בידוד בתאי גזע רקמות השלד והשרירים Soft

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי גזע בוגרים מרקמות רכות של שרירים ושלד כגון שרירי השלד. זה מושג תחילה על ידי לקיחת ביופסיה של הרקמה הרכה, הסרת הכיסוי ממנה וקיצוץ דק. השלב השני של ההליך הוא עיכול אנזימטי של הרקמה.

השלב השלישי של ההליך הוא לבודד את תאי הגזע באמצעות שלבי ציפוי חוזרים ונשנים. השלב האחרון של ההליך הוא זיהוי תאי הגזע המבודדים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המציגות את ההתנהגויות המורפולוגיות והתאיות של התאים באמצעות אימונופלואורסצנטיות, מיקרוסקופיה ו/או ציטומטריית זרימה.

היי, אני לי מהמעבדה לפתולוגיה מולקולרית במחלקה לכירורגיה אורתופדית באוניברסיטת פיטסבורג. היום אראה לכם כיצד לבודד תא גזע בוגר מהרקמות הרכות של מערכת השלד של מוס כמו שריר השלד. שלום, אני ד"ר ג'וני וורד.

אני פרופסור בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת פיטסבורג במחלקה לכירורגיה אורתופדית. עבדתי, אתה יודע, בשיתוף פעולה הדוק עם ד"ר יאנג לי וההליכים האלה כדי לבודד, אתה יודע, סוגים שונים של תאי גזע משרירי השלד ולשנות רקמות כמו סטנדרטיות. אנו משתמשים בהליכים במעבדה שלנו כדי לבודד תאי גזע למחקר בסיסי על יישומי הרפואה התרגומית.

אז בואו נלמד. תן לרקמות שמהן ניתן לבודד תאי גזע לכלול גידים ושרירי שלד שנקטפו משרירי השוקה או הסוליה של הגפה האחורית של עכברים מסוג בר. לאחר הסרת שאריות עור ועצמות, הניחו טישו בכלי המכיל HBSS קר בתוספת 5% FBS.

לאחר מכן, הניחו את הטישו בנפרד על כלים מצופים קולגן המכילים HBSS קר. נשתמש ברקמות שריר השלד כדי להדגים את ההליכים הבסיסיים לדיסוציאציה ועיכול רקמות. השתמש במספריים מיקרו ו/או להבי אזמל כדי לטחון את רקמות השלד לעיכול אנזימטי pH גס של הרקמות.

התחל בהעברת תמיסות הרקמה של MIT לצינורות נפרדים של 15 מיליליטר בצנטריפוגה במהירות של כ-3,500 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הסר את שטיפת ה-SANE על ידי השעיית HBSS וחזור על הצנטריפוגה. לאחר הסרת הסופרנט, עכל את התמיסות על ידי הוספת 10 מיליליטר של קולגנאז חם מראש.0.2%.

סוג 11 דגירה במשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך ניעור הצינורות ביד כל 10 דקות בסיום הדגירה של 60 דקות. צנטריפוגה ולאחר מכן השעו מחדש את התמיסות ב-10 מיליליטר של תמיסת חלל DYS. דגירה במשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ניעור ביד כל 10 דקות לאחר צנטריפוגת הדגירה של 45 דקות והחייאת התמיסות ב-10 מיליליטר של 0.2% נסיעות בתמיסת HBSS.

בדרך כלל אנו דוגרים במשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך היפוך הצינורות כל 10 דקות, הדגירה הושלמה. כאשר מספיק תאים בודדים משתחררים מהרקמות, כפי שמוצג כאן, הצנטריפוגה, התאים המתקבלים וה-resus משהים את כדור התא בחמישה מיליליטר של התפשטות. PM בינוני מנתק את מתלה התא על ידי העברת התמצית דרך סדרה של מחטים פעמיים דרך מחט בגודל 18, לאחר מכן פעם אחת דרך מחט בגודל 23 ולבסוף פעם אחת דרך מחט מד 27.

לבסוף, העבירו את תמצית התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון כדי להתחיל בטכניקת ההכנה. צנטריפוגה תמצית התאים שזה עתה הוכנה ומשהה מחדש את הכדורים בשגשוג. צלחת בינונית חמישה מיליליטר מתערובת התאים על בקבוק T 25 מצופה קולגן ושווקו כ-PP אחד דגירה של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני לחה של 5% למשך שעתיים.

אחרי שעתיים. העבירו את התאים שאינם נצמדים לבקבוק T 25 חדש מצופה קולגן ושווקו כ-PP 2. הוסף חמישה מיליליטר PM לבקבוק ה-T 25 הקודם שכותרתו PP אחד.

מחזירים את שתי הצלוחיות לחממה למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, העבירו תאים שאינם נדבקים מ-PP 2 לבקבוק T 25 חדש מצופה קולגן ENC וסמנו אותו כ-PP 3. הוסף חמישה מיליליטר של מדיום התפשטות לבקבוק שכותרתו PP שתיים.

מחזירים את הצלוחיות לחממה. חזור על ההליך כל 24 שעות עד לאוכלוסייה PP שש. נוצרת אוכלוסיית תאי הגזע.

ששת תאי ה-PP המבודדים הם מעטים מאוד במספרם ויש לתחזק אותם במדיום התפשטות עשיר ב-FBS. זה השתנה מדי יום. למרות שרוב התאים בתרבית PP 6 ימותו במהלך שבוע עד שבועיים של תרבית.

אוכלוסייה גדולה ובריאה של PP 6 נוצרת בדרך כלל לאחר שבוע עד שבועיים נוספים של התרחבות. שמור גם על כל שאר קבוצות התאים המרחפים, אפשר להם להתרבות ובדוק אותם באופן קבוע באמצעות מיקרוסקופ הפוך. התאים הנצמדים המוקדמים שנצמדים לצלוחיות PP 1 ו-PP 2 הם בעיקר תאים פיברוטיים.

תאים הנצמדים לצלוחיות מצופות קולגן לאחר פרק זמן ארוך יותר תוך 48 עד 96 שעות. PP 3 ו-PP 4 הם בעיקר מיובלסטים. בעוד שתאי לוויין שריר נראים לעתים קרובות בעיקר ב-PP 5, תאי ה-prepl המאוחרים יותר 96 שעות או מאוחר יותר PP 6 נחשבים לתאי גזע בוגרים ונראים קטנים, עגולים ושקופים.

בתחילת בידודם, ניתן לאפיין אותם עוד יותר על ידי אימונוהיסטוכימיה לביטוי סמני תאי גזע כגון תאי גזע, אנטיגן 1 ו-CDC 34. זה עתה הראינו לכם כיצד לבודד תאי גזע ממסה שנייה של העכבר. כאשר מבצעים הליך זה, חשוב לזכור לשמור על סטרואידים במהלך כל ההליכים.

לאחר בידוד תא הגזע, הקפד לתרבית תאים אלה בצפיפות נמוכה כדי לשמור על מאפייני תאי הגזע של התאים. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה עם הניסיון שלך ואני מאחל לך בהצלחה לנסות להשתמש בזה בניסוי שלך.

תודה.