האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח
15 ביוני 2010
מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת תרגום הריבוזומים של התאים האיקריוטים. לאחר שחולצו, ריבוזומים מופרדים monosomes ו polyribosomes על ידי חלוקה סוכרוז הדרגתי כדי לאפשר לאוכלוסיות שונות ריבוזומלי להיות מנותח. ככזה, שיטה זו היא תקן הזהב לבחינת הרגולציה של התרגום.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להפריד ולהשוות את אזור המונו ושברי הפולי ריבוזום מליזטים של תאים. זה מושג על ידי תרבית תחילה של התאים המעניינים. השלב השני בהליך הוא הכנת ליזט התא.
השלב השלישי בהליך הוא צנטריפוגה של הליזאט דרך שיפוע סוכרוז. השלב האחרון של ההליך הוא פיצול השיפוע והדמיה של האוכלוסיות הריבוזומליות השונות באמצעות עקבות UV. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים בתרגום בתנאי ניסוי שונים באמצעות ניתוח פרופיל פולי ריבוזום.
היי, אני אנתוני אספוזיטו מהמעבדה של ד"ר טרי גוס קינסי במחלקה לגנטיקה מולקולרית, מיקרוביולוגיה ואימונולוגיה ב-UMD ובבית הספר לרפואה ג'יי רוברט ווד ג'ונסון. ואני מרקוס לואיס. גם ממעבדת מקינזי כאן ב-R-W-J-M-S.
היום אנו הולכים להראות לך הליך לניתוח פולי ריבוזום. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור שינויים וסינתזת חלבונים הנובעים ממוטציות או גורמים סביבתיים. אז בואו נתחיל. סוכרוז.
יש להכין שיפועים יום אחד לפני השימוש כדי לאפשר לשיפועים להיות רציפים. מערבבים את הנפחים המתאימים של 7% ו-47% תמיסות מלאי סוכרוז כדי ליצור 48 מיליליטר מכל אחד מריכוזי הסוכרוז הבאים, 7%17%27%37% ו-47%הוסף DTT מולארי אחד לכל תמיסת סוכרוז לריכוז סופי של מילימול אחד. על מנת לשפוך את השיפועים, חבר פיפטת פסטה למזרק של 20 מיליליטר על ידי אבטחה ואיטום עם סרט פרה.
הוסף שבעה מיליליטר של 7% סוכרוז לתחתית צינור צנטריפוגה פולי עאמר בגודל 1 אינץ' על 3.5 אינץ'. לאחר מכן, הוסף שבעה מיליליטר של תמיסת סוכרוז 17% מתחת לתמיסה של 7% על ידי הנחת קצה פיפטת הפסטה ליד החלק התחתון של פיפטת הצינור באיטיות. זה אמור לקחת לא פחות מ -20 שניות לשפוך כל שכבה.
חזור על הפעולה עם שבעה מיליליטר כל אחד של תמיסות סוכרוז של 27%37% ו-47% כאשר השיפוע השתעמם. עליך להבחין בקווים ברורים בין השכבות המציינים כי התרחש ערבוב מינימלי. אחסן את כל השיפועים של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה, יחד עם הרוטורים, הבקבוקים והצינורות שישמשו לאיסוף דגימות.
להכנת תמציות מתאי שמרים, התחל בגידול מאה 25 מיליליטר של תרבית שמרים ל-OD 600 של 0.8 לאחד. הוסף ציקלו היידה לתרבית לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר והמשיך לנער ב-30 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, שפכו את התרבות לבקבוק צנטריפוגה של 250 מיליליטר ומלאו בקרח.
שמור הכל על הקרח מנקודה זו והלאה צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 8,000 למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. החייאה, השעו את הגלולה ב -10 מיליליטר קרח, ליזה קרה, חיץ והעבירו לצינורות פוליפרופילן של 15 מיליליטר. צנטריפוגה בעוצמה של פי 5,900 מכוח הכבידה למשך שלוש דקות של ארבע מעלות צלזיוס רסוס.
השעו את הגלולה ב-0.5 מיליליטר של מאגר ליזה. העבירו את המתלה לצינור מיקרו פוגה בנפח 1.5 מיליליטר ואז הוסיפו 0.5 מיליליטר חרוזי זכוכית שטופים בחומצה אפויה צוננת. מערבל את התאים במשך ארבעה מרווחים של 32, וקורא לצינור על הקרח למשך 30 שניות בין כל מרווח.
לאחר מכן הוסף עוד 0.5 מיליליטר של מאגר ליזה לצנטריפוגת הצינור של 1.5 מיליליטר ב-5,000 פעמים. כוח משיכה למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לבסוף, העבירו את הסופינאט לצינור מיקרו צנטרי חדש בנפח 1.5 מיליליטר. ניתן לאחסן את התמצית במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי להעביר את הליזאט לשיפוע הסוכרוז. הנח את קצה הפיפטה על דופן הצינור ליד פני השיפוע ושכב בעדינות את הליזאט על גבי השיפוע.
עבור שיפוע של 35 מיליליטר, נטען בדרך כלל 500 מיקרוליטר ליזאט. בעזרת מלקחיים, הורד בזהירות את השיפוע לדלי של רוטור דלי מתנדנד. צנטריפוגה את השיפועים בכוח הכבידה פי 100,000 למשך ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס.
כ-30 דקות לפני השלמת הסיבוב בן ארבע השעות. חבר את המחט לפירסר הצינור והצמד את העט לצג הקרינה המקוון של הספיגה. הפעל את הכוח עבור צג הספיגה כדי לאפשר להגיע לקו בסיס יציב לפני ניתוח הדגימות.
ניתן להשיג בקלות רכישה אלקטרונית של פרופיל PolyZone בזמן אמת על ידי חיבור יחידת קליטת נתונים DI 1 48 U. למקליט התרשים, מלאו את משאבת המזרק ב-50 מיליליטר אגוזי פלורין באמצעות ההגדרה המהירה של זרימה הפוכה. ודא שאין בועות אוויר.
חבר את הצינור מהמזרק לפירסר הצינור. והפעל לזמן קצר את זרימת האינרטיות של פלו בשישה מיליליטר לדקה בכיוון קדימה. כדי לנקות את הצינור מבועות אוויר, הנח סדרה של צינורות מתחת לצינור בקצה תא הזרימה כדי לאסוף נגר דגימה.
הכן דלי קרח עם באר מוכנה מראש להחזקת צינור הצנטריפוגה המכיל את שיפוע הסוכרוז. לאחר השלמת הצנטריפוגה של ארבע שעות, הסר בזהירות את צינורות הצנטריפוגה מרוטור הצנטריפוגה והניח אותם על קרח. הקפד להימנע מהפרעה לשיפועים.
כדי לנתח תמציות תאים, הנח את צינור השיפוע על פירסר הצינור וחבר את החלק העליון של הצינור לשקע ואבטח. הרם את השלב התחתון לצינור הצנטריפוגה כך שהמחט חודרת את תחתית הצינור. התחל את זרימת ההתראה של פלורין בכיוון קדימה בשישה מיליליטר לדקה.
לאחר שהחליל החל לזרום לתוך הצינור, עקוב אחר תנועת המחט בצג ספיגת ה-UV המקוון. ברגע שהמחט מתחילה לנוע, הפעל את תנועת התרשים להגדרת מהירות של 60. כאשר הושג סוף פרופיל הפולי ריבוזום, כבה את זרימת ה-Flo האינרטי לצינור הצנטריפוגה ועצור את תנועת התרשים בצג הקרינה של הספיגה.
החזר את ה-Flo האינרטי מצינור הצנטריפוגה לתוך המזרק על ידי התחלת הזרימה בכיוון ההפוך בקצב מהיר, תוך הקפדה לא לשאוב סוכרוז מהצינור לתוך המזרק. נתק את צינור הצנטריפוגה מפירסר הצינור, הורד את המחט והסר את הצינור. עקבות מייצגים של תמצית ריבוזום שהוכנה משמרים בנוכחות ציקלו היידה מוצג כאן.
מסומנים שיאי ספיגת UV המכילים פוליריבוזומים וריבוזומים A TS 60 s ו-40 s. זה עתה הראינו לך כיצד לבצע ניתוח פולי ריבוזום בעת ביצוע הליך זה. חשוב לזכור לעבוד במהירות, לשמור על דגימות קרות וללא RNA.
אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול למיצוי ריבוזומים מתרגמים מתאי אוקריוטים, המאפשר ניתוח של אוכלוסיות ריבוזומליות שונות. השיטה כוללת הפרדה של ריבוזומים למונוסומים ופוליריבוזומים באמצעות פרקציונציה במעגלי סוכרוז, דבר החיוני לחקר הבקרה על התרגום.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- גנטיקה
רקע
- הבנת תפקוד הריבוסום היא קריטית לחקר סינתזת חלבונים.
- פרופיל פוליריבוסומים מספק תובנות לגבי בקרה על התרגום.
- טכניקות להוצאת ריבוסומים הן בסיסיות במחקר ביולוגיה מולקולרית.
- גורמים סביבתיים ומוטציות יכולים לשנות את סינתזת החלבונים.
מטרת המחקר
- להפרדה ולהשוואה של פראקציות של מונו- ופוליריבוזומים מליזאטים של תאים.
- לוויזואליזציה של אוכלוסיות ריבוזומליות שונות באמצעות מעקב UV.
- לניתוח שינויים בתרגום תחת תנאים ניסיוניים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול תאי איקריוטים והכנת ליזאטים של תאים.
- צנטריפוגה דרך מדרג סוכרוז.
- פרקציונציה של המדרג לבידוד אוכלוסיות ריבוזומליות.
- ויזואליזציה של פרופילים ריבוזומליים באמצעות ניטור בליעה של UV.
תוצאות עיקריות
- הפרדה מוצלחת של מונוסומים ופוליריבוזומים.
- ויזואליזציה ברורה של אוכלוסיות ריבוזומליות באמצעות מעקב UV.
- ניתוח של בקרה על התרגום בתנאים שונים.
- תובנות לגבי השפעת מוטציות על סינתזת חלבונים.
מסקנות
- הפרוטוקול מהווה תקן זהב לחקר ויסות התרגום.
- הוא מאפשר לחוקרים לנתח ביעילות את הדינמיקה הריבוסומלית.
- הממצאים תורמים להבנת המנגנונים המולקולריים של התרגום.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח פרופיל פוליריבוסומים מאפשר לצוותי ביו-פרמה לחקור מנגנוני בקרה תרגומית ולזהות פגמים בסינתזת חלבונים בנקודות הכרעה קריטיות בשלב הגילוי. שיטה זו מספקת תובנה כמותית לגבי תרגום גלובלי ותרגום ספציפי לטרנסקריפט, ובכך תומכת בביטחון ניבוי באישור מטרות (target validation) ובהפחתת סיכונים מכניסטיים. יכולתה להסתגל למערכות אוקריוטיות שונות מבטיחה רלוונטיות רחבה עבור תיקי פיתוח בשלבי מו"פ מוקדמים ומחקר תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה ישירה של בקרה תרגומית תחת הפרעות גנטיות או סביבתיות.
- תומך בהסרת סיכונים מנגנונית על ידי הבחנה בין פגמים בשלב הפתיחה לבין פגמים בשלבי ההארכה או הסיום.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות כימות שינויים ביחסים בין פוליריבוסומים למונוסומים.
- מספק פלטפורמה להערכת ההשפעה של התערבויות מועמדות על סינתזת חלבונים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק קריאות כמותיות ומאומתות של מעורבות ריבוסומלית לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר פרקציונציה הדירה וזיהוי מבוסס UV של אוכלוסיות ריבוסומליות.
- מכין תמריות ביולוגיות המתאימות לתהליכי עבודה של ניתוח mRNA או חלבונים בשלבים הבאים.
- תומך בסריקה של תרכובים המווסתים את מנגנון התרגום או מסלולים רגולטוריים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את גילוי הסמנים הביולוגיים התרגומיים לתובנות מכניסטיות על ויסות סינתזת חלבונים.
- מבטיחה רצף ממודלים תאיים למערכות פרה-קליניות על ידי התאמת פרוטוקולים בין מינים אוקריוטיים.
- מספקת מידע לקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי חשיפת פגמים תרגומיים הקשורים למודלים של מחלות.
- מספקת הקשר מכניסטי לפנוטיפים שנצפו במחקרים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורי עיבוד
פרופיל פוליריבוזומים (Polyribosome profiling) משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-השערות של התרגום, ובכך תומך הן בתיקוף המטרה (target validation) והן בזיהוי מובילים (lead identification).
- ביולוגיית גילוי: מכמת את התוצר התרגומי ומבהיר מנגנוני בקרה ספציפיים למסלול.
- סריקה: מציעה הפרדה כמותית חסונה ותוצרי בליעת UV לצורך מוכנות לבדיקה.
- אנליטיקה: מספקת מדידה כמותית בזמן אמת של אוכלוסיות ריבוזומליות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מודלים תאיים ופרה-קליניים על ידי מתן אפשרות להתאמת פרוטוקולים וסנכרון ביומארקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית למחקרים תרגומיים ומכניסטיים מגוונים בתוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי בקרה תרגומית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה של מיצוי, פרקציונציה וזיהוי לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי חשיפת צווארי בקבוק תרגומיים ותמיכה במיון יעיל של תיק הפיתוח מבחינת הון.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף של מטרות ומודלים מותאם סיכון על בסיס נאמנות תרגומית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של ריבוזומים ובטכניקות של פרקציונציה במדרג ריכוזים (gradient fractionation).
- מחייב גישה למכשירים לאולטרה-צנטריפוגה ולמדידת בליעה ב-UV.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להשגת תוצאות הדירות.
- ניתן להתאמה למערכות של שמרים ויונקים עם שינויים בפרוטוקול לפי הצורך.
- שלמות הדגימה ותנאים נקיים מ-RNase הם קריטיים לקבלת תוצאות מהימנות.
