Name: ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: חקור שיטת ELIME לאיתור מיקוטוקסינים בדגימות מזון באמצעות חישוף אלקטרוכימי ונוגדנים מגנטיים. השיטה מציעה רגישות גבוהה לזיהוי רעלנים פטרייתיים מסוכנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות ננסי דאונר וכל חברי מהמעבדה של כימיה אנליטית, אוניברסיטת רומא &quot;טור Vergata&quot; על שיתוף הפעולה שלהם ותמיכה לוגיסטית. עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי את הפרויקט &quot;BioCop&quot;.

1) חסימה חרוזים מגנטיים מצופה: המשך כמו בצע לחסום חרוזים מגנטי מצופה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מערכת של 2 צינורות מ&quot;ל Eppendorf; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize (רועד אך לא vortexing) חרוזים מגנטיים מצופה (ראה נספח להכנת חרוזים מגנטיים מצופה) באמצעות מדגם מסתובבת מערבל; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר homogenization, פיפטה 10 μl של חרוזים מגנטיים מצופה לתוך כל צינורות נפרדים Eppendorf; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1ml של חלב דל שומן חוסם פתרון לתוך הצינור כל Eppendorf של קבוצת; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו חרוזים מגנטיים דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מיקסר מדגם מסתובב; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת חסימה הפתרון: לעשות זאת במקום הצינורית concentrator החלקיקים המגנטיים עם החלק המגנטי לשים על 2 דקות (ראה חרוזים מגנטיים דבק על הקיר לרוחב של הצינור); בזהירות פיפטה את supernatant, עוזב חרוזים באין מפריע; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של PBS חיץ NaN + 3 + BSA כפתרון אחסון עבור כל צינור; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות חרוזים מגנטיים מצופה חסום ב 4 ° C (שים לב חרוזים מגנטיים מצופה יציבים לפחות 2 חודשים 4 ° C); </li></ol> 2) שרשרת החיסוני על חרוזים מגנטיים לבנייה של עקומת הכיול וניתוח מדגם המשך כמו בצע יש חרוזים מגנטיים מוכן למדידה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח אחד Eppendorf צינור (2 מ&quot;ל) של פתרון מצופה חסומים לחלץ כל דגימה שאתה הולך לנתח; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו צינור נוסף Eppendorf לפתרון כל calibrant עבודה; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize חרוזים מגנטיים עבור 2 דקות על מיקסר מדגם מסתובב לפני השימוש; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת נוזל אחסון באמצעות concentrator החלקיקים המגנטיים; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים מגנטיים שלוש פעמים עם פתרון PBS / BSA כביסה. הסר כביסה נוזלי; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב התחרות: הוסף עבור כל שפופרת המכילה חרוזים שטף מגנטי, 200μl מדגם מוכן לחלץ; להשתמש באחד צינור חרוז מגנטי עבור כל דגימה. חזור על אותו תהליך עבור כל פתרון סטנדרטי. הוסף 200 μl של פתרון נוגדן חד שבטי כדי צינור כל חרוז מגנטי. תנו חרוזים מגנטיים דגירה במשך חצי שעה על מיקסר מדגם מסתובב בטמפרטורת החדר; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינורות Eppendorf הפתרון משמש שלב התחרות; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג צעד: הוסף 400μl של נוגדנים משני שכותרתו כל צינור מגנטי Eppendorf חרוז. תנו חרוזים מגנטיים דגירה במשך חצי שעה על מיקסר מדגם מסתובב בטמפרטורת החדר; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תיוג פתרון משפופרות Eppendorf; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים מגנטיים שלוש פעמים עם PBS / tween ® 20 הפתרון כביסה. הסר את נוזלי; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend עם 100μl של ה-DEA חיץ כל aliquot חרוזים מגנטיים. עכשיו חרוזים מגנטיים מוכנים לשלב מדידה אלקטרו; </li></ol> 3) האסיפה של PalmSens עם מרבב (MUX) אפשרויות שימו לב: מוצר הידרוליזה אנזימטית של המצע עבירות על פני האלקטרודה, ומסיבה זו אלקטרודה חדשה נדרשת לכל מדידה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור המחשב הנייד כדי PalmSens דרך כבל סדרתי; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את תקע 9-DIN של מרבב CH8 עם PalmSens. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור כבל טורי של קשר שמונה ערוץ Mux חשמלי עם מרבב CH8; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודה מקום רצועה ברחוב מגנט שמונה. שימו לב בכל מקום מגנט תחת כל אלקטרודות עבודה (לשים לב, את הצורך של מגנט יחיד עבור כל אלקטרודה הכרחי אחרת החלקיקים המגנטיים לא יהיה מרוכז באזור האלקטרודה עובד); </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את רצועת אלקטרודות במגע eight ערוץ Mux חשמלי; </li></ol> עבור המדידה DPV להשתמש בפרמטרים הבאים בתיבות המתאימות: E להתחיל: 0 (V); בסוף E: 0.6 (V); צעד E: 0.016 (V); E הדופק: 0.0339 (V); E מיזוג: 0 (V); בתצהיר E: 0 (V); קצב סריקה : 0.1 (V / s); T הדופק: 0.06 (ים); מיזוג T: 0 (s); בתצהיר T: 0 (s); איזון T: 8 (ים). 4) התגובה האנזימטית אלקטרוכימי מדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize ידי בעדינות רועד כל צינור Eppendorf המכילה חרוזים מגנטיים מוכן לשלב מדידה אלקטרו מנת לקבל השעיה מפוזר היטב של חרוזים מגנטיים; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה מכל Eppendorf, מיד לאחר homogenization, aliquot של 20 μl של פיזור חרוז מגנטי על משטח אלקטרודה המקביל העבודה. עבור כל אלקטרודה של להשתמש באחד רצועה 20 μl של חרוזים מגנטיים שנלקחו שונים צינורות Eppendorf (למשל לשימוש eight eight אלקטרודה Eppendorf שונים); </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 μl של פתרון המצע אנזימטית על האלקטרודה הראשונה. התחל 2 דקות לספור למטה. לאחר 14 שניות, להוסיף 80 μl של פתרון המצע אנזימטית על האלקטרודה השנייה. אחרי עוד 14 שניות, להוסיף 80 μl של פתרון המצע אנזימטית על האלקטרודה השלישית. המשך ב int באותו זמןerval (14 שניות) עד אלקטרודה האחרון (כלומר: כל טיפה aliquot המצע במרווחים של 14 שניות). השעה מרווח של 14 שניות מחושב הזמן הנדרש על ידי potentiostat לבצע את המדידה, של לב, הפתרון 80 μl על חיישן זה אמור לכסות את האלקטרודה, עובד התייחסות נגדית. יתר על כן, פתרונות חיישן אחד לא צריך לבוא במגע עם פתרונות של אלקטרודות השכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 דקות לספור למטה בנוסף הראשון של פתרון המצע האנזימטית, להתחיל את המדידה אלקטרוכימי; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Lite PalmSens תוכנה כדי להשיג פסגות הנוכחי (μA) עבור כל פתרון. </li></ol> 5) חישוב הקמת עקומת כיול באמצעות משוואה לוגיסטית 4 פרמטרים ולחשב את ריכוז כמות HT-2/T-2 סך הרעלן ננוגרם למיליליטר עבור כל שפופרת המכילה Eppendorf מדגם לא ידוע. נתוני הניסוי, גובה השיא (μA) נגד ריכוז calibrants (ng / ml), צריך להיות מצויד שימוש שאינו ליניארי ארבע פרמטר לוגיסטי (4-PL) העלילה המשוואה (1) (באמצעות מגרש סיגמא 8.0 או Kaleidagraph). המודל קוי 4-PL מאומץ בדרך כלל כדי לתאר את מבחני מחייב ליגנד (LBAs) 6. <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq1.jpg" alt="משוואה 1" /> (1) a, b, x0, Y0 פרמטרים לוגיסטיים כמו שניתן על ידי תוכנית עקומת Sigma מגרש מתאים. השתמש בנוסחה כדי לחשב ולהסביר את התוכן של הסכום הכולל HT-2/T-2 הרעלן הפתרון מדגם בדילול לחלץ <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq2.jpg" alt="משוואה 2" /> (2) x הוא ריכוז מסה של הסכום הכולל של HT-2/T-2 רעלים פתרון תמצית מדוללת, מחושב מן המשוואה 4 פרמטרים לוגיסטי Nanogram לכל milliltre (ng / ml) y הוא הערך הנוכחי μA שהתקבלו במדגם לא ידוע נספח 6) חרוזים מגנטיים מצופה המשך כמו בצע יש חרוזים מגנטי מצופה: כביסה נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize Dynabeads tosylactivated ® M-280 (פתרון המניה 2 x 109 חרוזים / ml) על ידי רועדת vortexing (מהירות מרבית) דקות 1 (למנוע הקצפה) (נא לציין את הריכוז של חרוזים מגנטיים צריך להיות תמיד זהה, כדי להבטיח שחזור ב המדידה); </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד פיפטה 1 מ&quot;ל של חרוזים הומוגני לעיל לתוך צינור 2 Eppendorf מ&quot;ל; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורית concentrator החלקיקים המגנטיים עם החלק המגנטי לשים על 2 דקות (ראה חרוזים מגנטיים דבק על הקיר לרוחב של הצינור); </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות פיפטה את supernatant, עוזב חרוזים באין מפריע; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את הצינור מתוך Eppendorf concentrator החלקיק המגנטי resuspend את החרוזים מ&quot;ל 1 של ה-pH 0.1 borate חיץ M 9.5. מערבבים בעדינות במשך 2 דקות במיקסר המדגם סיבוב 2 דקות; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את supernatant; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של תמיסת חיץ borate לתוך הצינור Eppendorf. חרוזים מגנטיים נמצאים כעת מוכן לשלב ציפוי; </li></ol> ציפוי נוהל <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 600 מ&quot;ל של HT-2 מצומדות עם פתרון (Hemocyanin Keyhole צלחית) מניות KLH כדי מ&quot;ל 1 של חרוזים מגנטיים) (סופי HT-2-KLH ריכוז של 375 מ&quot;ג / מ&quot;ל); חרוזים מגנטיים לדגור HT-2-KLH פתרון 20h ב 37 ° C * עם סיבוב איטי על הטיה וסיבוב מיקסר מדגם; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי מקום דגירה את הצינורית concentrator החלקיקים פיפטה מגנטי את supernatant; לשטוף חרוזים מצופים פעמיים עם 1 מ&quot;ל של תמיסת PBS / BSA חיץ. בין כביסה להסיר כל PBS / BSA פתרון. כל צעד כביסה בוצעו הגדרה חרוזים מגנטיים PBS / BSA על מערבל סיבוב 5 דקות; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים מגנטיים פעם באמצעות 1 מ&quot;ל של תמיסת טריס / BSA חיץ. הסר טריס / פתרון BSA. ביצוע שלב זה על ידי הגדרת חרוזים מגנטיים טריס / BSA חיץ על סיבוב מערבל עבור 4 שעות ב 37 ° C *; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים מגנטיים פעם באמצעות 1ml של רענון (נשמר במקרר ב 4 מעלות צלזיוס) PBS / פתרון BSA חיץ. הסר PBS / BSA פתרון. ביצוע שלב זה הגדרה חרוזים מגנטיים PBS / BSA חיץ על סיבוב מערבל עבור 5min בטמפרטורת החדר; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כביסה צעד להסיר את כל נוזל כביסה להוסיף 1 מ&quot;ל PBS חיץ NaN + 3 + BSA כנוזל האחסון; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות חרוזים מגנטיים מצופה ב 4 ° C (שים לב חרוזים מגנטיים מצופה יציבים לפחות 2 חודשים 4 ° C); </li></ol> * לצורך זה מערבל ממוקם בתנור מצויד עם חור המאפשר הכניסה של כבל אספקת החשמל. לחלופין המיקסר יכול להיות ממוקם בחדר thermostated על 37 ° C. 7) Sample הכנה מיצוי 25 גרם של דגימת טחון (אוכל ארוחת בוקר או דגנים לתינוק) אנחנוighed לצנצנת בלנדר והוציא עם 100 מ&quot;ל של אצטוניטריל / פתרון המים (86/14) במשך 3 דקות במערבל במהירות גבוהה. לאחר צנטריפוגה ב 4000 סל&quot;ד (3,000 גרם) במשך 5 דקות, 8 מ&quot;ל של supernatant נלקחו מטוהרים עם טור Mycosep, 4 מ&quot;ל של לחלץ את ניקו יובשו תחת זרם חנקן. דגימות יבשים יכולים להיות מאוחסנים ב -30 ° C עד מספר חודשים. 8) הכינון מחדש לדוגמא ארוחת בוקר דגנים מחדש את ארוחת הבוקר לחלץ דגנים יבשים (מזון דגנים מבוסס שהופנתה לצריכה מבוגר) עם 40 מ&quot;ל של PBS pH 7.4. בדרך זו מדגם עם ריכוז של רעלן שווה להגביל המשפטי אמור (200 ng / g) ייתן בשלב המדידה אות נופלת באמצע טווח העבודה. מזון לתינוקות מחדש מזון יבש לחלץ תינוק (אוכל דגני בוקר המבוססים שהופנתה לצריכה התינוק) עם 4 מ&quot;ל של PBS. בדרך זו מדגם עם ריכוז של רעלים שווה להגביל המשפטי אמור (20-25 ng / g) ייתן בשלב המדידה אות נופלת באמצע טווח העבודה.

<ol><li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Letters%22%5BJournal%5D)">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li>
<li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals%5BTitle%5D)+AND+%22Fresenius+J.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li>
<li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li>
<li>FAO Food and Nutrition Paper 74. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. 2001 Feb 6-15, Geneva, , Food & Agricultural Organization of the United Nations. 115 (2001).</li>
<li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li>
<li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li>
<li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l, Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li>
</ol>

השימוש נוגדנים כמו בדיקה הכרה biomolecular ראה השימוש הנרחב בטכנולוגיות חישה; מתודולוגיות גילוי immunochemical, כגון ELISAs ו MEIAs, נמצאים, כיום, בין פלטפורמות השתמשו ביותר מיושם במעבדות רבות 7. בעוד הגישות הללו להשיג רגישות וספציפיות חריגים, המטרה העיקרית של קבוצות מחקר רבות בשנים האחרונות שיפור ואופטימיזציה של הופעות שלהם. בפרוטוקו...

ריאגנטים <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> אשלגן כלורי </td><td> סיגמא </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> אשלגן זרחתי dihydrogen </td><td> סיגמא </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Disodium פוספט מימן </td><td> סיגמא </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> סיגמא </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 anhydrous </td><td> סיגמא </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> ה-DEA (99.5%) </td><td> סיגמא </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> סיגמא </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> סיגמא </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> טריס [hydroxymethyl]-aminomethane </td><td> סיגמא </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> ארגון ה-BSA (אלבומין בסרום שור) </td><td> סיגמא </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> סיגמא </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> סיגמא </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 3 NaN </td><td> אלדריץ&#39; </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-Naphthyl disodium מלח פוספט </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> חלב פתרון ריפרף חסימת - ללא חלב יבש שומן </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 מצומדות עם KLH (Hemocyanin Keyhole צלחית), פתרון מניות (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> HT-2-KLH המצומד הושג על ידי שיטת-CDI שם חופשי OH-לקבוצות על המיקום 3 ו -4 על רעלן HT-2 היו מופעלים על ידי N, N&#39;-carbonyldiimidazole (CDI) ואת הפעלת HT-2 היה רעלן בואו להגיב aminogroups של החלבון (KLH) כדי ליצור הצמדה carbammate יציב. </td></tr><tr><td> נוגדן הנקרא משניים: אנטי עכבר IgG (H + L) מסוס, מצומדות עם phosphatase אלקליין, בריכוז 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </td><td> וקטור מעבדות </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 רעלן </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חרוזים מגנטיים: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> ריכוז 2 x 10 9 חרוזים / ml. </td></tr></table> פתרונות <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> הכנה </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> שנאגרו מלוחים פוספט (PBS), pH 7.4 </td><td> להמיס 0.20 גרם של אשלגן כלורי, 0.20 גרם של אשלגן dihydrogen פוספט, 1.16 גרם של מימן disodium פוספט ו 8.00 גרם של נתרן כלורי ב 900 מ&quot;ל מים </td><td></td></tr><tr><td> Diethanolamine חיץ, DEA, 0.97 מ &#39;+ 1 mM MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 </td><td> ממיסים 0.0476g של MgCl 2 anhydrous ו 7.3.59 גרם של KCl ב ~ 300 מ&quot;ל מים. לאחר פירוק להוסיף 51 מ&quot;ל של ה-DEA (99.5%). התאם ל-pH 9.8 עם HCl (6 ז). מדולל 500 מ&quot;ל מים. </td><td></td></tr><tr><td> חיץ borate, 0.1 מ &#39;, pH 9.5 </td><td> להמיס 3.09 גרם של H 3 BO 3 ב ~ 300 מ&quot;ל של מים מזוקקים, כדי להתאים את pH 9.5 עם NaOH ו / או HCl (6 M או בריכוזים נמוכים). מדולל 500 מ&quot;ל עם מים מזוקקים. </td><td></td></tr><tr><td> טריס חיץ, 0.2 מ &#39;, pH 8.5 </td><td> להמיס 3.85 גרם של טריס [hydroxymethyl]-aminomethane ב 100 מ&quot;ל מים. התאם ל-pH 8.5 עם NaOH ו / או HCl (6 M או בריכוזים נמוכים). מדולל ל 200 מ&quot;ל מים. </td><td></td></tr><tr><td> טריס חיץ + BSA פתרון (0.1%), pH 8.4 </td><td> ממיסים 0.050 גרם של BSA ב 50 מ&quot;ל של חיץ טריס pH 8.4. </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> PBS חיץ + tween ® 0.05% </td><td> ממיסים 0.250 גרם tween 20 ב 500 מ&quot;ל של הכינו בעבר PBS חיץ, pH 7.4 </td><td></td></tr><tr><td> PBS חיץ + BSA פתרון 0.1% </td><td> ממיסים 0.050 גרם של BSA ב 50 מ&quot;ל של PBS חיץ, pH 7.3. </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> PBS חיץ BSA + 0.1% + NaN 3 0.02% </td><td> ממיסים 0.050 גרם ו - 0.010 BSA של NaN 3 ב 50 מ&quot;ל של PBS חיץ, pH 7.3. </td><td> אחסון סולution </td></tr><tr><td> אנזימתי המצע </td><td> ממיסים 0.010 גרם של מלח 1-Naphthyl סודיום פוספט ב 100 מ&quot;ל של pH חיץ DEA 9.8. לעטוף את הבקבוק היטב בנייר אלומיניום. </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> חלב פתרון ריפרף חסימת </td><td> הוסף 0.20 גר &#39;של סופג חוסם כיתה ללא שומן חלב יבש (Bio-Rad, הרקולס, קליפורניה, ארה&quot;ב) עד 200 מ&quot;ל של PBS חיץ pH 7.3. </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> HT-2 מניות פתרון </td><td> להמיס 10 מ&quot;ג של הבקבוקון trichothecene HT-2 רעלן, ב 10 מ&quot;ל של אצטוניטריל לתת פתרון עם ריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </td><td> פצל את הפתרון הזה לתוך לשימוש יחיד aliquots של 30 מ&quot;ל ולאחסן אותם בפחות מ -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2 עבודה פתרון סטנדרטי </td><td> פיפטה 20 מ&quot;ל של תמיסת HT-2 מניות רעלן לתוך מ&quot;ל 2 מכויל בקבוק volumetric ו לדלל עם אצטוניטריל להשיג פתרון HT-2 עבודה המכיל 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של רעלן trichothecene. </td><td> פתרון זה אמור להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> HT-2 calibrant פתרונות עבודה </td><td> לדלל את הפתרון HT-2 תקן עובדים (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) להכין פתרון calibrant עובד 100 ng / ml. מדולל HT-2 עובדים פתרון calibrant 100 ng / ml להכין עבודה פתרונות calibrant הריכוזים הבאים 0 (ריק), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> פתרונות אלה צריכים להיות מוכנים טריים ביום השימוש. </td></tr><tr><td> HT-2 מצומדות עם KLH </td><td> פצל את HT-2 מצומדות עם פתרון (Hemocyanin Keyhole צלחית) מניות KLH (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PBS) לתוך לשימוש יחיד aliquots של μl 350. </td><td> חנות aliquots ב -30 ° C. </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי ספציפי </td><td> מדולל 1:350 (v: v) את ריכוז מניות (1.383 מ&quot;ג / מ&quot;ל) של נוגדנים חד שבטיים ב PBS להשתמש בשלב התחרות </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ברגע השימוש. 10 מניות מ&quot;ל נוגדן פתרון PBS עבור נפח סופי של 3.5 מ&quot;ל, הם מספיק כדי לנתח 17 תקנים ו / או דוגמאות. </td></tr><tr><td> נוגדן תווית משני </td><td> אנטי עכבר IgG (H + L) מצומדות עם phosphatase אלקליין הוא מדולל 1:100 (v: v) ב-PBS להשתמש בשלב התחרות. </td><td> 100 μl נוגדן מניות פתרון PBS עבור נפח סופי של 10 מ&quot;ל, הם מספיק כדי לנתח 25 תקנים ו / או דוגמאות. פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ברגע השימוש. </td></tr></table> מנגנון <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> חלקיקים מגנטיים מרוכז: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens מכשיר </td><td> PalmSens </td><td> מסופק עם PalmSens לייט, כבל חיבור טורי מחשב נייד ו Mux תוכנה אפשרויות </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens מרבב </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> שמונה Mux ערוץ מגע חשמלי </td><td> עבודת יד </td><td></td></tr><tr><td> רצועת עם שמונה אלקטרודות מסך מודפסים (SPES) </td><td> עבודת יד </td><td></td></tr><tr><td> תמיכה תוכנן במיוחד עבור רצועת אלקטרודות </td><td> עבודת יד </td><td> כולל 8 מגנטים ניאודימיום שכל אחד מהם ממוקם מתחת לפני השטח כל אלקטרודה העבודה של SPE </td></tr><tr><td> Microliter pipettes מכויל </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Stirrer מגנטי וברים ומערבבים. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> זכוכית כוסות (100, 50, 20 מ&quot;ל). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נפחית צלוחיות (2ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 ו 2ml Eppendorf צינורות. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> פלקון ™ שפופרות של 5 מ&quot;ל ו - 15 מ&quot;ל. </td><td> בז </td><td></td></tr><tr><td> מעבדה וורטקס מערבל </td><td></td><td> אין להשתמש במיקסר מערבולת כדי resuspend חרוזים מגנטיים מצופה HT2-KLH או מקושרים עם שרשרת החיסונית כדי למנוע denaturing חלקים proteic </td></tr><tr><td> מעבדה תנור או חדר thermostated </td><td></td><td> בחרו תנור מסוגלים לשמור על טמפרטורה של 37 ± 3 ° C. </td></tr></table>

elime (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור mycotoxin

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays הם אלטרנטיבה חוקית ועד יקר יותר זמן רב כמותי HPLC או GC 1, 2 שיטות לאיתור הקרנת mycotoxins מסוכנים מצרכי מזון. בפרוטוקול זה אנו מראים כיצד לפברק ולחקור אנזים אלקטרוכימיים תחרותי assay immunomagnetic המקושרים המבוססים על שימוש של חרוזים מגנטיים תמיכה מוצקה עבור שרשרת immunochemical 3 ואלקטרודות מסך מודפס חישה פלטפורמה. השיטה שלנו שואפת לקבוע את הסכום הכולל של HT-2 ו-T-2 רעלים, mycotoxins השייכת למשפחת trichothecenes ושל דאגה רבה לבריאות האדם 4. השימוש שיבוט נוגדן עם תגובתיות צלב של 100% כלפי HT-2 ו-T-2 מאפשרת לזהות בו זמנית הן רעלים עם רגישות דומה 5. הצעד הראשון של assay שלנו היא הצעד ציפוי שבו אנו לשתק HT2-KLH רעלן המצומד על פני השטח של חרוזים מגנטיים. אחרי צעד חסימה, הכרחי כדי למנוע אי - קליטה ספציפיות, תוספת של נוגדנים חד שבטיים מאפשר תחרות בין משותקת HT-2 ו חינם HT-2 או T-2 להציג במדגם או מומס בתמיסה סטנדרטית. בסוף שלב התחרות, כמות נוגדנים חד שבטיים קשור משותקת HT-2 יהיה ביחס הפוך לכמות רעלן בפתרון המדגם. נוגדנים משני שכותרתו עם phosphatase אלקליין (AP) משמש כדי לחשוף את מחייב בין הנוגדן הספציפי משותקת HT-2. צעד המדידה הסופית מתבצעת על ידי הטלת aliquot ההשעיה חרוז מגנטי, המתאים פתרון מדגם מסוים / רגיל, על פני השטח של האלקטרודה המסך המודפס עבודה; חרוזים מגנטיים הם משותקים ומרוכז באמצעות מגנט ממוקם בדיוק מתחת מסך מודפס אלקטרודה. אחרי שתי דקות של דגירה בין חרוזים מגנטיים מצע עבור AP, המוצר האנזימטית הוא זוהה על ידי Voltammetry דיפרנציאלי Pulse (DPV) באמצעות מכשיר נייד (PalmSens) יכול גם ליזום באופן אוטומטי eight מדידות תוך הפסקה של כמה שניות.

פרוטוקול לזהות trichothecenes (mycotoxins של דאגה לבריאות האדם) בשיטת ההקרנה החדשה שפותחה על בסיס שיטת immunochemical תחרותי זיהוי סופי אלקטרוכימיים מודגם.

ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

בדיקות אימונו-ספיציפיות (Immunoassays) מהוות חלופה תקפה לשיטות ה-HPLC או ה-GC הכמותיות, שהן יקרות יותר ודורשות זמן רב יותר, לצורך סריקה וגילוי של חומרים מסוכנים...

שלום, שמי פרנצ'סקו ליצ'י. אני חוקר פוסט-דוקטורט במעבדה הביואנליטית של פרופסור פאלקי באוניברסיטת רומא טובה גאטה. היום, יחד עם עמיתיי, אדגים לכם הכנה של חיישן אלקטרוכימי לזיהוי של רעלן הפטרייה TCO בדגימות מזון.בין השיטות השונות המשמשות בבדיקות אימונו-סלולריות, בדיקת אימונו-סלולרית אנזימטית היא אחת הפופולריות ביותר. במתודה זו, הנוגדן או האנטיגן מסומנים באנזים. לאחרונה, השימוש בשיטות אלקטרוכימיות לזיהוי הפעילות האנזימטית הוכיח יתרונות מיוחדים עבור יישומים מסוימים.אלקטרוכימיה, למעשה, פחות רגישה להפרעות, מתאימה למזעור ולביצוע מדידות המוניות בעלות נמוכה. בהקשר זה, השימוש באלקטרודות מודפסות (screen-printed electrodes) הוא בעל חשיבות רבה להבטחת עלות נמוכה ופשטות של הפרוצדורה. יתרה מכך, ניתן לשלב תשתית מגנטית עם אלקטרודות מודפסות כדי להשיג את הרגישות המקסימלית של השיטה.היום נדגים כיצד להכין חיישן אלקטרוכימי המבוסס על שימוש באלקטרודות מודפסי מסך וחלקיקים מגנטיים לצורך זיהוי מיקוטוקסינים מסוג TCOs בדגימות מזון. מיקוטוקסינים מסוג Trics נמצאים בדרך כלל בדגנים, ומסיבה זו הם מהווים איום חמור לבטיחות של מזון ומספוא המבוססים על דגנים. הטרטנולים החשובים ביותר בקבוצה A הם רעלני T two ו-HT two.כפי שנראה, ניתן לבצע שיטה זו בקלות על ידי כוח אדם שאינו מיומן, והיא תדרוש מכשור זול ונייד. זוהי אחת המטרות העי

elime-enzyme-linked-immuno-magnetic-electrochemical-method-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מערכת מגנטית אפנון biosensing מנוצל במהירות, ברגישות פשוט לזהות מבחני ביולוגיים, כגון מולקולות דנ"א וחלבונים.

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

זיהוי מטרות מיקרוביאלי של חסינות אדפטיבית במחלות אידיופטית ניתן להשיג על ידי שימוש assay האנזים צמוד immunospot.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

שימוש בטכנולוגית microsphere Xmap של Luminex החברה, פתחתי immunoassay Fluorometric Multiplexed (MFIA) לserosurveillance של מיני בעלי חיים שונים במעבדה. MFIA הוא microarray השעיה בי אנטיגן, בקרת רקמה או נוגדנים קשורות קוולנטית לקלקר microspheres צבעים. שיטת בדיקת MFIA כמו גם נושאים שונים לפתרון בעיות מטופלות.

מתודולוגיה multiplexed Fluorometric immunoassay בדיקה ופתרון בעיות

פרוטוקול הכולל ריכוז משולב, העשרה וזיהוי קולורימטרי של נקודת קצה של פתוגנים הנישאים במזון בכמויות גדולות של מים חקלאיים מוצג כאן.  המים מסוננים באמצעות Modified Moore Swabs (MMS), מועשרים במדיה סלקטיבית או לא סלקטיבית, והזיהוי מתבצע באמצעות התקנים אנליטיים מבוססי נייר (μPAD) המשובצים במצעים קולורימטריים אינדיקטיביים חיידקיים.

מבוסס נייר Colorimetric איתור של<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt;,<em&gt; סלמונלה</em&gt; Spp., ו<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; מכמויות גדולות של מים לחקלאות

פרוטוקול זה מתאר את התפתחותם של שני נוגדנים חד-שבטיים מסוג IgG (mAbs) המגיבים חזק למיוגלובין של יונקים ימיים. mAbs אלה מיושמים על רצועת בדיקה אימונוכרומטוגרפית זהב קולואידית המבוססת על פורמט הסנדוויץ' כדי להבדיל בין ה-Mb של יונקים ימיים לבין כלבי ים ובעלי חיים אחרים.

פיתוח של קולואיד זהב מבוסס Immunochromatographic מבחן ברצועה עבור איתור של מיוגלובין cetacean

נוכחותם של רעלנים ציאנובקטריאליים במאגרי מים מתוקים למאכל אדם היא דאגה גדולה עבור רשויות ניהול המים. כדי להעריך את הסיכון לזיהום מים, מאמר זה מתאר פרוטוקול לגילוי בשטח של זנים ציאנובקטריאליים בדגימות נוזליות ומוצקות באמצעות שבב מיקרו-מערך נוגדנים.

פרוטוקול הניסוי לזיהוי כחוליות בדגימות נוזלים ומוצקים עם צ'יפ Microarray נוגדן

אלקטרונואידים מבוססי מיקרופלואידיג דיגיטלי היא טכניקה העושה שינוי מונחה מתח בזווית המגע לכאורה של droplet מיקרוליטר-נפח כדי להקל על המניפולציה שלה. שילוב זה עם חרוזים מגנטיים פונקציונליזציה מאפשר שילוב של מספר מבצעים ביחידת מעבדה עבור הכנה לדוגמה וזיהוי של פתוגנים באמצעות חיסוני מקושר אנזים (אליסה).

האלקטרו-מערכות מבוססות-פלטפורמת מיקרופלואידיקה דיגיטלית עבור מערכת חיסונית אוטומטית מקושרת אנזימים

שיטת החיסוני האלקטרוכימי (ECLIA) היא גישה מקורית לזיהוי כמותי של משתני חלבון MeCP2, המייצרת מדידות כמותית, מדויקת ומדוייקת ובעלת שגיאה בתוך ובין-שיטה נמוכה בטווח עבודה רחב. כאן, הפרוטוקול עבור MeCP2-ECLIA בפורמט 96-ושוב מתואר.

בסיס אלקטרוכימי מבוסס-מיניאונציה עבור גרסאות חלבון MeCP2

בזיהום Mycoplasma pneumoniae, בדיקות סרולוגיות יכולות להניב תוצאות טובות, אך עם ספציפיות נמוכה בגלל תגובה צולבת אימונולוגית. ה- ELISA ללכידת אנטיגן פנימית, המתוארת במאמר זה, מבטיחה ספציפיות גבוהה של מינים והוכחה כבדיקת סינון אמינה לאבחון מדויק של M. pneumoniae.

בדיקת חיסון הקשורה לאנזים לכידת אנטיגן לזיהוי ספציפי של דלקת ריאות מיקופלסמה

פרוטוקול זה מציג שיטת ספקטרומטריית מסה מאומתת של כרומטוגרפיה נוזלית - ניידות יון ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע את נוכחותם של אלקלואידים ארגוט במזון בהתאם לתקנה של הנציבות (EU) 2023/915 שפורסמה לאחרונה.

זיהוי אלקלואידים ארגוטיים מוסדרים במטריצות מזון על ידי ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים בכרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה בזמן טיסה

חקור שיטת ELIME לאיתור מיקוטוקסינים בדגימות מזון באמצעות חישוף אלקטרוכימי ונוגדנים מגנטיים. השיטה מציעה רגישות גבוהה לזיהוי רעלנים פטרייתיים מסוכנים.

ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

גלה סרטונים נוספים