Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

ניתוח של שרשראות סוכר שאינן מקושרות בחלבונים גליקוזיליםים מתחיל בסימון של הגליקנים והתאים באמצעות מנוזה טריטיומית. כלי ה-pulse מקורר על קרח, בעוד כלי ה-chase מדגדר ללא סימון למשך תקופת chase רצויה. לאחר מכן, הדגימות עוברות ליזיס וחלבון גליקוזילי של עניין מופק בטהרה אימונולוגית, עובר דנטורציה והגליקנים שלו משוחררים באופן אנזימטי.

האוליגוסכרידים מטוהרים עוד יותר באמצעות סינון מולקולרי, המפריד אותם מהחלבונים וממזהמים אחרים הגדולים מ-30 kilodaltons. לאחר מכן, הגליקנים מופרדים באמצעות HPLC. הכמות של כל צורת גליקן נקבעת על ידי מדידת עוצמת האות הרדיואקטיבי בכל פרקציה ששוללה.

שלום, אני אדוארד אזו מהמעבדה של היי ג'רלדו לטר קרמר במחלקה למחקר תא ואימונולוגיה באוניברסיטת תל אביב. אני גם ממעבדת ג'רלדו לטר קרמר. והיום נראה לכם הליך לבידוד וניתוח של אוליגוסכרידים המסומנים ומקושרים מטבולית.

אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את הדינמיקה של עיבוד שרשראות סוכר הן עבור מאגרי הגליקופרוטאינים התאיים הכוללים והן עבור גליקופרוטאינים בודדים. אוקיי, אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, השתמשו בתאי NIH three T three שגודלו למשך לילה בצלחת אחת של 90 מילימטר.

עבור כל דגימה, התרבית היא בתבניות סוב-קונפלואנטית (sub confluent) כדי להרעיב את התאים לגלוקוז; הכין מצע טרי בריכוז פי 2 ללא גלוקוז, המוגבה ב-20% FCS דיאלייז והוסף שמונה מילימול Sodium pyruvate; דלל נפח אחד מהכמות הרצויה של המצע בריכוז פי 2 עם נפח אחד של מים דה-יוניים. חמם מראש את המצע, ולאחר מכן דגור כל דגימת תאים בחמישה מיליליטר של המצע הטרי שחומם מראש למשך חמש עד 15 דקות. אם נדרש שלב מרדף (chase) ארוך מ-12 שעות, יש לטפל בתאים בתנאים סטריליים.

בסיום תקופת הדגירה, סמנו את הצלחות המתאימות לדגימות ה-pulse וה-chase. כדי לסמן את ה-n glycans עבור אנליזה של גליקופרוטאינים באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation), החליפו את מצע ההרעבה במיליליטר אחד של מצע ללא גלוקוז שחומם מראש, המועשר ב-400 micro curies per milliliter של manos מסומן בטריטיום כפול. השתמשו ב-65 micro curies per milliliter עבור סימון ואנליזה של גליקופרוטאינים סהום.

לאחר החלפת מצע ההרעבה, דגרו את התאים בתנאי תרבית רקמה רגילים למשך שעה אחת. בסיום הדגירה של שעה אחת, הסירו את מצע הסימון מכל הדגימות. הוסיפו בזהירות 2 mL של PBS בטמפרטורה של 4°C לדגימות המיועדות לפולס (pulse) והניחו אותן על קרח. דגימות אלו מכונות פולסים.

השתמשו ב-2 mL של מצע תרבית מלא רגיל שחומם מראש. שטפו את דגימות המרדף (chase samples) שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסיפו לתאים 5 mL מהמצע הרגיל שחומם מראש.

הניחו את דגימות המרדף (chase) באינקובטור פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 °C למשך פרקי הזמן הרצויים. במהלך הדגרת דגימות המרדף, שטפו שלוש פעמים את דגימות הדחף (pulse), שהושארו על קרח, עם 2 mL של PBS קר מאוד. לאחר מכן, השתמשו בגרד תאים (cell scraper) כדי לגרד את התאים מהצלחת.

העבירו את התאים ששוחררו לתוך מבחנה מסוג EOR בנפח שני מיליליטר המכילה 2 mL של PBS. סובבו את התאים ב-16,000 g למשך שש עד 10 שניות כדי להשקיע את העליון, והקפיאו את משקע התאים בטמפרטורה של 80°C-. עם סיום האינקובציה של דגימות המרדף (chase samples), שטפו אותן.

סבבו ואחסנו כפי שהודגם עבור דגימות הדופק. עם המוכנות להמשיכה לשלב ליזיס התאים, הוציאו את התאים מהמקפיא. עבור ניתוח ה-IP, בצעו ליזיס לתאים על ידי הוספת 300 µL של בופר.

ערבבו קצרה במערבל (vortex) והדגרימו למשך 20 דקות על קרח. לצורך ניתוח דגימות של גליקופרוטאינים כלליים, השתמשו ב-300 microliters של buffer B. הדגימו את התאים למשך 20 דקות על קרח, ולאחר מכן בצעו סוניקציה ארבע פעמים, למשך 10 שניות בכל פעם בעוצמה מרבית. לאחר מכן, הרתיחו את הדגימות למשך חמש דקות.

לבסוף, סנטריפוגו את כל הליזאטים במהירות של 16,000 Gs למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט למבחורת EOR חדשה והשליכו את המשקע. המשיכו ל-IP לבדיקת חלבון מטרה עבור immunoprecipitation של הגליקופרוטאין H two A שהודגם כאן.

הוסיפו לתוספת של התאים המלוHים 20 µL לכל דגימה של חלבון A agro speeds ושלושה µL לכל דגימה של הנוגדן polyclone rabbit anti H2A של המעבדה. דגרו את הדגימות במשך 4 עד 16 שעות בטמפרטורה של 4 °C, תוך ערבוב רציף באמצעות סיבוב איטי. בתום הדגירה, סבבו את החרוזים למטה והסירו בזהירות את התתוספת באמצעות ואקום, ושטפו את החרוזים ארבע פעמים על ידי הוספה של 500 µL של בופר T.

סובב את החרוזים בצנטריפוגה להורדתם והסר את הנוזל העליון (supernatant) כדי לשחרר את החלבונים הקשורים מהחרוזים. הוסף 10 µL של תמיסת דנטורציה (denaturing buffer) מהערכה של endo H למשקע החרוזים והרתח את הדגימות למשך חמש דקות. סובב את החרוזים בצנטריפוגה והעבר את הנוזל העליון למבחנת EOR חדשה.

חלבוני ה-ellu מוכנים כעת להסרת גליקוזילציה (deglycosylation). הגליקנים משוחררים הן מדגימות ה-IP והן מדגימות החלבון הכולל באמצעות האנזים ו-OH. עבור דגימות ה-IP, הוסיפו 0.5 µL של אנזים endo H לכל דגימה, יחד עם 10 µL של תמיסת ריאקציה endo H בריכוז פי 2. הדגירו את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות.

עבור גליקופרוטאינים סהורים, העבירו את העלייה של ליזאטי התאים למסנן MicroCon עם סף סינון של 30 kilodalton. שטפו את תמצית החלבון הכוללת שלוש פעמים עם 100 µL של באפר E באמצעות צנטריפוגציה חוזרת ב-14,000 Gs למשך שלוש דקות. הוסיפו ל-MicroCon, במקום שבו נותרו החלבונים השטופים, שלוש µL של 10 x endo H reaction buffer ו-1.5 µL של האנזים endo H, והדגרירו למשך שלוש שעות ב-37 °C יחד עם דגימות ה-IP.

בסיום שלוש שעות האינקובציה, יש לדלל את דגימת ה-IP פי חמישה במים דה-יוניים, להניח אותה על מסנן MicroCon חדש ולסובב בצנטריפוגה ב-14,000 Gs למשך שלוש דקות. לאחר מכן, יש לשטוף הן את דגימת ה-IP והן את דגימות החלבון הכולל על ידי הוספת 50 microliters של מים דה-יוניים וסבוב של הדגימות בצנטריפוגה. יש לחזור על הפעולה פעמיים נוספות. במידת הצורך, יש לשמור את התסנין המכיל את הגליקנים המנוקים, בתוך מבחנות המכילות endo H. את הגליקופרוטאינים העמידים ל-endo H מדגירים לאחר מכן עם 200 milli units של N glycosate F ב-15 microliters של באפר C בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 16 שעות.

ביצוע אלוציה באמצעות מים דה-יוניים כפי שהודגם. ייבשו את הדגימות לחלוטין באמצעות מרכז תמיסות מהיר (speedvac) עם חימום עד 45 °C כדי להאיץ את התהליך. השעיו שוב את המשקעים היבשים ב-12 µL של ממס HPLC והעמיסו את הדגימות על עמודת sphe או עמודת amino המותקנת במכשיר ה-HPLC.

הריצו את הדגימות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. אספו 48 פרקציות עבור כל הרצת דגימה. השתמשו במונה סינצילציה כדי למדוד את ערכי ה-CPM של הפרקציות שנאספו, ושרטטו את קריאת ה-CPM כפונקציה של מספר הפרקציה.

חשבו את אחוז שאריות ה-manos של כל מיני הגליקנים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. להלן תוצאות מייצגות של ניתוח שרשראות סוכר של גליקופרוטאינים כוללים מדגימה שעברה סימון פולס של שעה אחת. קריאת ה-CPM של פרקציוני ה-HPLC מוצגת כפונקציה של מספר הפרקציה בפרופיל המתקבל.

כל שיא מייצג סוג גליקן ספציפי שזוהה באמצעות הרצת HPLC של סטנדרטים ידועים של גליקנים. עבור כל סוג גליקן, אחוז המולרי שלו מכלל הגליקנים מוצג כפונקציה של זמן המרדף (chase). ניתוח זה מוצג כאן עבור גליקופרוטאין מקומט ספציפי שבודד באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) מדגימה שטופלה במעכב הפרוטאוזום MG 1 32.

סוג הגליקן המקוצר M five six מצטבר במהלך תקופת המרדף (chase period), מה שמוביל למסקנה כי אוליגוסכרידים הנמצאים על חלבון מקופל באופן שגוי עוברים קיצור נרחב של מן (man trimming) לפני הפירוק. זאת בניגוד לאוליגוסכרידים על גליקופרוטאינים כלליים מדגימות שטופלו באופן דומה; כאן, M nine eight נותר סוג הגליקן העיקרי במהלך המרדף, עם עלייה קלה בלבד בכמות ה-M five six. עובדה זו מובילה למסקנה שרק חלק קטן ממאגר הגליקופרוטאינים הכללי מכוון לפירוק חלבונים הקשור לרשתית התוך-פלזמית (ER associated protein degradation).

רדיואקטיביות מקוצרת. כפי שהוסבר בהרחבה בפרוטוקול הכתוב המצורף, הדגמנו כעת כיצד להשתמש בשילוב של סימון בתאים חיים ואנליזת HPLC כדי לעקוב אחר הדינמיקה של הרכב האוליגוסכרידים שאינם מקושרים במהלך חיי הגליקופרוטאין. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להימנע מזיהום של דגימות המרדף (chase) בעקבות של חומרים רדיואקטיביים, דבר שיוביל לסימון לא רצוי של הגליקנים במהלך תקופות המרדף בזמן הפרדה לפי גודל.

חשוב גם לכוון את ה-HPLC ללחץ קבוע כדי להבטיח עקביות בפרקציונציה של הגליקנים. זהו כל התהליך. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.