טיפה של vector shield על זכוכית כיסוי; הפכו את זכוכית הכיסוי על טיפה של מדיום המוקף בשתי זכוכיות כיסוי על עלית, כך שייווצר גשר. כעת הלבבות תלויים במצב זקוף. עבור הרכבת לבבות של זחלים.העבירו את הדגימות למשטחה של תבנית זכוכית כאשר הצדים הבטניים פונים כלפי מטה, והניחו שתי זכוכית כיסוי משני צדי התבנית. לבסוף, צרו גשר באמצעות זכוכית כיסוי שלישית על ידי הנחתה תחילה על זכוכית הכיסוי הסמוכה לקצוות האחוריים של הזחלים. הלבבות מוכנים כעת להדמיה.לפני תחילת הפרוצדורה, הכינו את באפר ההרפיה A DH המכיל A DH כפי שמתואר בפרוטוקול וידאו אחר בסדרה זו, עם מקבע EGTA בריכוז 10 millimolar המורכב מ-4% formaldehyde ב-one X-P-B-S-P-B-S, TX, ונוגדנים ראשוניים מדוללים באופן מתאים ונוגדנים שניוניים מסומנים פלואורסצנטית. ב-PBS TX בצעו דיסקציה של זבובים בוגרים וזחלי דרוזופילה כדי לחשוף את הצינורות הלבביים, בהתאם להכנת לב דרוזופילה חלקי-שמור המוצגת בפרוטוקולי הווידאו להדמיית לב פועם בדרוזופילה ובפרוטוקול הדיסקציה של NMJ בזחלי דרוזופילה. אך עם שינויים: השתמשו ב-a DH מחומצן במהלך דיסקציית הזחלים, והזיזו מעט את המסמרים האחוריים מקו האמצע הוונטרלי של הזחל.בצעו חיתוך לאורך קו האמצע הגחוני. אין להסיר רקמה כלשהי לפני הקיבוע בשלבים הבאים. התחילו את הליך הסימון בבדיקה תחת מיקרוסקופ שכל הלבבות מתכווצים ונרפים באופן קצבי ב-A DH מחומצן. לאחר מכן, החליפו במהירות את ה-A DH בבפר רגיעה (relaxing buffer) ובחנו שוב כל צינור לבבי כדי לוודא שההתכווצויות נבלמו.המשיכו בקיבוע הלבבות על ידי החלפת בופר ההרפיה (relaxing buffer) במקבע. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עם ניעור עדין. שימו לב כי עבור דגימות של זחליים, ניעור אינו נחוץ באף שלב ואף עלול לפגוע בשלמות רקמת הלב.בסיום 20 דקות, הסר את מקבע הרקמות (fixative) ושטוף את הדגימות שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם עם P-B-S-T-X. בטמפרטורת החדר ותוך כדי ניעור רציף עבור הבוגרים, בצע חיתוך יחיד בין הבטן לחזה באופן זהיר ונקי. הפרד בין שני מקטעי הגוף כדי להבטיח נזק מינימלי לאזור הקדמי של הלב.היזהרו שלא לחתוך לתוך המקטע הבטני הקדמי, שם נמצאה התא הקוני של הלב. בחנו את הדגימה תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהחיתוך בוצע בצורה נקייה. לאחר מכן, גזמו בזהירות קצוות ונטראליים בולטים של הקוטיקולה הבטנית, כך שהחלק שנותר יהיה אליפטי יותר ופחות עגול.עבור לבבי זחלים, הסר בזהירות את גוף השומן באמצעות פינצטה עדינה. בצע זאת בזהירות יתרה. מכיוון שלבב הזחל שברירי במיוחד ונתמך במעט מאוד על ידי שרירים אחרים או רקמה חיבורית, אין להסיר את ענפי הקנה, שכן הדבר עלול לפגוע בלב.בשלב הבא, דגרו עם הנוגדן הראשוני, המדולל ב-PVS TX ומועבר בנפח של 50 µL לכל באר בלוח של 96 בארות. עבור זבובים בוגרים, החזיקו את הקוטיקולה הגבנית הגזומה בשוליים, ללא מגע בצינור הלב הממוקם במרכז, והעבירו ללוח. הניחו לא יותר מ-12 דגימות בכל באר ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים תחת ערבול רציף.החזיקו את דגימות הזחלים בקצה באמצעות פינצטה והעבירו אותן לבאר מלאה ב-P-B-S-T-X. שוב, אין לנער את דגימות הזחלים בסיום הדגירה. הסירו את תמיסת הנוגדן הראשוני.שטוף את הלבבות שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם עם 100 µL של P-B-S-T-X בטמפרטורת החדר; לאחר השטיפה האחרונה, הוסף 100 µL של הנוגדן המשני ב-PBS tx המועשר ב-Alexa 594 Phin. השאר את הדגימות מכוסות מעתה ואילך כדי למנוע הבהרה של הפלואורופור, והדגר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הסר את תמיסת הנוגדן המשני ושטוף את הלבבות שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם עם 100 µL של P-B-S-T-X בטמפרטורת החדר.לבסוף, הסירו את ה-TRITTON X 100 על ידי שטיפת הלבבות ב-100 µL של PBS למשך 10 דקות. ניתן לשמור את הדגימות בחושך בטמפרטורה של 4 °C למשך מספר ימים לפני ההרכבה. ראשית, הכינו את הזריקה להרכבה.יש להטיל שלוש טיפות של 10 µL של תמיסת קיבוע Vector Shield במרווחים שווים על זכוכית של מיקרוסקופ. יש להניח שתי מכסיות זכוכית בגודל 18 על 18 מילימטר על הטיפות החיצוניות, תוך שמירה על מרחק של כ-10 עד 15 מילימטר בין המכסיות.בנוסף, יש להניח 20 µL של vector shield במרכז של לביבת זכוכית (cover slip) שלישית. לאחר מכן, החזיקו את הזבוב הבוגר המנוסח בקצוות החיצוניים של הקוטיקולה. כדי להוציאו בזהירות מתמיס השטיפה PVS, הניחו אותו בעדינות כאשר צד הלב פונה כלפי מטה על טיפת תוכן ההרכבה בלביבת הזכוכית השלישית, תוך הגבלה של עד חמישה לבבות לטיפה על לביבת הזכוכית.לאחר הנחת הלבבות על הטיפה הנמצאת על לוכית המכסה, בדקו תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שכל הלבבות פונים כלפי מטה. כעת הפכו בזהירות את לוכית המכסה עם הלבבות והניחו אותה במהירות על העגלה, כאשר אתם מחזיקים את זוג לוכיות המכסה כך שהטיפה של לוכית המכסה ההפוכה המכילה את צינורות הלב תתמזג עם טיפת מגן הווקטור המנוחה במרווח שבין לוכיות המכסה. בדרך זו, שלוש לוכיות המכסה יוצרות גשר.הלבבות יותלו בין זכוכית כיסוי אמצעית לבין המיקרוסקופ. החלקו את הזכוכית מתחת לגשר ובדקו תחת המיקרוסקופ, באמצעות לק, כדי לוודא שלבבות הזבובים הבוגרים פונים כעת כלפי מעלה. קבעו את זכוכית הכיסוי בקצוותיה.הלבבות מוכנים כעת לדימות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או קונפוקלית. כדי להכין את הלבבות של הזחלים למיקרוסקופיה, הניחו טיפה של כ-20 µl של BTA shield על זכוכית מיקרוסקופ באמצעות פינצטה עדינה. אחזו בזחלים בקצות הקוטיקולה והעבירו אותם בזהירות אל תוך הטיפה.הכווינו את הזחלים כך שהצד הגבי יהיה כלפי מטה בעזרת מחטי טונגסטן. הניחו עד שני זחלים על תיתור (slide) אחד. לאחר מכן, גררו כל דגימה אל מחוץ לתווך הקיבוע וסדרו את הזחלים במקביל.הניחו באמצעות פינצטה זכוכית כיסוי על כל צד של הלבבות המיושרים. הניחו זכוכית כיסוי שלישית מעל, תחילה על ידי הנחת צד אחד על זכוכית הכיסוי הקדמית והורדתה אל זכוכית הכיסוי האחורית. כך ייווצר גשר.כוחות קפילריים יגרמו לזרימה של vector shield מהחלק האחורי לקדמי, דבר המסייע ליישור נכון של לב הזחלים. לבסוף, קבעו את כל לוחות הכיסוי במקומם בקצוותיהם באמצעות לק ציפורניים ומלאו בזהירות את הרווח שבין לוחות הכיסוי ב-20 עד 30 µL של vector shield, אטמו בלק ציפורניים ואחסנו בטמפרטורה של 4 °C לאחסון לטווח קצר או ב-20 °C- לטווח זמן ארוך יותר. כאשר הפרוצדורה מבוצעת נכון, כל הרכיבים והרקמות הקשורות לכלי הדם הגבי (dorsal vessel) צריכים להישאר שלמים ולהיות ניתנים לצפייה בקלות.הפלואורסצנציית הרקע צריכה להיות מינימלית בבוגרים. שכבת השריר האורכית הבטנית נצבעת היטב ומפיקה אות משמעותי. עם זאת, קרדיומיוציטים מעגליים שמתחתיה נוטים להפיק אות פחות עז מזה שמגיע מהשכבה הבטנית העליונה.המיוציטים של התא הקוני הקדמי בלב הבוגר מכילים כמות ניכרת של חומר מכווץ, וכתוצאה מכך, אזור זה נראה כחזק ביותר ביחס לשאר צינור הלב. התמונה של לב הזחל מראה סידור של סיבי שריר במבנה ספירלי. בדומה לתאי שריר לב מכווצים של בוגרים, הצגנו כעת את הפרוטוקול להכנה וצביעה של לבבות ביצתיים עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וקונפוקאלית.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להגביל כל טיפול מיותר. דבר זה יבטיח מבנה לבבי שלם ומשומר יותר. פרוטוקול זה משמש כנקודת התחלה בלבד.בדומה לכל פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה אחר, נוגדנים שונים דורשים תנאים שונים ויש לאופטימיזציה שלהם באופן פרטני. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בצביעה שלכם.

fluorescent-labeling-of-drosophila-heart-structures

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקה נדרש לדמיין את הלב הפועם של הזחל...

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית</em

אנו מתארים תהליך להטבעת קיבעון, חתך, הדמיה של שלב...

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

אנו מציגים טכניקה לסימון תאי עצב בודדים במערכת העצבים המרכזית (CNS)...

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

אנו מתארים סדרה של שיטות להזריק צבעים, וקטורי DNA, וירוסים, ותאים במטרה לעקוב אחר שני גורל התא והפנוטיפ של תאי אנדוגני והמורכבים שמקורם בתאים עובריים או pluripotent בעוברי עכברים ביום עוברי (E) 9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של Drosophila melanogaster המבטא eNpHR2.0 או ReaChR opsins בלב עבור הדמיית OCT וקצב לב אופטוגנטי. מדווחות הוראות מפורטות להדמיית Drosophila OCT ואפנון פעימות לב, כולל סימולציה של דום לב בר-שחזור, ברדיקרדיה וטכיקרדיה בבעלי חיים חיים בשלבי התפתחות שונים.

פיתוח מודלים דרוזופילה מלנוגסטר להדמיה ובקרה אופטוגנטית של תפקוד הלב

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

פרוטוקול חתך הלב וההדמיה הקרינה של דרוזופילה מפשט את חקר מבנה הלב והפתולוגיות. גישה זו כוללת חתך, צביעה והדמיה פשוטים, תוך עקיפת המומחיות הטכנית הדרושה לנתיחה מסורתית. זה משפר את הנגישות, מה שהופך את הדרוזופילה למודל שמיש יותר למחקר הקשור ללב בקרב הקהילה המדעית הרחבה יותר.

שיטה חדשנית ויעילה לצביעה פלואורסצנטית של לב דרוזופילה עם הקפאה

למדו פרוטוקול לתיוג פלורסנטי של מבני לב בזבובי פירות Drosophila melanogaster בדרגות חיים שונות. שיטה זו מאפשרת ניתוח מורפולוגי מפורט של צינורות הלב באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנטית וקונפוקלית.

תיוג של פלורסנט תסיסנית לב מבנים

גלה סרטונים נוספים