Name: MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: למד את שיטת השכבה העדינה לאנליזת חלבונים ב-MALDI-MS. הדגמה זו מציגה הכנת דוגמאות אולטרה דקות לקביעת מסה מדויקת של פפטידים וחלבונים בביוכימיה אנליטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

חשוב מאוד ללבוש אבקת ללא כפפות במהלך תקופת ההכנה של שכבת דק. ניקוי הצלחת מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש נירוסטה או ציפוי זהב MALDI המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם MeOH ולנגב בעדינות עם Kimwipe. אל תשפשפו או תגרדו את פני השטח עם Kimwipe, כדי למנוע מגרד את פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם H 2 O ולנגב בעדינות עם Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם MeOH ולנגב בעדינות עם Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, חזור MeOH / H 2 O / MeOH מחזור ניקוי, תמיד וכלה MeOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי אין כתמים רפאים או שאריות שנותרו על הצלחת. אם יש כתמים רפאים, לשטוף את הצלחת במים deionized תוך שפשוף פני השטח עם יד בכפפה שלך (לא לשפשף עם Kimwipes). חזור על MeOH / H 2 O / MeOH מחזור הניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צלחת מיד לאחר הכביסה. </li></ol> הכנת הפתרון שכבה דקה המצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב 1 חלק רווי 4-HCCA (2 חלקים ACN, 1 חלק מים, ו - 0.1% TFA סופי) ו 3 חלקים isopropanol. הערה: פתרון דק שכבת המצע הוא יציב מאוד, אפשר לשמור בטמפרטורת החדר בחושך במשך שנה. זה עשוי גם להיות מאוחסן ב -4 ° C. </li></ol> ביצוע המצע שכבה דקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 20-50μL של הפתרון המצע שכבה דקה על מרכז שמאל של הצלחת, ופרש עם הצד של הטיפ פיפטה. טאטא בכיוון אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ככל מתייבש פתרון, מתאדה ממס אורגני מהר מאוד, והותיר אחריו טיפות זעירות של מים על פני הצלחת. בשלב זה, לעטוף את האצבע המורה עם רובדי של Kimwipe ובתחילה כתם בעדינות את פני השטח של צלחת עם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר פני השטח הוא משתחרר מן טיפות מים, לנגב את הצלחת עם כל חד כיוונית תנועות רחבות באמצעות Kimwipe. הערה: אם הפתרון אינו מספיק להתפשט בכל רחבי השטח צלחת, להגדיל את הרכב ACN ו מחדש את שכבה דקה. כמה פרמטרים שעשויים להשפיע על התפשטות של הפתרון כוללים חום ולחות הסביבה. הערה: עם צלחות זהב, שכבת מופיע בדרך כלל כהשתקפות צהבהב, תלוי זוויות צפייה אור. עם לוחות פלדה, רק את הקצה של השכבה גלוי בדרך כלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את הקצוות של צלחת עם Kimwipe טרי לפני הצבת אותו מחזיק את הצלחת כדי למנוע זיהום של מטריקס מכשיר. </li></ol> הכנת התמיסה מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://prowl.rockefeller.edu/protocols/saturated-4HCCA-solution.html">רווי 4-HCCA</a> ב FWI (3 חלקים חומצה פורמית, 1 חלק מים, 2 חלקים isopropanol) מומלץ ניתוח קרום והן חלבונים מסיסים. זה יכול לשמש גם במקרים מיוחדים לצורך ניתוח של פפטידים גדולים מאוד הידרופובי (M&gt; 4000 u). ודא כי פתרון מטריצה ​​המשמשת תצפית החלבונים אינו עולה ~ תוכן אורגניים 50%, כפי שהוא לחלוטין לפזר את המצע שכבה דקה, להביס את היתרונות של השיטה. </li></ol> מבחן של המצע שכבה דקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 0.5μL מהפתרון מטריקס על הצלחת. משקע לבנבן יופיעו בממשק שבין שכבת דק ואת רביב. כאשר שכבה זו מכסה את החלק התחתון של אגל לחלוטין, בדרך כלל בתוך 10-15 שניות, לשאוב את הנוזל העודף עם קו ריק. אם זה לוקח יותר זמן מאשר 30 שניות לזרז את הטופס, הוא אינדיקציה לכך שאולי יש בעיה עם המצע שכבה דקה ו / או פתרון מטריקס. </li></ol> לדוגמה יישום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז אנליטי של פתרונות המוצא צריכה להיות בטווח של 10 ו 1000μM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את פתרון אנליטי בפתרון מטריצה ​​כדי ריכוז אנליטי הסופי בין 0.2 ל 2μM. למשל, להתחיל עם 1μl של מדגם 9μl של פתרון מטריקס. הערה: ודא כי המטריצה ​​קרוב להיות רווי הפתרון הסופי, אחרת אתה תהיה redissolve המצע שכבה דקה. הערה: ריכוזים אנליטי נדרש לקבל אותות הגון הם תלויים במידה רבה על מורכבותו פתרון הרכב (למשל, מזהמים) ו ionizability אנליטי. הערה: אם דילול בשלב יחיד אינו להניב תוצאות טובות, כדאי לך לנסות עוד צעד דילול. למרות נגדית אינטואיטיבי, פתרונות אנליטי מרוכז מאוד נדירות לייצר ספקטרום טוב. הערה: חלבונים ממברנה בדרך כלל דורשים דילולים גדולים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 0.5μl תערובת מדגם / מטריצה ​​על הצלחת. משקע לבנבן יהוו בממשק שבין שכבת דק ואת רביב. משקע זה cocrystallization של מטריקס אנליטי. כאשר שכבה זו מכסה את החלק התחתון של אגל לחלוטין, usuברית בתוך 10-15 שניות, לשאוב את הנוזל העודף עם קו ריק. אם זה לוקח יותר מ -30 שניות עבור לזרז את הטופס, זה עשוי להיות אינדיקציה להציג המזהם, אשר מונע התגבשות, או אנליטי שלך מרוכז מדי. </li></ol> Calibrant יישום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת calibrant / מטריצה ​​באופן דומה עם ריכוז calibrant הסופי בין 0.1-0.5μM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 0.5μl calibrant / מטריצה ​​התערובת על הצלחת בסמיכות הנקודות המדגם. קרבה פיזית זו משמש הליך מדומה כיול פנימי שבו צלחת מועבר מן המקום מדגם למקום calibrant במהלך הרכישה המדגם, כדי להוסיף כמה יריות לייזר calibrants כדי הספקטרום. גישה זו מבטיחה דיוק גבוהה יותר מאשר המסה כיול כיול חיצוני בלבד. </li></ol> כביסה צעד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם כל נקודה כ 2μL של פתרון קרים כקרח 0.1% TFA מימית. לשאוב נוזל עודף עם קו ריק. </li></ol> רכישת ספקטרום המונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת אתה מוכן לרכוש ספקטרה המונית. אם אתה משתמש בפתרון מטריצה ​​FWI, עליך לרכוש ספקטרה שלך בהקדם האפשרי כדי למנוע שינוי בלתי הפיך אנליטי, כגון formylation. </li></ol>

<ol><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+Increase+Contaminant+Tolerance+in+Protein+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+by+the+Fabrication+of+Thin+Protein-Doped+Polycrystalline+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li>
<li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust%2C+Detergent-Friendly+Method+for+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Integral+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins.</a> Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li>
<li>Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).</li>
</ol>

זה קריטי, כי כל ריאגנטים הם באיכות הגבוהה ביותר (כגון HPLC כיתה). אבקת ללא כפפות (לטקס או nitrile) נירוסטה או ציפוי זהב MALDI מדגם מתנול (MeOH) מים Kimwipes אלפא cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (4-HCCA) Trifluoroacetic חומצה (TFA) (הריכוז הסופי של 0.1% ב H 2 O) אצטוניטריל (ACN) חומצה פורמית Isopropanol

maldi הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה ​​/ אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS) 1, 2. השיטה דקים שכבת כולל ייצור של שכבת המצע של גבישים מטריקס (אלפא cyano-4-hydroxycinnamic חומצה) על הצלחת המדגם, אשר משמש קרקע זריעת לגיבוש הבאות של תערובת מטריצה ​​/ אנליטי. יתרונות השיטה דקים שכבת פני גישות אחרות בתצהיר מדגם (טיפה מיובשים למשל) הם שהוא מספק (i) סובלנות גדולה יותר זיהומים כמו מלחים דטרגנטים, (ii) רזולוציה טובה יותר, וכן (iii) אחידות מרחבית גבוהה יותר. שיטה זו שימושית במיוחד לקביעת המסה המדויקת של החלבונים. פרוטוקול פותחה בתחילה אופטימיזציה עבור ניתוח של חלבונים בממברנה ומשמש בהצלחה לנתח תעלות יונים, מובילי המטבוליט, ואת הקולטנים, המכיל בין 2 ל 12 תחומים הטרנסממברני 2. מאז פרסום מקורי, הוא הראה גם להיות שימושי באותה מידה לניתוח חלבונים מסיסים. אכן, יש לנו השתמשתי בה עבור מספר גדול של חלבונים בעל מגוון רחב של תכונות, כולל אלה עם ההמונים מולקולרי גבוה ככל 380 kDa 3. עכשיו שיטת הבחירה שלנו לצורך ניתוח המסה המולקולרית של כל החלבונים. ההליך המתואר באופן עקבי מייצרת באיכות גבוהה ספקטרה, והוא רגיש, חזק, וקל ליישום.

וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה ​​/ אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

סרטון זה מדגים את הכנתה של שכבת מטריצה/אנליט דקה במיוחד לצורך ניתוח פפטידים וחלבונים באמצעות דסורפציה/יוניזציה בלייזר בסיוע מטריצה...

ברוכים הבאים למדריך של מעבדת CHI על שיטת השכבה הדקה במיוחד, אשר שימושית במיוחד לקביעה מדויקת של מסת חלבונים. בשל רגישותה של ספקטרומטריית מסות, אנו משתמשים אך ורק בריאגנטים בדרגת HPLC וכן בכפפות לטקס או ניטריל נטול אבקה לניקוי הפלטה. שטפו לסירוגין עם מתנול ומים, ובסיום שוב במתנול.בין שטיפה אחת לשנייה, נגבו בעדינות את עודפי הממס באמצעות נייר עדשות. ניתן לחזור על שלבי השטיפה הללו כמספר הפעמים שיידרש כדי לקבל פלטה נקייה. לאחר שהפלטה נקייה ויבשה, יש להשתמש בה באופן מיידי.יש למרוח ולהפיץ 20 עד 30 µL של תמיסת תשתית לשכבה דקה על גבי לוח MALDI נקי. כאן אנו משתמשים בקצה של פיפט P250 כדי להפיץ את התמיסה באופן שווה תוך הימנעות משריטת הלוח. בעת התייבשות השכבה הדקה, יש להסיר טיפות מים שנותרו, במידה וישנן, על ידי ספיגה עדינה עם נייר Kimwipe.לאחר מכן, נגבו בעדינות את הפלטה בתנועה חלקה אחת באמצעות Kim wipe כדי ליצור את השכבה הדקה בצורה נכונה. לבסוף, נקו את שולי הפלטה כדי למנוע זיהום של מספק המסות (Mass spectrometer). חיוני לבצע בדיקה של השכבה הדקה לפני יישום הדגימה.אם נקודת הבדיקה לוקחת זמן רב מדי להתייבש במקומות שבהם הגבישים אינם הומוגניים, ייתכן שהבעיה נעוצה בשכבה הדקה עצמה או בתמיסת המטריצה; יש לנקות את הפלטה, למרוח מחדש את השכבה הדקה ולבצע את הבדיקה שוב. בעת הנחת נקודות על השכבה הדקה, אין לאפשר

maldi-sample-preparation-the-ultra-thin-layer-method

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טיפול תרופתי חלופי באמצעות דופמין L-DOPA הוא טיפול סימפטומטי הנפוץ ביותר של מחלת פרקינסון, אך מלווה תופעות לוואי, כולל תנועות לא רצוניות חריגות, dyskinesia...

MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה של נוירופפטידים אצל חולי פרקינסון

פיתחנו טכנולוגיה המבוססת על הסרט סיליקה mesoporous דק להתאוששות סלקטיבית של חלבונים נמוך משקל מולקולרי ופפטידים מ בסרום אדם. פיסיקלי כימי את המאפיינים של שבבי mesoporous שלנו היו מכוון היטב כדי לספק שליטה משמעותית להעשרת פפטיד ולכן פרופיל proteome סרום למטרות אבחון.

חלבון נמוך מולקולרית משקל העשרה על סרטים סיליקה mesoporous דק גילוי סמן ביולוגי

מדידת מסה מדויקת מייצגת צעד חשוב במהלך החקירה של חלבונים. desorption / יינון בסיוע מטריקס לייזר (MALDI) ספקטרומטריית מסה (MS) יכולה לשמש לקביעה כאמור והיתרון המרכזי שלו הוא הסובלנות למלחים, חומרי ניקוי וחומרים מזהמים. כאן אנו מדגימים גישה נגישה לניתוח חלבונים גדולים יותר מאשר על ידי MALDI-MS 100 kDa.

מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון זמן של טיסה (MALDI-TOF) Mass ניתוח Spectrometric של חלבונים שלמים גדול מ100 kDa

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9 ,10 dihydroanthracen--9-אחד) כבר דווח בעבר כמטריצה ​​MALDI הדמיה רקמה של מולקולות קטנות; פרוטוקולים לשימושם של DT להדמית MALDI של שומני אנדוגני על פני השטח של חלקי רקמות על ידי חיובי יון MALDI-MS במכשיר quadrupole-FTICR רזולוציה ultrahigh מסופקים כאן.

Dithranol כמו מטריקס לליזר Desorption / יינון ההדמיה מטריקס Assisted על Fourier Transform יון הציקלוטרון התהודה ספקטרומטר מסות

ההדמיה ספקטרומטריה (MSI) היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בם כדי לגלות ולזהות תרכובות כימיות שונות ברקמות שלמות, שמירה על התרכובות בסביבות האם שלהם, אשר יכול לספק תובנות חדשות על תהליכים ביולוגיים. להלן שיטת MSI פיתחה לניתוח של מולקולות קטנות, הוא תאר.

ההדמיה MALDI-Mass Spectrometric לחקירת במטבוליטים<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; רוט גושים

מקור הדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) המופעל בלחץ אטמוספרי פותח על ידי צימוד ספיגת לייזר אינפרא אדום בינוני ופוסט-יינון אלקטרוספריי. מטריצת קרח אקסוגנית שימשה כמטריצה סופגת אנרגיה כדי להקל על ספיגה תהודה של חומר הקשור לרקמות. כתב יד זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע IR-MALDESI MSI של עכבר יילוד בכל הגוף.

הדמיה של כל הגוף ספקטרומטריית מסה על ידי אינפרא אדום מטריקס בסיוע לייזר Desorption electrospray יינון (IR-MALDESI)

פרוטוקול להפחתת heterogeneities המרחבי של אותות יון ספקטרומטריית MALDI ההמונית על ידי ויסות טמפרטורת מצע במהלך תהליכי ייבוש מדגם מודגם.

הכנת דוגמאות MALDI אחידה עבור יישומים כמותי

שיטה של הכנת הדוגמא פותחה כדי להתאים coculture תאים ורקמות לזהות מולקולה קטנה exchange באמצעות ספקטרומטר מסה הדמיה.

לכידת תקשורת מולקולה קטנה בין רקמות ותאים באמצעות הדמיה ספקטרומטר מסה

מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת המדגם בעת תכנון ניסויים באמצעות MALDI MSI כדי למקסם זיהוי מטבולי ומולקולרי בדגימות ביולוגיות.

הכנה לדוגמה ליצירת פרופיל מטבולי באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה MALDI

מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת דגימה נכונה לניתוח שומנים ומטבוליטים ברקמות קטנות, כגון מוח דרוזופילה , באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסות בסיוע מטריצה.

הכנת דגימה לניתוח שומנים מהיר במוח דרוזופילה באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של ספיחה/יינון בלייזר בסיוע מטריצה

למד את שיטת השכבה העדינה לאנליזת חלבונים ב-MALDI-MS. הדגמה זו מציגה הכנת דוגמאות אולטרה דקות לקביעת מסה מדויקת של פפטידים וחלבונים בביוכימיה אנליטית.

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

גלה סרטונים נוספים