האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח
15 ביוני 2010
מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת תרגום הריבוזומים של התאים האיקריוטים. לאחר שחולצו, ריבוזומים מופרדים monosomes ו polyribosomes על ידי חלוקה סוכרוז הדרגתי כדי לאפשר לאוכלוסיות שונות ריבוזומלי להיות מנותח. ככזה, שיטה זו היא תקן הזהב לבחינת הרגולציה של התרגום.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להפריד ולהשוות בין פракציות המונו-סומים (mono zone) והפולי-ריבוסומים מליזאטים של תאים. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול התאים הרלוונטיים. השלב השני של ההליך הוא הכנת הליזאט התאי.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא סבוב של הליזאט במערך של גרדיאנט סוכרוז. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא פרקציונציה של הגרדיאנט והדמיה של אוכלוסיות הריבוזומים השונות באמצעות מעקב UV. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות שינויים בתרגום תחת תנאים ניסויים שונים באמצעות ניתוח פרופיל פוליריבוזומים.
שלום, אני אנתוני אספוזיטו מהמעבדה של ד"ר טרי גוסי קינזי במחלקה לגנטיקה מולקולרית, מיקרוביולוגיה ואימונולוגיה ב-UMD ובבית הספר לרפואה J Robert Wood Johnson. ואני מרקוס לואיס, גם אני ממעבדת מקקינזי כאן ב-R-W-J-M-S.
היום נדגים לכם פרוצדורה לניתוח פוליריבוסומים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור שינויים בסנתזת חלבונים הנובעים ממוטציות או מגורמים סביבתיים. אז בואו נתחיל. סוכרוז.
יש להכין את המעברים (גרדיאנטים) יום אחד לפני השימוש כדי לאפשר להם להפוך לרציפים. ערבבו נפחים מתאימים של תמיסות סטוק של סוכרוז בריכוזים של 7% ו-47% כדי להכין 48 מיליליטר של כל אחד מהריכוזים הבאים של סוכרוז: 7%, 17%, 27%, 37% ו-47%. הוסיפו DTT בריכוז של one molar לכל תמיסת סוכרוז עד לריכוז סופי של one millimolar. כדי למזוג את המעברים, חברו פיפטת פסטה למזרק של 20 מיליליטר על ידי קיבוע ואיטום עם para film.
הוסיפו שבעה מיליליטרים של 7% sucrose לתחתית של מבחנת צנטריפוגה מסוג poly amer ultra בגודל שומן של 1 אינץ' על 3.5 אינץ'. לאחר מכן, הוסיפו שבעה מיליליטרים של תמיסת 17% sucrose מתחת לתמיסת ה-7% על ידי הנחת קצה הפיפטה קרוב לתחתית המבחנה והזרקה איטית של הנוזל. מזיגת כל שכבה צריכה להיארך לא פחות מ-20 שניות.
חזור על הפעולה עם שבעה מיליליטרים של תמיסות סוכרוז בריכוזים של 27%, 37% ו-47%, לאחר שהמדרג נוצר. עליך להבחין בקווי הפרדה ברורים בין השכבות, המעידים על כך שהתרחש ערבוב מינימלי. אחסן את כל המדרגים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך הלילה, יחד עם הרוטורים, הבקבוקים והמבחנות שישמשו לאיסוף הדגימות.
להכנת תמריות מתאי שמרים, התחילו בגידול של 25 מיליליטרים של תרבית שמרים עד ל-OD 600 של 0.8 עד 1. הוסיפו cyclo heide לתרבית עד לריכוז סופי של 100 micrograms per milliliter והמשיכו בערבול בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, שפכו את התרבית לבקבוק צנטריפוגה של 250 מיליליטר ומלאו בקרח.
שמרו את כל הרכיבים על קרח מעתה ואילך; צנטריפוגו ב-8,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. השביו (resuspend) את המשקע ב-10 mL של באפר ליזיס קר, והעבירו למבחנות פוליפרופילן של 15 mL. צנטריפוגו ב-5,900 ×g למשך שלוש דקות ב-4 °C. השביו.
שעלקו את המשקע ב-0.5 milliliters של תמיסת ליזיס. העבירו את התמיה למבחנה של micro fuge בנפח 1.5 milliliter והוסיפו 0.5 milliliters של גלס-בידס (חרוזי זכוכית) שטופים בחומצה ומקולקרים. ערבבו את התאים במכשיר vortex בארבעה פרקי זמן של 32 שניות, תוך הנחת המבחנה על קרח למשך 30 שניות בין כל פרק זמן.
לאחר מכן, הוסיפו 0.5 milliliters נוספים של lysis buffer אל מבחנת הצנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter, וסובבו ב-5,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. העבירו את העל-נוזל (supernatant) למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה בנפח 1.5 milliliter וסובבו במהירות מקסימלית למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.
לבסוף, העבירו את supernatant לפרוביקט מיקרו-צנטריפוגה חד בנפח 1.5 milliliter. ניתן לשמור את התמצית בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד להעברת ה-lysate למדרג הסוכרוז. הניחו את קצה הפיפטה כנגד דופן הפרוביקט בקרבת פני השטח של המדרג, והניחו בעדינות את ה-lysate על גבי המדרג.
עבור מדרג של 35 milliliter, טוענים בדרך כלל 500 microliters של ליזט. באמצעות פינצטה, הורד בזהירות את המדרג לתוך הסל של רוטור מסוג swinging bucket. סבב את המדרגים בצנטריפוגה ב-100,000 ×g למשך ארבע שעות בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius.
בקירוב 30 דקות לפני סיום הסבוב בן ארבע השעות. חברו את המחט למחורר הפקקים וחברו את העט למסך ניטור הפלואורסצנציה והבליעה המקוון. הדליקו את אספקת הכוח של מסך הבליעה כדי לאפשר הגעה לקו בסיס יציב לפני ניתוח הדגימות.
ניתן להשיג בקלות רכישה אלקטרונית של פרופיל ה-PolyZone בזמן אמת על ידי חיבור יחידת רכישת נתונים DI 1 48 U. עבור רשם התרשימים, מלא את משאבת המזרק ב-50 milliliters של florin nuts באמצעות הגדרת זרימה חוזרת מהירה. ודא שאין בועות אוויר.
חברו את הצינור מהמזרק למנקב הפרובטות (tube piercer). הפעילו לזמן קצר את זרימת ה-Flo inert בקצב של 6 mL לדקה בכיוון קדימה. כדי להוציא בועות אוויר מהצינור, הניחו סדרה של מבחנות תחת הצינור בקצה תא הזרימה כדי לאסוף את נוזל הניקוז של הדגימה.
הכינו דלי קרח עם שקע מוכן להצבת מבחנת הצנטריפוגה המכילה את מדרג הסוכרוז. עם סיום הסבב בצנטריפוגה שנמשך ארבע שעות, הוציאו בזהירות את מבחנות הצנטריפוגה מהרוטור והניחו אותן על קרח, תוך הקפדה לא להפר את המדרגים.
כדי לנתח תמריות תאים, הניחו את מבחנת המעבר (gradient tube) על מחורר המבחנות, חברו את חלקו העליון של המבחנה ליציאה והדקו אותה. הרימו את הבמה התחתונה עד למבחנת הצנטריפוגה כך שהמחט תחורר את תחתית המבחנה. התחילו את זרימת ה-Florin alert בכיוון קדימה בקצב של שש milliliters per minute.
ברגע שהנוזל החל לזרום לתוך המבחנה, עקוב אחר תנועת המחט במונה בליעת ה-UV המקוון. ברגע שהמחט מתחילה לנוע, הפעל את תנועת התרשים להגדרת מהירות של 60. כאשר הגעת לסוף פרופיל הפוליריבוסומים, הפסק את זרימת ה-Flo inert למבחנת הצנטריפוגה ועצור את תנועת התרשים במונה פלואורסצנציית הבליעה.
שאבו את ה-Flo inert מתוך מבחנת הצנטריפוגה חזרה אל המזרק על ידי הפעלת הזרימה בכיוון הפוך בקצב מהיר, תוך הקפדה לא לשאוב סוכרוז מהמבחנה אל המזרק. שחררו את מבחנת הצנטריפוגה מהמנקב למבחנות (tube piercer), הורידו את המחט והוציאו את המבחנה. כאן מוצג גרף מייצג של תמצית ריבוזומים שהוכנה משמרים בנוכחות cyclo heide.
מסומנים שיאי בליעה ב-UV המכילים פוליריבוסומים וריבוסומים של 60 s ו-40 s. הרגע הדגמנו כיצד לבצע ניתוח פוליריבוסומים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד במהירות, לשמור על הדגימות קרות ולמנוע זיהום של ה-RNAs.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול למיצוי ריבוזומים מתרגמים מתאי אוקריוטים, המאפשר ניתוח של אוכלוסיות ריבוזומליות שונות. השיטה כוללת הפרדה של ריבוזומים למונוסומים ופוליריבוזומים באמצעות פרקציונציה במעגלי סוכרוז, דבר החיוני לחקר הבקרה על התרגום.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- גנטיקה
רקע
- הבנת תפקוד הריבוסום היא קריטית לחקר סינתזת חלבונים.
- פרופיל פוליריבוסומים מספק תובנות לגבי בקרה על התרגום.
- טכניקות להוצאת ריבוסומים הן בסיסיות במחקר ביולוגיה מולקולרית.
- גורמים סביבתיים ומוטציות יכולים לשנות את סינתזת החלבונים.
מטרת המחקר
- להפרדה ולהשוואה של פראקציות של מונו- ופוליריבוזומים מליזאטים של תאים.
- לוויזואליזציה של אוכלוסיות ריבוזומליות שונות באמצעות מעקב UV.
- לניתוח שינויים בתרגום תחת תנאים ניסיוניים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול תאי איקריוטים והכנת ליזאטים של תאים.
- צנטריפוגה דרך מדרג סוכרוז.
- פרקציונציה של המדרג לבידוד אוכלוסיות ריבוזומליות.
- ויזואליזציה של פרופילים ריבוזומליים באמצעות ניטור בליעה של UV.
תוצאות עיקריות
- הפרדה מוצלחת של מונוסומים ופוליריבוזומים.
- ויזואליזציה ברורה של אוכלוסיות ריבוזומליות באמצעות מעקב UV.
- ניתוח של בקרה על התרגום בתנאים שונים.
- תובנות לגבי השפעת מוטציות על סינתזת חלבונים.
מסקנות
- הפרוטוקול מהווה תקן זהב לחקר ויסות התרגום.
- הוא מאפשר לחוקרים לנתח ביעילות את הדינמיקה הריבוסומלית.
- הממצאים תורמים להבנת המנגנונים המולקולריים של התרגום.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח פרופיל פוליריבוסומים מאפשר לצוותי ביו-פרמה לחקור מנגנוני בקרה תרגומית ולזהות פגמים בסינתזת חלבונים בנקודות הכרעה קריטיות בשלב הגילוי. שיטה זו מספקת תובנה כמותית לגבי תרגום גלובלי ותרגום ספציפי לטרנסקריפט, ובכך תומכת בביטחון ניבוי באישור מטרות (target validation) ובהפחתת סיכונים מכניסטיים. יכולתה להסתגל למערכות אוקריוטיות שונות מבטיחה רלוונטיות רחבה עבור תיקי פיתוח בשלבי מו"פ מוקדמים ומחקר תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה ישירה של בקרה תרגומית תחת הפרעות גנטיות או סביבתיות.
- תומך בהסרת סיכונים מנגנונית על ידי הבחנה בין פגמים בשלב הפתיחה לבין פגמים בשלבי ההארכה או הסיום.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות כימות שינויים ביחסים בין פוליריבוסומים למונוסומים.
- מספק פלטפורמה להערכת ההשפעה של התערבויות מועמדות על סינתזת חלבונים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק קריאות כמותיות ומאומתות של מעורבות ריבוסומלית לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר פרקציונציה הדירה וזיהוי מבוסס UV של אוכלוסיות ריבוסומליות.
- מכין תמריות ביולוגיות המתאימות לתהליכי עבודה של ניתוח mRNA או חלבונים בשלבים הבאים.
- תומך בסריקה של תרכובים המווסתים את מנגנון התרגום או מסלולים רגולטוריים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את גילוי הסמנים הביולוגיים התרגומיים לתובנות מכניסטיות על ויסות סינתזת חלבונים.
- מבטיחה רצף ממודלים תאיים למערכות פרה-קליניות על ידי התאמת פרוטוקולים בין מינים אוקריוטיים.
- מספקת מידע לקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי חשיפת פגמים תרגומיים הקשורים למודלים של מחלות.
- מספקת הקשר מכניסטי לפנוטיפים שנצפו במחקרים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורי עיבוד
פרופיל פוליריבוזומים (Polyribosome profiling) משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-השערות של התרגום, ובכך תומך הן בתיקוף המטרה (target validation) והן בזיהוי מובילים (lead identification).
- ביולוגיית גילוי: מכמת את התוצר התרגומי ומבהיר מנגנוני בקרה ספציפיים למסלול.
- סריקה: מציעה הפרדה כמותית חסונה ותוצרי בליעת UV לצורך מוכנות לבדיקה.
- אנליטיקה: מספקת מדידה כמותית בזמן אמת של אוכלוסיות ריבוזומליות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מודלים תאיים ופרה-קליניים על ידי מתן אפשרות להתאמת פרוטוקולים וסנכרון ביומארקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית למחקרים תרגומיים ומכניסטיים מגוונים בתוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי בקרה תרגומית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה של מיצוי, פרקציונציה וזיהוי לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי חשיפת צווארי בקבוק תרגומיים ותמיכה במיון יעיל של תיק הפיתוח מבחינת הון.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף של מטרות ומודלים מותאם סיכון על בסיס נאמנות תרגומית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של ריבוזומים ובטכניקות של פרקציונציה במדרג ריכוזים (gradient fractionation).
- מחייב גישה למכשירים לאולטרה-צנטריפוגה ולמדידת בליעה ב-UV.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להשגת תוצאות הדירות.
- ניתן להתאמה למערכות של שמרים ויונקים עם שינויים בפרוטוקול לפי הצורך.
- שלמות הדגימה ותנאים נקיים מ-RNase הם קריטיים לקבלת תוצאות מהימנות.
