Split-יוביקוויטין ממברנה שמרים בהתבסס שני היברידי (מיתוס) מערכת: כלי רב עוצמה עבור זיהוי חלבונים אינטראקציות

מערכת המית' (myth) מבוססת על קונספט של יוביקוויטין מפוצל, המתייחס ליכולתו של היוביקוויטין להיות מופרד באופן יציב לחצאים של קצה N (NUBI) וקצה C (CUB), המסוגלים להתרכות מחדש למולקולת פסאודו-יוביקוויטין מלאה. בעוד שהתרכות זו היא ספונטנית בעת שימוש ב-NUBI מסוג פראי, ה wprowadה של מוטציה של I53 לגליצין, המייצרת פ фрагמנט הנקרא NUBG, מפחיתה מאוד את זיקתה ל-CUB, ובכך חוסמת את היווצרות הפסאודו-יוביקוויטין. אם NUBG ו-CUB מאוחדים לחלבון A ולחלבון B בהתאמה, ואם A ו-B מסוגלים לתקשב, אזי מולקולת הפסאודו-יוביקוויטין יכולה להיווצר שוב.

בשיטת ה-myth, פיתיונות קרום אינטגרליים מחוברים למקטע ה-CUB המקושר לגורם שעתוק מלאכותי. בעוד שהטרפים מחוברים למקטע ה-NUBG, אינטראקציה בין הפיתיון לטרף מובילה לשחזור של הפסאודו-יוביקוויטין, אשר בתורו יכול להיות מזוהה על ידי אנזימי דה-יוביקוויטינציה ציטוסוליים הממשיים כמספריים. אנזימים אלו מבצעים שסוע לאחר הקצה ה-C של ה-CUB, ובכך משחררים את גורם השעתוק, שיכול לאחר מכן להיכנס לגרעין ולהפעיל מערכת דשיינר (reporter system), המאפשרת בידוד וזיהוי סלקטיביים של תאים שבהם התרחשו אינטראקציות בין פיתיון לטרף.

שלום, אני ג'ייני סניידר (Janie Snyder) ממעבדת איגור סטאארס (Igor STAARs Lab) במחלקות לגנטיקה מולקולרית וביוכימיה באוניברסיטת טורונטו. היום אראה לכם פרוצדורה למערכת שתי-היברידית של קרומים, או M2H; אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור אינטראקציות של חלבונים קרומיים אינטגרליים. אז בואו נתחיל.

לפני ביצוע ניתוח myth, ודאו שחלבון הפיתיון שלכם נמצא בטרמינוס N ו/או C בציטוזול של התא. תג ה-CUB Lex A VP 16 חייב להיות מחובר לחלבון שלכם בטרמינוס זה. מכיוון שהאנזימים מסלקי העוביקוויטין (de-ubiquitinated enzymes) הדרושים לשחרור גורם השעתוק ממוקמים בציטוזול, במידה והטופולוגיה של חלבון הפיתיון אינה ידועה, ניתן ליצור קונסטרוקטים מתויגים הן בטרמינוס N והן בטרמינוס C, ולהשתמש במבחן הבקרה N-U-B-G-I שיתואר בקרוב, כדי לבדוק אם אחד מהם מתאים לשימוש ב-myth, ובכך להצביע על כך שטרמינוס מסוים הוא ציטוזולי.

כעת, החליטו איזו מהשתי וריאנטים המרכזיות של שיטת ה-myth מתאימה לניסוי שלכם. עבור חלבוני שמרים טבעיים, השיטה המועדפת היא integrated myth או immy. בשיטת Imy, חלבוני המטרה מסומנים אנדוגנית באמצעות תג CUB Lex a VP 16, כך שהם נשארים תחת השליטה של הפרומוטר הטבעי שלהם.

יתרון זה נובע מכך שרמת הביטוי של הטיפוס הפראי של Bates מסייעת בביטול בעיות הקשורות לביטוי יתר של חלבונים, כגון מספר מוגבר של תוצאות חיוביות שגויות עבור חלבונים של שמרים שאינם מקוריים; ניתן להשתמש ב-traditional myth או ב-T myth שבהם תגי bait של CU B Lex A V VP 16 מבוטאים ביתר על פני פלסמיד. בפרוטוקול זה נתמקד ב-T myth כיוון שצורה זו של myth היא רב-גמישה יותר ליישום. למעט בניית ה-bait הראשונית והמדיה שבשימוש, שתי הצורות של myth מבוצעות באופן זהה במהותו. יש לשבט את ה-bait לתוך וקטור מתאים לצורך תיוג וביטוי.

מגוון של וקטורי T myth זמינים כעת, כגון BV four, p, a, BV four, ו-PCM BV four, המאפשרים בנייה של תגים בטרמינל C, Beit Cub Lexie, VP 16 תחת בקרה של פרומוטר TF one חזק מאוד, ADH one חזק ו-CYC one חלש, בהתאמה. לאחר בחירת האפקטור של הצוות, בצע עיכול רסטריקציה לפלסמיד באתר הרסטריקציה המתאים. השסועה צריכה להתרחש רק בסביבה המיידית של תג CU B Lxe VP 16, במעלה הזרם של התג עבור תיוג בטרמינל C או במורד הזרם עבור תיוג בטרמינל N.

לדוגמה, בעת שימוש בווקטור PAM BV, הבחירה ב-SFI one היא אידיאלית; לאחר עיכול הפלסמיד ואחסונו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש, השלב הבא הוא תכנון פריימרים להגברה ושכפול של הגן המבוקש. הקצה 5' של הפריימר הקדמי חייב להתאימה לכ-35 עד 40 נוקלאוטידים במעלה הזרם מאתר ההגבלה. בעוד שהקצה 3' חייב להתאים ל-18 עד 20 הנוקלאוטידים הראשונים של הגן המטרה, שהוא DRB two המקודד ל-beta two generic receptor.

בדוגמה שלנו, הקצה ה-five prime של הפריימר ההפוך חייב להתאים למשלים ההפוך של כ-35 עד 40 נוקלאוטידים במורד אתר ההגבלה. כאשר הקצה ה-three prime תואם למשלים ההפוך של 18 עד 20 הנוקלאוטידים האחרונים של הגן מטרה, תוך השמטת קודון העצירה אם תג CUB Lex say VP 16 ממוקם בקצה ה-C terminus כפי שנעשה בדוגמה המוצגת; בהתאם לשאלה האם תיוג מתבצע בקצה ה-N או ה-C, ודאו כי 35 עד 40 הנוקלאוטידים שנבחרו מרצף הפלסמיד המשמשים בפריימר הקדמי או ההפוך גורמים לכך שהגן מטרה ישתבץ ב-frame תואם עם תג CUB Lex, a VP 16. זאת מכיוון שבדוגמה שלנו, הקצה ה-C terminus של חלבון A DRB two יתויג.

35 הבסיסים של רצף A MBV בפריימר ההפוך נבחרו כך שרצפי הגנים A DRB two ו-CUB ימוקמו באותו מסגר קריאה; הגבירו את הגן המבוקש באמצעות PCR באמצעות הפריימרים שנבחרו. פרמטרי ה-PCR יהיו תלויים באנזים הספציפי ובפריימרים שנעשה בהם שימוש כדי לספק סביבה שבה יכול להתרחש רקומבינציה הומולוגית של תיקון פער (gap repair). הפלסמיד שעבר עיכול קודם והגן המובחר שהוגבר מותמרים למאבקי שמרים מתאים באמצעות פרוטוקול התמרה סטנדרטי לשמרים, כגון זה שמתואר על ידי geets ו-woods.

לאחר שהשמרים שעברו טרנספורמציה גדלו על המצע, בחר קולוניה בודדת של הזן והחדר אותה לתוך חמישה מיליליטר של SD ללא ליוצין. גדל את המצע הנוזלי ב-30 °C למשך לילה. לאחר שהתרבית גדלה למשך לילה והגיעה לרוויה, סבב את התאים בצנטריפוגה ב-700 g למשך חמש דקות והסר את העל-נוזל. בודד DNA פלסמידי של הפיתיון (bait) ממשקע התאים באמצעות כל ערכה מסחרית ל-mini prep.

פעלו לפי הפרוטוקול הסטנדרטי עם שינוי אחד כדי להבטיח ליזיס מספק של תאי השמרים: הוסיפו נפח קטן של 0.5 millimolar של חרוזי זכוכית מסוג soda lime למשקע לאחר השביעה הראשונית, וערבבו ב-vortex בעוצמה למשך חמש דקות. לאחר מכן, המשיכו עם הפרוטוקול המסחרי כרגיל. העבירו את DNA השמרים המבודד למא resumes של e coli בעל כשירות כימית המתאים להפצת פלסמידים, עם יעילות טרנספורמציה של לפחות 1 × 10⁷ תאים ל-µg DNA.

לאחר הפקת ה-DNA של הפלסמיד מתוך חיידק ה-e coli שעבר טרנספורמציה, יש לאמת את בנייתו התקינה של פלסמיד הפיתיון על ידי ריצוף לפני השימוש; יש לנתח את זני הפיתיון כדי להבטיח שחלבוני הפיתיון ממוקמים כהלכה בממברנה של השמרים. הלוקאליזציה נקבעת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הכללה של מולקולת YFP ברצף התג של הפיתיון תאפשר ויזואליזציה ישירה של תאים חיים, והיא נמצאת בשימוש נפוץ ב-imy.

לחלופין, ניתן להשתמש בגישה סטנדרטית של אימונופלואורסצנציה באמצעות נוגדן כנגד רכיבי ה-Lex A או ה-VP 16 של התג, לאחר שנקבעה לוקליזציה נאותה של הפיתיון (bait). יש לוודא כי הפיתיון אינו בעל פעילות עצמית, כלומר, שאינו מפעיל את מערכת הדגיון (reporter system) לבדו או בנוכחות טרף (prey) שאינו מקשר; כדי להבטיח שהפיתיון אינו בעל פעילות עצמית, אנו משתמשים במבחן ה-N-U-B-G-I. במבחן זה.

הפיתי מעובד באמצעות טרנספורמציה עם טרף חיובי בעל אינטראקציה וטרף שלילי שאינו בעל אינטראקציה כביקורת, ולאחר מכן מופקטים דילולים שונים של כל טרנספורמנט על מצעים סלקטיביים מתאימים. על הפיתי לגדול על מצע סלקטיבי בנוכחות הביקורת החיובית ולא לגדול בנוכחות הביקורת השלילית כדי להיות מתאים לשימוש ב-yeast two-hybrid. לאחר תיקוף הפיתי, ניתן לבצע טרנספורמציה לזן הדגל של ה-yeast two-hybrid המכיל את הפיתי עם ספריית טרף רלוונטית כדי לסרוק אינטראקציות בין חלבונים.

כדי להתחיל טרנספורמציה של שמרים בקנה מידה גדול זה, החדירו מושבה בודדת של זן ה-myth reporter המכיל את הפיתיון (bait) לתוך 5 mL של מצע SD ללא ליוצין, ודגרו למשך לילה ב-30 °C עם ניעור. דללו את תרבית הלילה לתוך 200 mL של מצע SD ללא ליוצין ודגרו ב-30 °C עם ניעור עד שהיא תגיע ל-OD 600 של 0.6 עד 0.7. כאשר ה-OD 600 המטרה הושג, חלקו את תרבית ה-200 mL בין ארבעה מבחנות צנטריפוגה עם מכסה הברגה של 50 mL ואספו את התאים באמצעות צנטריפוגציה.

לאחר שטיפת המשקעים במים סטריליים מזוקקים פעמיים ובממס lithium acetate trissy DTA, נשעה each pellet ב-600 microliters של ממס lithium acetate trissy DTA לתוך ארבעה מבחנות צנטריפוגה עם פקק הברגה בנפח 15 milliliter. יש להוסיף 2.5 milliliters של תמיסת PEG lithium acetate ל-600 microliters של התאים המשוערים, 100 microliters של תמיסת salmon sperm DNA ו-7 micrograms של prey library DNA. יש לנער את המבחנות במשך דקה אחת כדי להבטיח ערבוב יסודי ולאחר מכן להדגיר במקלחת מים בטמפרטורה של 30 degree Celsius למשך 45 דקות.

ערבבו קצרה בכל 15 דקות לאחר דגירה של 45 דקות. הוסיפו 160 µL של dimethyl sulfoxide או DMSO לכל מבחנה וערבבו מיד על ידי הפיכת המבחנות. דגרו במקלח מים בטמפרטורה של 42 °C למשך 20 דקות.

עם השלמת הלם החום, אספו את התאים באמצעות סנטריפוגציה והשעיו אותם. השעיו כל אחד מהמשקעים בשלושה מיליליטר של 2X-Y-P-A-D. רכזו את כל הדגימות לתוך מבחנה אחת לסנטריפוגה עם מכסה הברגה בנפח של 50 מיליליטר.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 30 °C למשך 90 דקות לצורך התאוששות התאים. צנטריפוגו את התאים ושחזרו את משקע התאים ב-4.9 milliliters של 0.9% sodium chloride סטרילי תוך שימוש ב-100 microliters של תאים משוחזרים. הכינו דילול סדרתי של פי עשרה ב-0.9% sodium chloride סטרילי בטווח שבין 10x ל-10,000x; פזרו 100 microliters של דילולים 100x ו-1000x על מצע ברירה ודגרו בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עד שלושה ימים.

צלחות אלו משמשות כביקורת וניצלות לחישוב יעילות הטרנספורמציה באופן שווה. חלק את 4.8 המיליליטרים הנותרים של התאים התלוים (resuspended cells) ופזר אותם על צלחות גדולות של 150 מילימטר, והדגר בטמפרטורה של 30 °C למשך שלושה עד ארבעה ימים. לאחר צמיחת המושבות, תלה מחדש מושבות בודדות, שכל אחת מהן מייצגת תאים המכילים זוג bait prey פוטנציאלי בעל אינטראקציה, ב-100 µL של 0.9% sodium chloride, ופזר מנות של 5 µL למצע סלקטיבי המכיל XG; אפשר להם לגדול למשך יומיים עד ארבעה ימים בלבד.

מושבות המראות צמיחה חסונה וצבע כחול נבחרות להמשך הניתוח. לאחר בידוד וריצוף הפלסמידים מהמושבות החיוביות של השמרים, רכזו ונתחו את כל נתוני הריצוף כדי להרכיב את הרשימה הראשונית של האינטראקטורים. כדי לבדוק מחדש אינטראקציות אלו, נעשה שימוש במבחן תלות בפיתיון (bait dependency test).

בבדיקה זו, כל פלסמידי הטרף המבטאים את האינטראקטורים שזוהו מוחדרים מחדש (transformed) אל זן הפיתיון המקורי וכן אל הזן הנושא פיתיון מלאכותי בקרה, המורכב מדומיין טרנס-ממברנלי בודד המחובר ל-CUB Lex ותג VP 16. יש לתלה מושבות בודדות מהטרנספורמציות הללו ב-100 µL של מים מזוקקים פעמיים סטריליים, ולהטפטף נפחים של 5 µL על מצע ברירה מתאים בתוספת X sc. באופן אידיאלי, יש לבחור מספר טרנספורמנטים עבור כל טרף, ויש להטפטף הן את הפיתיון המקורי והן את הפיתיון המלאכותי על אותה צלחת. יש להדגיר את הצלחות למשך יומיים עד ארבעה ימים ב-30 °C. שמרים הנושאים את הפיתיון המלאכותי עם טרף הגורם להפעלה של מערכת הדגיה (reporter system) נחשבים לפרומיסקואיים (promiscuous), וטרף ספציפי זה יוסר מרשימת האינטראקטורים.

חפשו צמיחה וצבע כחול בשמרים עם הפיתיון המדובר, אך לא עם הפיתיון המלאכותי. הדבר מאשר אינטראקציה ספציפית. עם זאת, אם השמרים הנושאים את הטרף ואת הפיתיון המדובר אינם גדלים.

טרף זה מוסר מרשימת האינטראקטורים. שאר הטרפים מהווים את הרשימה המלאה של האינטראקטורים שזוהו בסריקת ה-myth. עם השלמת הליך ה-myth, תתקבל מפת אינטראקטורים ביתית.

זהו אוסף של אינטראקציות פוטנציאליות שהחוקר חייב לנתח באופן מעמיק יותר באמצעות מחקרים ספציפיים שייקבעו על בסיס כל מקרה לגופו. כדי להעריך את המשמעות הביולוגית של כל אחת מהן, הצגנו כעת כיצד לבצע את פרוצדורת ה-membrane E two hybrid או ה-myth כדי לזהות שותפים לאינטראקציה של חלבון מטרה. בעת ביצוע פרוצדורת ה-myth, חשוב לוודא כי ה-be שלכם נמצא עם הקצה ה-N וה/או ה-C שלו בציטוזול של התא, ולתכנן את אסטרטגיית התיוג בהתאם.

בנוסף, חשוב להעריך בקפידה שזני הפיתיון שלכם מבטאים את הפיתיון כראוי ושהפיתיון ממוקם בצורה נכונה. כמו כן, חשוב לבצע את בדיקת הבקרת NUB GI, שכן היא מועילה לסיוע בקביעת תנאי הסינון. לבסוף, הקפידו לאמת באופן עצמאי את כל האינטראקציות שאתם מגלים באמצעות שיטת myth.

ביצוע שלבים פשוטים אלו אמור להבטיח שתקבלו את התוצאות הטובות ביותר מהפרוצדורה. ובכן, זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.