Name: Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-27T17:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: למדו לנתח שינויים בשרשראות סוכר N-linked בגליקופרוטאינים בתאי יונקים באמצעות שיטת pulse-chase ו-HPLC. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת עיבוד הסוכרים ותפקודם התאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים זהבית פרנקל סנדרה Tolchinsky לקבלת סיוע טכני. מחקר הקשורים לעבודה זו נתמכת על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע (1229-1207) ואת גרמניה פרויקט שיתוף פעולה ישראלי (DIP-DFG).

הפרוטוקול הבא מיועד לניתוח של שרשראות סוכר של גליקופרוטאינים או סך של גליקופרוטאין ספציפי של עניין. הליך זה בעצם אותו דבר עבור שניהם מקרים עם שינויים מעטים כאמור בכל פרוטוקול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תיוג המטבולית של N-linked glycans אחד צריך להשתמש תרבות subconfluent של בתאי יונקים בוגרים לילה בצלחת 90 ​​מ"מ עבור כל דגימה (דגימות עשוי לייצג נקודות זמן שונות או טיפולים). פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור תאים NIH 3T3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרעיב את התאים גלוקוז על ידי הדגירה ב 5 מ"ל של מדיום מראש התחמם (37 ° C) גלוקוז ללא המוכן טרי, מסופק עם 10% dialyzed FCS ו 4 נתרן mM pyruvate במשך 5-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום רעב עם 1 מ"ל של טרום התחמם (37 ° C) גלוקוז ללא בינוני המכיל 400 μCi של [2-3 H] שכותרתו מנוז (ריכוז נמוך יותר של 65 μCi / ml משמש עבור תיוג של גליקופרוטאינים סה"כ), ו דגירה התאים בתרבית בתנאים נורמליים ברקמות במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום תיוג מכל מדגם, ובזהירות מוסיפים 2 מ"ל PBS ב 4 ° C עד דגימות המתאים הדופק ומניחים אותם על הקרח (דגימות אלה מכונים פולסים), בעוד דוגמאות המתאים המרדף צריך להיות שטופים 3 פעמים עם 2 מ"ל של טרום התחמם (37 ° C) תרבות נורמליים בינוני מלא, ולאחר מכן להציב CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5 מ"ל של מדיום מראש חימם קבוע לתקופות לרדוף הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את דגימות הדופק (ממוקם בעבר על הקרח) 3 פעמים עם 2 מ"ל של קר כקרח PBS. התאים מגורד אז את המנה ב 2 מ"ל PBS באמצעות מגרד תא, מכניסים צינור 2 Eppendorf מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצר ספין התאים ב 16000Xg (6-10 שניות), לבטל את supernatant ולהקפיא התא גלולה ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שלבים 5 ו 6 גם דגימות לרדוף בסוף הזמן לרדוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים מהמקפיא lyse אותם על ידי תוספת של 300 μl של חיץ, vortexing בקצרה דוגרים במשך 20 דקות על הקרח, או במקרה של ניתוח גליקופרוטאינים הכולל, על ידי הדגירה 20 דקות על הקרח עם חיץ B, ואחריו sonication (4 פעמים, 10 שניות, מקסימום אמפליטודה), ואז להרתיח את דגימות 5min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysates ב 16000Xg במשך 20 דקות ב 4 ° C. מעבירים את supernatant לצינור חדש Eppendorf וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ניתוח גליקופרוטאינים הכולל, המשך סינון deglycosylation מולקולרית (שלב 17). עבור immunoprecipitation של גליקופרוטאין H2a הפגינו כאן, להוסיף 20l/sample של חלבון (Repligen) A-agarose חרוזים 01:01 ההשעיה ו 3 μl / מדגם של נוגדן ארנבת polyclonal שלנו H2a אנטי עבור גליקופרוטאין הרצויה (נוגדן שלנו נגד H2a למשל ), כדי supernatant משלב 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות עבור 4-16 שעות 4 ° C, ללא הרף ערבוב על ידי סיבוב איטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים ב 16000Xg למשך 30 שניות, ובזהירות להסיר את האבק באמצעות supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את החרוזים, על ידי הוספת 500 חיץ D μl ו vortexing. ספין כמו בשלב 12 ולהסיר את supernatant. חזור על לשטוף 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ denaturing 10μl (מסופק עם Endo-H חוד בערכה) ועד גלולה חרוז לרתיחה דגימות במשך 5 דקות (כאשר חלבונים סך מנותחים, deglycosylation מבוצע על המסנן Microcon, שלב 17). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים (16000Xg למשך 30 שניות), ולהעביר את supernatant לתוך צינור Eppendorf חדש. ואז 0.5μl של האנזים H אנדו מתווספים מדגם זה יחד עם 10 μl של למאגר תגובה (מסופק גם עם אנדו חוד H קיט), וכן דגימות מודגרת על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפריד את glycans שוחרר מן החלבונים, המדגם הוא מדולל עם מים 5 פעמים deionized והניח על גבי מסנן מולקולרית (Microcon Ultracel YM30), עם 30kDa חתוכים, centrifuged אז 3 דקות ב 14000Xg. החל 50μl מים deionized ו צנטריפוגה חוזרת של הדגימות. כשלון זה חוזר על עצמו פעמים 2 יותר, תוך שמירה על זרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתה מנתח גליקופרוטאינים הכולל, להחיל את supernatant של lysates (משלב 9) כדי לסנן את Microcon. שטפו את תמצית עם 100 μl של חיץ E, 3 פעמים על ידי צנטריפוגה חזר על 14000Xg דקות 3. הוסף 3 μl של חיץ 10X התגובה H אנדו 1.5 μl של האנזים אנדו H ל retentate Microcon ו דגירה במשך 3 שעות ב 37 ° C. Glycans שפורסמו הם eluted עם מים deionized על ידי 3 centrifugations חוזרות ונשנות, כמו בשלב 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, retentates מן השלבים 16 ו 17, המכיל אנדו H עמידים גליקופרוטאינים מודגרת אז μl 15 של חיץ C עם 200mU של N-F glycosidase, על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 ח Elution עם מים deionized מתבצעת כמו בשלב 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל את התגובה H אנדו flow-through (שלבים 16 ו -17) ב concentrator SpeedVac, ויבש דגימות לחלוטין (זה יכול להיעשות עד 45 ° C כדי להאיץ את התהליך הזה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את דגימות עבור HPLC, resuspend את כדורי יבש 12 μl של הממס HPLC (אצטוניטריל: מים, 60:40, חומצה זרחתית 1%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמת מכשיר HPLC (מחובר בטור Spherisorb) אל זרם בלתי פוסק של הממס (1 mL / min) והלחץ (ערך מסוים בין 1000 ו - 2000 psi), ואת המקום אספן חלק לשנות צינור בכל דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות לתוך המכשיר HPLC ולהתחיל את אספן חלק בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף השברים של 48 מ"ל 1 מ לרוץ כל המדגם מהריצה של תערובת oligosaccharide סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 500 μl של שבריר לכל בקבוקון הנצנץ, ומערבבים את תכולת עם 3 מ"ל של נוזל מים בליל הנצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלוחיות לקרוא מונה הנצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Readout לדקה הוא זמם כפונקציה של מספר שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכים לדקה בתוך לשיא מייצגים מינים glycan ספציפיים כדלקמן: שברים 18-21 מתאימות M5, M6 ל 22-26 שברים, שברים 27-31 כדי M7, שברים 32-35 כדי M8, שברים 36-39 כדי M9, שברים 40-42 כדי G1M9 ושברים 43-45 כדי G2M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכום הערכים עותקים לדקה עבור שברים בתוך שיא כל משקפת את הסכום המוחלט של מין glycan ספציפיים. כדי לפצות על העובדה כי מינים המכיל שאריות מנוז יותר לרכוש התווית יותר, "טוחנת כמות יחסית" של כל מין glycan מחושב כדלקמן: הסכום המוחלט של כל מין glycan מחולק במספר שאריות מנוז שהוא מכיל . ערך זה מחולק אז בסכום של הסכומים טוחנת היחסי של כל המינים glycan להשיג כדי להשיג את "אחוזים מסך" לכל מיני glycan ספציפיים. </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="text-align:center;"> צ'ייס (ח) </td><td style="text-align:center;"> 0 </td><td style="text-align:center;"> 4 </td></tr><tr><td> יצא עם אנדו H (CPM) </td><td> 90000 </td><td> 16800 </td></tr><tr><td> יצא עם N-glycosidase (CPM) F ב </td><td> 20400 </td><td> 3900 </td></tr><tr><td> גליקופרוטאינים ב retentate (CPM) ג </td><td> 371700 </td><td> 127695 </td></tr><tr><td> Dolichol-אוליגוסכרידים ב retentate (CPM) ד </td><td> 4350 </td><td> 540 </td></tr><tr><td> Dolichol-אוליגוסכרידים ב retentate (%) דואר </td><td> 1.4 ± 0.7 </td><td> 0.2 ± 0.2 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. ניתוח שחרורו של N-linked שרשראות סוכר עם deglycosidases ואת נוכחותם של dolichol-אוליגוסכרידים בדגימות גליקופרוטאין. אנו להחיל את ההליך הדופק כדי לרדוף lysate מתאי NIH 3T3. לאחר סינון Microcon, שכותרתו N-linked אוליגוסכרידים שוחררו בעיקר אחרי הדופק תיוג (סוג מנוז גבוהה) עם טיפול נוסף עם F N-glycosidase לאחר תקופה מרדף, אשר יתאים לסוג מורכבות (Golgi עיבוד glycans) עם אנדו H, אנדו H אוליגוסכרידים עמידים. זה ניתוח כמותי נקבע כי dolichol-אוליגוסכרידים, היוו חלק משמעותי של התווית retentate הראשונית. הערות: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים NIH 3T3 היו הדופק שתויגו עם [2-3 H] מנוז ורדפו להשלים עם בינוניות. לאחר תמוגה התא סינון דרך Microcon YM30, גבוה מנוז N-linked אוליגוסכרידים שוחררו retentates ידי הדגירה עם אנדו ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנדו H עמידות החומר retentates Microcon מ (א) הודגר אז עם F N-glycosidase ושוחרר אוליגוסכרידים נמדד מונה הנצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Retentates Microcon שהושגו כמו (א) לפני טיפול H אנדו, חולצו 4 פעמים עם כלורופורם: מתנול: מים 10:10:03 להסיר glycolipids מבשר, ואת החומר unextracted solubilized ב NaOH 1N ו נספר מונה הנצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dolichol-אוליגוסכרידים היו מטוהרים מן קטעים (ג) כפי שמתואר 1 ו נספר מונה הנצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע של 3 ניסויים אחוז dolichol-אוליגוסכרידים (ד) עותקים לדקה סך retentate (ג + ד). </li></ol> נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Pulse-מרדף ניתוח הכולל גליקופרוטאינים NIH 3T3 בתאים שלא טופלו ועל עיכוב proteasomal לאחר 1h הדופק עם תיוג. [2-3-H] השגנו פרופיל צפוי עם כמה glucosylatedמבשרי הנותר (Glc 2 Man 9 GlcNAc 2 (G2M9) ו G1M9), אבל רוב התווית נוכח M9 ו M8 מינים, כיוון שזה תוצאה של זמירה של גלוקוז כל אחד שאריות מנוז (איור 1). מבשרי לא קטן מנוז חינם או אחרים התגלו, המעידים על יסודיות של טיהור. בעקבות ארוכה למדי 8h מרדף היה נרחב יותר זמירה כדי M7-6 ו כמות קטנה של M5, אבל המינים העיקריים המשיך להיות M8 M9 ו (איור 1 ב '). אם המרדף בוצע בנוכחות מעכב proteasomal (30 מיקרומטר MG-132), היה רק ​​הצטברות קלה של מינים אלה גזוז אותו (איור 1 ג'). <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ניתוח כמותי של שרשראות סוכר המצע ERAD לעומת סך גליקופרוטאינים. (א) ניסוי דומה לזה בתרשים 1, טוחנת כמויות היחסי של כל המינים oligosaccharide חושבו בהתבסס על תוכן מנוז. אנו המיר את הערכים המתקבלים לדקה לכל מיני glycan, אחוז אחד המינים ביחס לסכום הכולל של הסכומים טוחנת היחסי של כל המינים היה נוכח זממו אז כפונקציה של הזמן לרדוף בממוצע של שני ניסויים. (ב) דומים ל (A) אלא glycans שוחרר מן המצע ERAD ASGPR H2a נותחו לאחר תיוג הדופק ולרדוף עד 4H, בנוכחות או העדר מעכב proteasomal MG-132. (ג) ערכים עבור 4H לרדוף בנוכחות של MG-132 מבית (א) ו - (ב) מושווים עבור ASGPR H2a ובריכת גליקופרוטאין. (ד ') תוכנית של רשת N-linked סוכר זמירה תהליכי המיון. סוכר זמירה תהליכים שיובילו M6-5 קשור חלבונים (R) הממוקדות ERAD לעומת M9-8 על אלה יציאה Golgi ומעבר. תוצאות המחקר מראות כי התהליך ERAD קשורה מנוז זמירה של N-glycans להניב מינים עם 5-6 שאריות מנוז הנותרים.

<ol><li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li>
<li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+%28ER%29+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li>
<li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li>
<li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+%28ER%29+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li>
<li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li>
<li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li>
</ol>

ניתוח הדופק מרדף של glycans בתאים חיים עם הפרדה HPLC מספק שיטה ללמוד את הדינמיקה של שינויים מבניים oligosaccharide לאורך החיים של גליקופרוטאין. יש ראיות הולכות ומצטברות כי שינויים כאלה הם מעורבים בייצור אותות לקיפול ER, בקרת איכות ומערכות 2-5 סחר. השיטה יכול להיות מיושם לא רק עבור גליקופרוטאין ספציפי של עניין, אלא גם לנתח את הדינמיקה של מבנה גליקופרוטאינים הכולל, כפי שנדגים במאמר זה, שבו השווינו את גורל מנוגדים של מצע ERAD ספציפיים כי הבריכה גליקופרוטאין הסלולר . טכניקת...

<table><tbody><tr><td>בקר של מערכת אספקת ריבוי-ממסים 600E</td><td>Waters</td><td>WAT062710</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל LiChrosolv (בדרגת gradient לכרומטוגרפיה נוזלית)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.0003</td><td></td></tr><tr><td>Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K או Centricon ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC503024 או 4208</td><td></td></tr><tr><td>מרכז ריכוז (Concentrator) 5301, כולל רוטור בזווית קבועה ל-48 מבחנות בנפח 1.5 / 2.0 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.016</td><td></td></tr><tr><td>F דיאלייזה&amp;#8211;סרום עגל טאטלי (Fetal Calf Serum)</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>04-011-1A</td><td></td></tr><tr><td>דאלבקו&amp;rsquo;mEagle המוסף (Modified Eagle)&amp;rsquo;מצע גידול</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>דלבקו&amp;rsquo;Modified Eagle&amp;rsquo;מצע - ללא גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו&amp;rsquo;מלח סריפוספט מקוצץ (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt(Titriplex Iii)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1084180250</td><td></td></tr><tr><td>ערכה של Endo Hf (1,000,000 יחידות/מ"ל)</td><td>New England Biolabs</td><td>p0703S</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>סופר-שברים Frac-100</td><td>Amersham</td><td>18-1000-77</td><td></td></tr><tr><td>מערכות ספירה בצילום נצנוץ נוזלי LS 6500</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>510720</td><td></td></tr><tr><td>מנוז, D-[2-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H(N)]- (פעילות סגולית: 15-30Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NET570A</td><td></td></tr><tr><td>N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132)</td><td>Calbiochem</td><td>474790</td><td></td></tr><tr><td>N-glycosidase F (1000 יחידות/מ"ל)</td><td>קבוצת Roche</td><td>11365177</td><td></td></tr><tr><td>N-octylglucoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3757</td><td></td></tr><tr><td>תאי NIH 3T3</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Flour</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6013199</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חומצה זרחית (49-51%, עבור HPLC)</td><td>Fluka</td><td>79607</td><td></td></tr><tr><td>תערובת מעכבי פרוטאז (Protease Inhibitor Cocktail)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי Protein A-Sepharose</td><td>Repligen</td><td>IPA300</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן פוליקלונלי לארנב נגד הקצה הקרבוקסילי של H2 &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סודיום דאוסיכולאט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>סודיום דודציל סולפט</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרים פירובט (100mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>עמודת Spherisorb NH2, 5 &amp;mu;מ', 4.6 x 250 מ"מ</td><td>Waters</td><td>PSS831115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>מעבדי אולטרה-סאונד Vibra-Cell VCX 750</td><td>Sonics and Materials, Inc.</td><td>690-003</td><td></td></tr><tr><td>&lt;חזק&gt;בופר A:&lt;/strong&gt; 1% Triton X-100, 0.5% w/v סודיום דאוקסיכולאט (sodium deoxycholate), תערובת מעכבי פרוטאז (Protease inhibitor cocktail) בריכוז 2% v/v ב-PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;חזק&gt;בופר B:&lt;/strong&gt; 0.5% w/v SDS, תערובת מעכבי פרוטאז 2% v/v ב-PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;חזק&gt;בופר C:&lt;/strong&gt; בופר תגובה ל-N-glycosidase F: Na 200mM&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי NIH 3T3 המבטאים באופן יציב H2a &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;חזק&gt;בופר D:&lt;/strong&gt; 0.5% Triton X-100, 0.25% משקל/נפח נתרק דאוסיכולאט, 0.5% משקל/נפח SDS, תערובת מעכבי פרוטאז 2% נפח/נפח ב-PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;חזק&gt;בופר E:&lt;/strong&gt; 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol&amp;#8211;אתנול, תערובת מעכבי פרוטאז 2% נפח/נפח ב-PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטו&amp;#8211;אתנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

pulse-מרדף ניתוח של n-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

קובץ מצורף של Glc<sub&gt; 3</sub&gt; Man<sub&gt; 9</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; מבשר oligosaccharide כדי פוליפפטידים המתהווה בחדר המיון הוא שינוי משותף חלבונים הפרשה. למרות שינוי זה היה מעורב במספר תהליכים ביולוגיים, היבטים נוספים של תפקודו הם מתעוררים, עם הראיות האחרונות תפקידה בייצור של אותות בקרת איכות גליקופרוטאין וסחר. לכן, תופעות הקשורות N-linked glycans ועיבוד שלהם נחקרים באינטנסיביות. שיטות שפותחו לאחרונה לניתוח proteomic השתפרו מאוד את האפיון של N-linked glycans גליקופרוטאין. עם זאת, הם אינם מספקים תובנה הדינמיקה של עיבוד סוכר שרשרת המעורבים. לשם כך, תיוג הדופק לרדוף פרוטוקולים ניתוח משמשים מורכבים בדרך כלל לתת תשואות נמוכות מאוד. אנו מתארים כאן שיטה פשוטה הבידוד וניתוח מטבולית N-linked אוליגוסכרידים שכותרתו. פרוטוקול מבוסס על תיוג של תאים עם [2 -<sup&gt; 3</sup&gt; H] תמוגה מנוז, denaturing ולשחרר האנזימטית של אוליגוסכרידים מתוך חלבון או באופן ספציפי immunoprecipitated עניין או ממאגר גליקופרוטאין כללי ידי טיפולים רציפים עם אנדו H ו-N-F glycosidase, ואחריו סינון מולקולרי (Amicon). בשיטה זו מבודדים אוליגוסכרידים לשמש כקלט עבור HPLC ניתוח, המאפשר אפליה בין מבנים glycan שונים על פי מספר יחידות monosaccharide המרכיבים אותם, עם רזולוציה של monosaccharide יחיד. באמצעות שיטה זו היינו מסוגלים ללמוד גבוה מנוז N-linked פרופילים oligosaccharide של גליקופרוטאינים תא הכולל מרדף אחרי הדופק בתנאים נורמליים תחת דיכוי הפרוטאזום. פרופילים אלו הושוו לאלו שהתקבלו המצע השפלה immunoprecipitated ER-הקשורים (ERAD). התוצאות שלנו מראים כי רוב גליקופרוטאינים NIH 3T3 הסלולר הם יציבים יחסית, וכי רוב אוליגוסכרידים שלהם נקצצו Man<sub&gt; 9-8</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt;. לעומת זאת, מצעים ERAD יציבים הם גזומים לגבר<sub&gt; 6-5</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; ו גליקופרוטאינים נושאות מינים אלה מצטברים על עיכוב של השפלה proteasomal.

אנו מתארים שיטה לניתוח שינוי של N-linked glycans דרך חיים המוקדם של גליקופרוטאינים לאחר ביוסינתזה שלהם בתאי יונקים. זו מושגת על ידי ניתוח הדופק מרדף של glycans שכותרתו מטבולית, לשחרר האנזימטית של גליקופרוטאינים ובחינה על ידי HPLC.

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

הצמדה של אוליגוסחריד קדם (precursor) מסוג Glc3Man9GlcNAc2 לפוליפפטידים ראשוניים (nascent polypeptides) ברשת האנדופלזמית (ER) היא מודיפיקציה נפוצה עבור חלבונים הפרשתיים. למרות ש...

ניתוח של שרשראות סוכר שאינן מקושרות בחלבונים גליקוזיליםים מתחיל בסימון של הגליקנים והתאים באמצעות מנוזה טריטיומית. כלי ה-pulse מקורר על קרח, בעוד כלי ה-chase מדגדר ללא סימון למשך תקופת chase רצויה. לאחר מכן, הדגימות עוברות ליזיס וחלבון גליקוזילי של עניין מופק בטהרה אימונולוגית, עובר דנטורציה והגליקנים שלו משוחררים באופן אנזימטי.האוליגוסכרידים מטוהרים עוד יותר באמצעות סינון מולקולרי, המפריד אותם מהחלבונים וממזהמים אחרים הגדולים מ-30 kilodaltons. לאחר מכן, הגליקנים מופרדים באמצעות HPLC. הכמות של כל צורת גליקן נקבעת על ידי מדידת עוצמת האות הרדיואקטיבי בכל פרקציה ששוללה.שלום, אני אדוארד אזו מהמעבדה של היי ג'רלדו לטר קרמר במחלקה למחקר תא ואימונולוגיה באוניברסיטת תל אביב. אני גם ממעבדת ג'רלדו לטר קרמר. והיום נראה לכם הליך לבידוד וניתוח של אוליגוסכרידים המסומנים ומקושרים מטבולית.אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את הדינמיקה של עיבוד שרשראות סוכר הן עבור מאגרי הגליקופרוטאינים התאיים הכוללים והן עבור גליקופרוטאינים בודדים. אוקיי, אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, השתמשו בתאי NIH three T three שגודלו למשך לילה בצלחת אחת של 90 מילימטר.עבור כל דגימה, התרבית היא בתבניות סוב-קונפלואנטית (sub confluent) כדי להרעיב את התאים לגלוקוז; הכין מצע טרי בריכוז פי 2 ללא גלוקוז, המוגבה ב-20% FCS דיאלייז והוסף שמונה מילימול Sodium pyruvate; דלל נפח אחד מהכמות הרצויה של המצע בריכוז פי 2 עם נפח אחד של מים דה-יוניים. חמם מראש את המצע, ולאחר מכן דגור כל דגימת תאים בחמישה מיליליטר של המצע הטרי שחומם מראש למשך חמש עד 15 דקות. אם נדרש שלב מרדף (chase) ארוך מ-12 שעות, יש לטפל בתאים בתנאים סטריליים.בסיום תקופת הדגירה, סמנו את הצלחות המתאימות לדגימות ה-pulse וה-chase. כדי לסמן את ה-n glycans עבור אנליזה של גליקופרוטאינים באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation), החליפו את מצע ההרעבה במיליליטר אחד של מצע ללא גלוקוז שחומם מראש, המועשר ב-400 micro curies per milliliter של manos מסומן בטריטיום כפול. השתמשו ב-65 micro curies per milliliter עבור סימון ואנליזה של גליקופרוטאינים סהום.לאחר החלפת מצע ההרעבה, דגרו את התאים בתנאי תרבית רקמה רגילים למשך שעה אחת. בסיום הדגירה של שעה אחת, הסירו את מצע הסימון מכל הדגימות. הוסיפו בזהירות 2 mL של PBS בטמפרטורה של 4°C לדגימות המיועדות לפולס (pulse) והניחו אותן על קרח. דגימות אלו מכונות פולסים.השתמשו ב-2 mL של מצע תרבית מלא רגיל שחומם מראש. שטפו את דגימות המרדף (chase samples) שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסיפו לתאים 5 mL מהמצע הרגיל שחומם מראש.הניחו את דגימות המרדף (chase) באינקובטור פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 °C למשך פרקי הזמן הרצויים. במהלך הדגרת דגימות המרדף, שטפו שלוש פעמים את דגימות הדחף (pulse), שהושארו על קרח, עם 2 mL של PBS קר מאוד. לאחר מכן, השתמשו בגרד תאים (cell scraper) כדי לגרד את התאים מהצלחת.העבירו את התאים ששוחררו לתוך מבחנה מסוג EOR בנפח שני מיליליטר המכילה 2 mL של PBS. סובבו את התאים ב-16,000 g למשך שש עד 10 שניות כדי להשקיע את העליון, והקפיאו את משקע התאים בטמפרטורה של 80°C-. עם סיום האינקובציה של דגימות המרדף (chase samples), שטפו אותן.סבבו ואחסנו כפי שהודגם עבור דגימות הדופק. עם המוכנות להמשיכה לשלב ליזיס התאים, הוציאו את התאים מהמקפיא. עבור ניתוח ה-IP, בצעו ליזיס לתאים על ידי הוספת 300 µL של בופר.ערבבו קצרה במערבל (vortex) והדגרימו למשך 20 דקות על קרח. לצורך ניתוח דגימות של גליקופרוטאינים כלליים, השתמשו ב-300 microliters של buffer B. הדגימו את התאים למשך 20 דקות על קרח, ולאחר מכן בצעו סוניקציה ארבע פעמים, למשך 10 שניות בכל פעם בעוצמה מרבית. לאחר מכן, הרתיחו את הדגימות למשך חמש דקות.לבסוף, סנטריפוגו את כל הליזאטים במהירות של 16,000 Gs למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט למבחורת EOR חדשה והשליכו את המשקע. המשיכו ל-IP לבדיקת חלבון מטרה עבור immunoprecipitation של הגליקופרוטאין H two A שהודגם כאן.הוסיפו לתוספת של התאים המלוHים 20 µL לכל דגימה של חלבון A agro speeds ושלושה µL לכל דגימה של הנוגדן polyclone rabbit anti H2A של המעבדה. דגרו את הדגימות במשך 4 עד 16 שעות בטמפרטורה של 4 °C, תוך ערבוב רציף באמצעות סיבוב איטי. בתום הדגירה, סבבו את החרוזים למטה והסירו בזהירות את התתוספת באמצעות ואקום, ושטפו את החרוזים ארבע פעמים על ידי הוספה של 500 µL של בופר T.סובב את החרוזים בצנטריפוגה להורדתם והסר את הנוזל העליון (supernatant) כדי לשחרר את החלבונים הקשורים מהחרוזים. הוסף 10 µL של תמיסת דנטורציה (denaturing buffer) מהערכה של endo H למשקע החרוזים והרתח את הדגימות למשך חמש דקות. סובב את החרוזים בצנטריפוגה והעבר את הנוזל העליון למבחנת EOR חדשה.חלבוני ה-ellu מוכנים כעת להסרת גליקוזילציה (deglycosylation). הגליקנים משוחררים הן מדגימות ה-IP והן מדגימות החלבון הכולל באמצעות האנזים ו-OH. עבור דגימות ה-IP, הוסיפו 0.5 µL של אנזים endo H לכל דגימה, יחד עם 10 µL של תמיסת ריאקציה endo H בריכוז פי 2. הדגירו את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות.עבור גליקופרוטאינים סהורים, העבירו את העלייה של ליזאטי התאים למסנן MicroCon עם סף סינון של 30 kilodalton. שטפו את תמצית החלבון הכוללת שלוש פעמים עם 100 µL של באפר E באמצעות צנטריפוגציה חוזרת ב-14,000 Gs למשך שלוש דקות. הוסיפו ל-MicroCon, במקום שבו נותרו החלבונים השטופים, שלוש µL של 10 x endo H reaction buffer ו-1.5 µL של האנזים endo H, והדגרירו למשך שלוש שעות ב-37 °C יחד עם דגימות ה-IP.בסיום שלוש שעות האינקובציה, יש לדלל את דגימת ה-IP פי חמישה במים דה-יוניים, להניח אותה על מסנן MicroCon חדש ולסובב בצנטריפוגה ב-14,000 Gs למשך שלוש דקות. לאחר מכן, יש לשטוף הן את דגימת ה-IP והן את דגימות החלבון הכולל על ידי הוספת 50 microliters של מים דה-יוניים וסבוב של הדגימות בצנטריפוגה. יש לחזור על הפעולה פעמיים נוספות. במידת הצורך, יש לשמור את התסנין המכיל את הגליקנים המנוקים, בתוך מבחנות המכילות endo H. את הגליקופרוטאינים העמידים ל-endo H מדגירים לאחר מכן עם 200 milli units של N glycosate F ב-15 microliters של באפר C בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 16 שעות.ביצוע אלוציה באמצעות מים דה-יוניים כפי שהודגם. ייבשו את הדגימות לחלוטין באמצעות מרכז תמיסות מהיר (speedvac) עם חימום עד 45 °C כדי להאיץ את התהליך. השעיו שוב את המשקעים היבשים ב-12 µL של ממס HPLC והעמיסו את הדגימות על עמודת sphe או עמודת amino המותקנת במכשיר ה-HPLC.הריצו את הדגימות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. אספו 48 פרקציות עבור כל הרצת דגימה. השתמשו במונה סינצילציה כדי למדוד את ערכי ה-CPM של הפרקציות שנאספו, ושרטטו את קריאת ה-CPM כפונקציה של מספר הפרקציה.חשבו את אחוז שאריות ה-manos של כל מיני הגליקנים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. להלן תוצאות מייצגות של ניתוח שרשראות סוכר של גליקופרוטאינים כוללים מדגימה שעברה סימון פולס של שעה אחת. קריאת ה-CPM של פרקציוני ה-HPLC מוצגת כפונקציה של מספר הפרקציה בפרופיל המתקבל.כל שיא מייצג סוג גליקן ספציפי שזוהה באמצעות הרצת HPLC של סטנדרטים ידועים של גליקנים. עבור כל סוג גליקן, אחוז המולרי שלו מכלל הגליקנים מוצג כפונקציה של זמן המרדף (chase). ניתוח זה מוצג כאן עבור גליקופרוטאין מקומט ספציפי שבודד באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) מדגימה שטופלה במעכב הפרוטאוזום MG 1 32.סוג הגליקן המקוצר M five six מצטבר במהלך תקופת המרדף (chase period), מה שמוביל למסקנה כי אוליגוסכרידים הנמצאים על חלבון מקופל באופן שגוי עוברים קיצור נרחב של מן (man trimming) לפני הפירוק. זאת בניגוד לאוליגוסכרידים על גליקופרוטאינים כלליים מדגימות שטופלו באופן דומה; כאן, M nine eight נותר סוג הגליקן העיקרי במהלך המרדף, עם עלייה קלה בלבד בכמות ה-M five six. עובדה זו מובילה למסקנה שרק חלק קטן ממאגר הגליקופרוטאינים הכללי מכוון לפירוק חלבונים הקשור לרשתית התוך-פלזמית (ER associated protein degradation).רדיואקטיביות מקוצרת. כפי שהוסבר בהרחבה בפרוטוקול הכתוב המצורף, הדגמנו כעת כיצד להשתמש בשילוב של סימון בתאים חיים ואנליזת HPLC כדי לעקוב אחר הדינמיקה של הרכב האוליגוסכרידים שאינם מקושרים במהלך חיי הגליקופרוטאין. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להימנע מזיהום של דגימות המרדף (chase) בעקבות של חומרים רדיואקטיביים, דבר שיוביל לסימון לא רצוי של הגליקנים במהלך תקופות המרדף בזמן הפרדה לפי גודל.חשוב גם לכוון את ה-HPLC ללחץ קבוע כדי להבטיח עקביות בפרקציונציה של הגליקנים. זהו כל התהליך. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

pulse-chase-analysis-n-linked-sugar-chains-from-glycoproteins

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה ספציפית ורגישה לגיבוש תובנה לפרופיל הביטוי של אנטיגנים glycosphingolipid באיברים ותאי חיסון מתוארת. השיטה מנצלת את ספקטרומטריית מסות מלכודת היונים המאפשר פיצול צעד חכם של מולקולות glycosphingolipid לניתוח מבני בהשוואה לסטנדרטים מסונתזים כימי.

ניתוח ספקטרומטריה של אנטיגנים Glycosphingolipid

חלבונים בתא שטח הם חשובים מבחינה ביולוגית וglycosylated באופן נרחב. אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד לsolubilize, להעשיר, וdeglycosylate חלבונים אלה לניתוחי proteomic מבוססים LC-MS קליל.

Glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

על מנת לחקור באופן מקיף את המגוון של גליקנים מקושרים O, הליך חדש לסילוק β רדוקטיבי בתוך הג'ל, בשילוב עם פרמתילציה ושיטת חלוקת פאזה מהירה, מיושם לניתוח גליקנים מקושרים O המשתחררים ישירות מגליקופרוטאינים שנפתרו על ידי SDS-PAGE וניתנים לניתוח גליקומי לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.

השתפר בג&#39;ל Sulfo-glycomics β-ביעור עבור מקיף O צמוד וReductive ידי ספקטרומטריית מסה

פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה פותח לטיהור משולב של פרוטאומיקה וגליקומיקה וכימות LC-MS/MS בפלזמה. ניתוח Deamidation של מוטיבים של גליקוזילציה המקושרים ל-N היה ספציפי לאתרים דה-גליקוזיליים. כימות מדויק של N-גליקנים הושג על ידי צימוד הפרדת N-גליקן בסיוע מסנן לנורמליזציה של האינדיבידואליות בעת תיוג עם אסטרטגיית תגי גליקן הידרזיד.

Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

מאמר זה מציג צורה משופרת של טכניקת גליקומיקה חדשה מלמטה למעלה שנועדה לנתח את פרופיל ההרכב המאוגד של גליקנים בנוזלים ביולוגיים לא מפוצלים באמצעות פירוק כימי של גליקנים לחד-סוכרים ספציפיים לקישור המרכיב אותם לזיהוי על ידי GC-MS. יישומים פוטנציאליים כוללים גילוי מוקדם של סרטן והפרעות אחרות הנוגעות לגליקן.

ניתוח צומת glycan: גישה מלמטה למעלה כדי glycomics

אנו מתארים שיטה שונה לבידוד שבריר קרום מתאי אדם הכנת מדגם לצורך זיהוי של -glycosylation SCAP N ו- חלבון הכולל באמצעות כתם מערבי. בנוסף, אנו מציגים שיטה GFP תיוג לפקח סחר SCAP באמצעות מיקרוסקופ confocal. פרוטוקול זה יכול לשמש במעבדות ביולוגיה קבועות.

ניתוח של SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation וסחר בבני אדם תאים

חומצה sialic היא אופיינית חד-סוכר-יחידה נמצאו ב- glycoconjugates. זה מעורב שפע של אינטראקציות מולקולרית, תאית. כאן אנו מציגים שיטה כדי לשנות את תא השטח חומצה sialic הביטוי תוך שימוש glycoengineering מטבולית עם N- acetylmannosamine נגזרים.

Glycoengineering מטבולית של חומצה Sialic באמצעות N-acyl השומן-שונה Mannosamines

כאן נתאר פרוטוקול עבור שיטה כללית. צ'ייס הדופק המאפשר ניתוח קינטי של קיפול, תחבורה, והשפלה של חלבונים להיות בעקבות בתאים חיים.

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

שינויים לאחר התרגום (PTMs) משנים את המבנים והתפקודים של חלבונים. שיטות להעשרה בו-זמנית של סוגי PTM מרובים יכולות למקסם את הכיסוי בניתוחים. אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת Ti(IV) דו-תפקודית ואחריה ספקטרומטריית מסה להעשרת וניתוח בו זמנית של חלבון N-גליקוזילציה וזרחון ברקמות הלבלב.

אסטרטגיית העשרת ספין-טיפ לניתוח סימולטני של N-גליקופפטידים ופוספופפטידים מרקמות הלבלב האנושיות

כאן, אנו מציעים פרוטוקול פשוט המשלב הנדסת אוליגוסכריד מטבולית, כימיית קליקים ומיקרוסקופ הרחבה המאפשר הדמיה ביולוגית של N-גליקופרוטאינים תוך-תאיים עם רזולוציה משופרת באמצעות ציוד מיקרוסקופיה שגרתי.

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

למדו לנתח שינויים בשרשראות סוכר N-linked בגליקופרוטאינים בתאי יונקים באמצעות שיטת pulse-chase ו-HPLC. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת עיבוד הסוכרים ותפקודם התאי.

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

גלה סרטונים נוספים