MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה
April 29th, 2007
וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה / אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS).
ברוכים הבאים למדריך CHI Lab על שיטת השכבה הדקה במיוחד, השימושית במיוחד לקביעת מסה מדויקת של חלבונים. בגלל האופי הרגיש של ספקטרומטריית מסה, אנו משתמשים רק בריאגנטים בדרגת HPLC כמו גם בכפפות לטקס או ניטריל ללא אבקה לניקוי הצלחת. שוטפים לסירוגין במי מתנול, ואז לבסוף שוב מתנול.
בין כל שטיפה, יש לנגב בעדינות את עודפי הממס באמצעות רקמת העדשה. אתה יכול לחזור על שלבי הכביסה הללו כמה פעמים שצריך כדי לייצר צלחת נקייה. ולאחר ניקוי וייבוש, יש להשתמש בצלחת באופן מיידי.
מרחו ומרחו 20 עד 30 מיקרוליטר של תמיסת מצע שכבה דקה על פני צלחת MALDI הנקייה. כאן אנו משתמשים בקצה פיפטה P 2 50 כדי לפזר את התמיסה באופן שווה תוך הימנעות מגירוד הצלחת. כאשר השכבה הדקה מתייבשת, הסירו את כל טיפות המים שנותרו אם קיימות על ידי ספיגה עדינה במגבון קים.
לאחר מכן נגב בעדינות את הצלחת בתנועה חלקה אחת עם מגבון קים כדי ליצור כראוי את השכבה הדקה. לבסוף, נקו את שולי הצלחת כדי למנוע זיהום של ספקטרומטר המסה. חיוני לבדוק את השכבה הדקה לפני מריחת הדגימה שלך.
אם לנקודת הבדיקה לוקח יותר מדי זמן להתייבש במקום שבו הגבישים אינם הומוגניים, הבעיה עלולה להיות בתוך השכבה הדקה עצמה או תמיסת המטריצה, נקו את הצלחת, מרחו מחדש את השכבה הדקה ובדקו מחדש. כשאתה מכתים על השכבה הדקה, אתה לא רוצה שהכתמים שלך יתאדו ליובש. במקום זאת, לאחר שההתגבשות האטה ונעצרה, הסר את עודפי הממס.
באמצעות שואב ואקום, נוכחותם של מזהמים כגון מלחים וחומרי ניקוי, כמו גם ריכוז אנליטים גבוה עלולים להפריע להתגבשות. דילול נוסף של הדגימה עשוי לשפר את ההתגבשות אתר את הנמלים בסמיכות לדגימה. זה יאפשר כיול פנימי פסאודו שבו הצלחת מועברת מנקודת הדגימה לנקודת הכיול.
במהלך רכישת דגימה, הוספת כמה זריקות לייזר של ה-CAS לספקטרום, גישה זו מבטיחה כיול דיוק מסה גבוה יותר מאשר כיול חיצוני בלבד. חשוב מאוד לשטוף את כל המזהמים כגון מלח או חומר ניקוי שעלולים להפריע לאנליט. יינון. לשם כך, זרוק חומצה אצטית קרה, 0.1% Tri Fluor ב-HPLC, דרג מים ישירות על הכתמים.
הסר את תמיסת הכביסה באמצעות שואב ואקום כפי שמוצג כאן. שיטה זו מייצרת ספקטרום מצוין הן עבור חלבונים ממברניים והן עבור חלבונים מסיסים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את הכנת שכבת מטריקס/אנליט דקה במיוחד לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי ספקטרומטריית מסה של יינון בדיסוציה בלייזר עם מטריקס (MALDI-MS). השיטה היא חיונית לקביעת מסה מדויקת של חלבונים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ספקטרומטריית מסה
- ניתוח חלבונים
- כימיה אנליטית
רקע
- ספקטרומטריית מסה היא טכניקה רגישה לניתוח ביו-מולקולות.
- הכנת צלחת הדגימה היא קריטית לתוצאות מדויקות.
- חומרי ניקוי בדרגת HPLC מומלצים לניקוי.
- טכניקות טיפול וניקוי נכונות משפרות את איכות הניתוח.
מטרת המחקר
- להדגים את שיטת השכבה הדקה במיוחד ל-MALDI-MS.
- לוודא קביעת מסה מדויקת של חלבונים.
- לספק הדרכה על שיטות עבודה מומלצות להכנת הדגימה.
שיטות בשימוש
- שימוש בחומרי ניקוי בדרגת HPLC.
- ניקוי הצלחת עם מתנול ומים.
- ניגוב עודפי ממס עם רקמת עדשה.
- שימוש מיידי בצלחת המנוקה לניתוח.
תוצאות עיקריות
- הוכחו שיטות ניקוי יעילות לצלחת הדגימה.
- הוצגה החשיבות של שימוש בחומרים מתאימים.
- הוצגו צעדי הכנה לשכבה דקה במיוחד.
- סופקו תובנות לשמירה על שלמות הדגימה.
מסקנות
- שיטת השכבה הדקה היא חיונית לספקטרומטריית מסה מדויקת.
- טכניקות ניקוי והכנה נכונות הן חיוניות.
- ביצוע שיטות עבודה מומלצות יכול לשפר משמעותית את תוצאות הניתוח.
שאלות נפוצות
Chapters in this video
2:05
Step 5: test of the thin layer
2:50
Step 6: sample application
3:47
Step 7: calibrant application
1:52
Step 4: preparation of the matrix solution
0:58
Step 3: making the thin layer substrate
0:20
Step 1: cleaning of the sample plate
4:20
Step 8: washing step
0:46
Step 2: preparation of the thin layer substrate solution
5:05
Step 9: acquisition of mass spectra
