Name: Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-28T17:33:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: למדו פרוטוקול אימונופלואורסצנציה לזיהוי וכימות מוקדי γH2AX ברקמות עכברים. שיטה זו מאפשרת הערכת נזק DNA במודלים של מחלות ומדידת רגישות לקרינה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

התמיכה של המכון האוסטרלי גרעיני מדע והנדסה הוא הודה. TCK היה זכה בפרסים AINSE. המעבדה לרפואה epigenomic נתמכת הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (566,559). LM נתמך על ידי מלבורן מחקר (אוניברסיטת מלבורן) ו ביו הדמיה מלגות CRC משלים. התמיכה של מונש Micro Imaging (ד&quot;ר סטיבן קודי ואת היתר קרמייקל) היה שלא יסולא בפז עבור עבודה זו. MMT הוא אסיר תודה על הסיוע מומחה ועצות ד&quot;ר אולגה Sedelnikova מן המכונים הלאומיים לבריאות.

רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת הריאה, מוטבע בטמפרטורה תבניות חיתוך אופטימלי (אוקטובר) במתחם 4583, נותח (5 מיקרומטר) באמצעות CM לייקה 1950 cryostat ועלה על פולי-L-ליזין שקופיות. </li></ol> דגימות קפואות התקבלו ד&quot;ר סיימון רויס ​​במכון המחקר ילדים מרדוק. רקמת הריאה התקבל Balb מטופל / עכברים c ומ במודל של עכברים של מחלה כרונית בדרכי הנשימה אלרגית אשר מציגה תכונות רבות פתולוגית של אסטמה אדם 6. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים מכון המחקר לילדים מרדוק הדוגלת קוד האוסטרלי עיסוק לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה למטרות מדעיות. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים הורשו אוויר יבש בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li></ol> Immunofluorescence מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים תוקנו עם 2% (w / v) paraformaldehyde ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים היו equilibrated עם שתי שוטף ב PBS במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים טופלו אתנול 70% (מקוררת -20 ° C) למשך 20 דקות ואחריו שלושה שוטף ב PBS למשך 10 דקות כל אחד. </li></ol> בנקודה זו שקופיות עשוי להיות מאוחסן במיכלים אטומים על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים נשטפו שלוש פעמים עם PBS למשך 10 דקות כל אחד חסום אז עם 100μL מוכן טרי PBS המכיל BSA 8% PBS המכיל 0.5% Tween-20 ו - 0.1% Triton X-100 (PBS-TT) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר . Incubations כל בוצעו שוקת מכתים humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים נשטפו עם PBS-TT במשך 5 דקות ו המערכת הידרופובי היה מסומן סביב הרקמה עם עט פאפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ עודף היה מוטה לסירוגין 100μl העיקרי של נוגדן ארנבת polyclonal אנטי γH2AX (מדולל 1:500, ב BSA 1% PBS; Millipore), נוספה עבור כל מקטע הדגירה 2 שעות בטמפרטורת החדר. דגירה עם נוגדן ראשוני ניתן לבצע בן לילה ב -4 ° C. לקבלת ראיות נוספות, כי מוקדי γH2AX מייצגים DSBs, נוגדן ראשוני לזהות חלבון תיקון DSB עשוי לשמש גם. לדוגמה, שיתוף לוקליזציה של γH2AX phospho ו-ATM הוא שילוב נפוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים נשטפו פעמיים ב PBS-TT במשך 5 דקות כל מודגרות עם 100μl של נוגדנים משני (אלקסה פלואוריד 488 עיזים נגד ארנב IgG מדולל 1:500, ב BSA 1%; Invitrogen) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר בחושך . (נוגדן מדולל הוחזק בחושך לאורך ההליך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים נשטפו שלוש פעמים עם PBS-TT במשך 5 דקות כל מודגרות עם 0.5mg/mL RNAse במשך 30 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרעיני counterstaining ואת הרכבה בוצע בינוני Vectashield המכילות יודיד propidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות נחתמו עם לק ומאוחסנים בין לילה ° C בחושך לפני ניתוח בבית 4. </li></ol> מיקרוסקופית / ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ LSM510 Zeiss Meta Confocal שימש לרכוש תמונות באמצעות תקן ה-GFP (עבור γH2AX - Alexa פלואוריד 488 נגד ארנב עז IgG) ו PI (543 ננומטר) לייזרים. </li></ol> תמונות שנרכשו דפוס Z-סדרה עם גודל צעד של 0.5 מיקרומטר. במהלך הניתוח, מטוסים בודדים היו deconvoluted וערמה לייצר תמונה מוקרנת מרבי כדי לצמצם את החפיפה של מוקדים. השיטה של ​​יצירת הדימוי המוקרן המקסימלי לפני ספירת החלקיקים יש להשתמש רק בנסיבות בהן חלק דק (למשל 5μm) משמש והיכן מכתים הרקע הוא חסר משמעות. איפה הסעיפים עבה עם רקע משמעותי יש לנתח, ניתוח מורכב יותר כגון מונה אובייקט 3D כפי שתואר על ידי Bolte ו Cordelieres (2006) אמור לשמש 7. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Metamorph (התקנים מולקולריים, ארה&quot;ב) שימש ליצור הממוזגת (אדום וירוק) תמונות לכמת במספרים של מוקדים. </li></ol> למרות Metamorph ניתן לכמת במספרים מוקדים, בדרך כלל בעת שימוש בסעיפים רקמות מוקדים נספרות באופן ידני (על ידי העין) לדיוק רב יותר. סוגי תאים מסוימים של עניין ניתן לבחור עבור quantitation, עבור ריאות תאים למשל אפיתל. ניתן לעשות זאת על בסיס היסטולוגיה עם התייחסות בסעיפים haematoxylin ו eosin סדרתי מוכתם.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+residual+gamma-H2AX+foci+in+murine+skin+are+dose+responsive+and+predict+radiosensitivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo.</a> Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).</li>
<li>Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+as+a+biomarker+of+DNA+damage+induced+by+ionizing+radiation+in+human+peripheral+blood+lymphocytes+and+artificial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Space+Res%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin.</a> Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).</li>
<li>Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+airway+remodeling+in+acute%2C+subacute%2C+and+chronic+models+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).</li>
<li>Bolte, S. &amp, Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לצורך הפגנה זו השתמשנו רקמת הריאה עכבר Balb מטופל / עכברים c ומ במודל של עכברים של מחלה כרונית בדרכי הנשימה אלרגית. אנו ונרשמת הבדלים במספר מוקדים לכל תא עם ממוצע גבוה מעט יותר נצפתה בריאה פגום לעומת חלקים לא מטופלים. באופן ספציפי, quantitation הצביעו 6.5 מוקדים לכל תא / ו -9.4 לכל מוקדי / תא (ספירה ידנית של 20 תאים לכל קטע), ברקמות מטופל ורקמות אלרגית כרונית בדרכי הנשימה המחלה, בהתאמה. עם זאת, השימוש של סוכן DSB וישכנע, כי הנפטלין לדוגמא, אשר ידועה לגרום DSBs במודל עכבר ריאות, תנ...

<table><tbody><tr><td>אלבומין מסרום בקר (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA (1%) משמש לחסימת קישור לא ספציפי של נוגדנים. נוגדנים ראשוניים ומשניים מדוללים ב-BSA.</td></tr><tr><td>PBS (ללא Ca)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; ו-Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>תרכובת Optimal Cutting Temperature (OCT) 4583</td><td></td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>שקופיות פולי-ליזין</td><td>מנזל-גלזר</td><td>SF41296SP</td><td>מושך באופן אלקטרוסטטי חתכים של רקמה קפואה ומפחית את הצורך בציפויים ובדבקים נוספים.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ריאגנטים</td><td>Calbiochem</td><td>655205</td><td>Tween 20 (0.5%) הוא דטרגנט המשמש להחדרת חומרים לתאים (permeabilisation).</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ריאגנטים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 (0.1%) שימש להחדרת חומרים לתאים (permeabilisation).</td></tr><tr><td>פרהפורמאלדהיד</td><td>ריאגנטים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-&amp;#947;H2AX (נוגדן פוליקלונלי משפן)</td><td>נוגדן ראשוני</td><td>Upstate, Millipore</td><td>07-164</td><td>דילול של נוגדן ראשוני (1:500), ב-1% BSA.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>נוגדן משני</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>דילול של נוגדן משני (1:500), ב-1% BSA.</td></tr><tr><td>אתנול (70%)</td><td></td><td>.Thermo Fisher Scientific, Inc</td><td>BSPEL316</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>ריאגנטים</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield PI</td><td>ריאגנטים</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1300</td><td>תווך הרכבה מבוסס גליצרין המכיל פרופידיום יודיד (צבע גרעיני אדום). יש להשתמש בתווך זה עם עדשה מבוססת שמן התואמת את מקדם השבירה שלו.&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;הערה: צבע DNA הנפוץ בשימוש: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). ניתן להשתיו אך ורק עם מיקרוסקופים בעלי לייזר עירור מתאים.</td></tr><tr><td>עט Pap מיני</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>זכוכיות כיסוי (22x50 מ"מ)</td><td></td><td>מנזל-גלזר</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>צנצנת קופלין, זכוכית</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>אמבטית צביעה</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 510 Meta</td><td></td><td>מיקרוסקופ קונפוקאלי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קריוסטט CM Leica 1950</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>תוכנה לניתוח דימות</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitation של γh2ax מוקדים של דגימות רקמה

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

גדיל הדנ&quot;א הכפול הפסקות (DSBs) הם נגעים קטלני במיוחד genotoxic, כי יכול להיווצר גם על ידי תהליכים פנימיים (פיזיולוגי או פתולוגי) או על ידי גורמים חיצוניים, קרינה מייננת במיוחד ותרכובות radiomimetic. זירחון של הגרסה H2A היסטון, H2AX, על שאריות סרין-139, את מוטיב שמור ביותר SQEY בטרמינל C-, להרכיב γH2AX, היא תגובה מוקדמת הדנ&quot;א הכפול גדיל הפסקות<sup&gt; 1</sup&gt;. אירוע זה זירחון מתווכת על ידי phosphatidyl inosito-3-kinase (PI3K) משפחה של חלבונים, אטקסיה telangiectasia מוטציה (ATM), ה-DNA למקטע החלבון קינאז קטליטי ATM ו RAD3 הקשורות (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. בסך הכל, התוצאות DSB אינדוקציה היווצרות של בדידות גרעיני γH2AX מוקדים אשר ניתן לאתרם בקלות באמצעות מיקרוסקופ ונרשמת immunofluorescence<sup&gt; 2</sup&gt;. לאור רגישות וספציפיות ייחודי של סמן זה, ניתוח של γH2AX מוקדים הובילה למגוון רחב של יישומים במחקר ביו, במיוחד בתחום הביולוגיה והרפואה קרינה גרעינית. Quantitation של γH2AX מוקדים נחקר נרחב ביותר במערכות תרבית תאים בהקשר של קרינה מייננת הנגרמת DSBs. מלבד radiosensitivity הסלולר, מבחני מבוסס immunofluorescence יש גם שימש כדי להעריך את היעילות של קרינה שינוי תרכובות. בנוסף, γH2AX שימש כסמן מולקולריים כדי לבחון את היעילות של DSB וישכנע תרכובות שונות היא בישרה לאחרונה להיות כסמן חשוב של הזדקנות ומחלות, בעיקר סרטן<sup&gt; 3</sup&gt;. יתר על כן, immunofluorescence שיטות מבוססות הותאמו זיהוי חליפה quantitation של γH2AX מוקדים<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 4,5</sup&gt;. הנה, אנחנו מדגימים שיטה immunofluorescence טיפוסי עבור איתור quantitation של γH2AX מוקדים ברקמות העכבר.

Quantitation של גדיל הדנ&quot;א הכפול נשבר על בסיס γH2AX מוקדים הפך כלי רב ערך, במיוחד בביולוגיה קרינה, להערכת radiosensitivity רקמות ההשפעות של תרכובות קרינה שינוי. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

שברים דו-גדיליים ב-DNA‏ (DSBs) הם נגעים קטלניים וגנוטוקסיים במיוחד, שעלולים להיווצר באופן אנדוגני (פיזיולוגי או פתולוגי)...

שלום, שמי מישל טנג ממעבדות לרפואה אפיגנומית ואפיגנטיקה אנושית. המעבדות בראשותו של ד"ר טום קריאן, פרופסור חבר ב-ASAM Holster במכון לב וסוכרת בייקר IDI. היום אדגים בדיקת אימונופלורסצנציה של gamma H2AX in vivo לקביעת כמות הנזק ל-DNA ברקמות חולות.H2AX הוא וריאנט של היסטון, המהווה כ-2% עד 10% מסך כל היסטון H2A של יונקים, והוא עובר פוספורילציה מהירה בסרין 139 של תאי יונקים. בתגובה לנזק ל-DNA, הצורה המפוספורילת של H2AX ידועה גם כ-γH2AX, ונקבע כי קיים מתאם ישיר בין מספר השברים הדו-גדיליים לבין γH2AX. γH2AX הוא סמן מולקולרי רגיש, ונמצא כי הוא מהווה אינדיקטור מוקדם לשברים דו-גדיליים. לכן, זוהי טכניקה שימושית לזיהוי נזק ל-DNA.ניתן להדמיה של Gamma H2AX כמוקדים גרעיניים באתרי נזק ל-DNA תחת מיקרוסקופיה פלורסצנטית. לצורך ניסוי זה, אשתמש ברקמות ריאה של עכברים שהתקבלו מד"ר סיימון רויס (Simon Royce) ממכון המחקר לילדים מורדוק (Murdoch Children's Research Institute). אחקור נזקי DNA ברקמות ריאה ממודל עכברים של מחלת דרכי נשימה אלרגית כרונית, המראה רבים מהמאפיינים הפתולוגיים של אסתמה בבני אדם, כולל תגובתיות יתר של דרכי הנשימה, רמודלינג של דרכי הנשימה ודלקת בדרכי הנשימה.כעת נתחיל בניסוי. נתחיל בהקפאת הדגימות למינוס 20 מעלות צלזיוס על ידי הצבתן בקריוסטט למשך כ-20 דקות. כדי להבטיח טמפרטורת חיתוך אופטימלית של SROs, נעשה שימוש בשקופיות מיקרוסקופ כדי שמקטעי הרקמה לא יdetached מהשקופיות.במהלך צביעה אימונופלואורסצנטית, השתמש ב-OCT כדי להצמיד את הדגימות למסבב (chuck), הנח את המסבב על בלוק החיתוך וודא שהוא מחובר בבטחה. כוון את הקריוסטט לחיתוך של חיתוכי רקמה בעובי של five micrometer; התחל בחיתוך בזהירות תוך משיכת הדגימות אליך באמצעות מכחול. הנח את השקופית של המיקרוסקופ מעל החיתוכים, כך שהם ייצמדו למשטח הזכוכית. השאר את החיתוכים להתייבש בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי להבטיח שכל הלחות הוסרה לפני ההמשך.ראשית, אנו מקבעים את חתיכי הרקמה באמצעות 2% paraldehyde שהוכנה ב-PBS ללא סידן ומגנזיום למשך 20 דקות. שופכים את עודפי ה-paraldehyde ומניחים את השקופיות בתוך צנצנת Copeland לשתי שטיפות של 15 דקות ב-PBS כדי להחדיר את החומרים; לאחר שלב ההחדרה, הדגימות של קרומי התאים מטופלות ב-70% ethanol בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הדגימות נשטפות שלוש פעמים ב-PBS למשך 10 דקות בכל פעם.הסר כל אתר בנפרד כדי למנוע את התייבשותם של נתחי הרקמה. ספג עודפי PBS מהשקף ולאחר מכן חסום את הנתחים עם 8% BSA ב-PBS המכיל בין 0.1% ל-0.5% Triton X 100, המכונה גם P-B-S-T-T. השקפים יעברו דגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר, ולאחר הדגירה הדגימות יישטפו עם P-B-S-T-T למשך חמש דקות.משתמשים ב-PBS TT כדי להקל על חדירות הנוגדנים לגרעין. לאחר מכן, את השקופיות שוטפים ומייבשים כדי להסיר שאריות של P-B-S-T-T. מציירים עיגול מסביב לחתכים בעזרת עט pap כדי להפחית את כמות הריאגנטים שבהם משתמשים.נעשה שימוש בנוגדן ראשוני, נוגדן פוליקלונלי מהיר נגד phospho gamma H tox. הוכנה דילול של 1:500 ב-1% BSA ב-P-B-S-T-T. חתכים אלו הונחו בתא לחות והובאו לדגירה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.שפכו את הנוגדן הראשוני לפני ביצוע שתי שטיפות של חמש דקות ב-P-B-S-T-T להסרת עודפי נוגדן ראשוני. הוציאו את השקופיות וספגו את שאריות ה-P-B-S-T-T. נעשה שימוש בנוגדן שועי goat anti Reid IJJ מספר floor 4 88.נוסיף לדגימות מהילה של 1:500 של הנוגדן המשני, שהוכן ב-1%BSA ב-P-B-S-T-T. נדגור את החתכים למשך שעה אחת בתא לחות, נסיר את הנוגדן המשני ולאחר מכן נבצע שלושה שלבי שטיפה של חמש דקות בכל פעם ב-N-P-B-S-T-T כדי להסיר עודפי נוגדן משני.כסו את צנצנת קופלנד (Copeland jar) בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור לאורך כל שלב שטיפה. הוציאו את השקופיות וספגו עודפי P-B-S-T-T. הוספה של 0.5 milligrams per milliliter של RNAs A ב-PBS שימשה להפחתת כל צביעה ציטופלזמית.לאחר מכן מדגgersים מדגגרים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, שואבים את RNA A מהדגימות ושוטפים אותן קצרות ב-P-B-S-T-T כדי למנוע מהחתכים להתייבש. יש להשאיר את הדגימות עטופות בנייר אלומיניום לפני הוספת תמיסת הקיבוע (mounting medium).הסיר זכוכית כיסוי אחת בכל פעם וספג את עודפי ה-P-B-S-T-T. הוסף מעל כל נתח תווך קיבוע Vector Shield המכיל propidium iodide, צבע גרעיני אדום. לאחר מכן, הנח בעדינות זכוכית כיסוי תוך ניסיון למנוע כליאת בועות אוויר, וספג כל עודף של Vector Shield בעזרת נייר סופג.כעת יש להדביק את שולי זכוכית הכיסוי כדי לאטום את הדגימה ולמנוע התייבשות. לסיום, יש לאחסן את הדגימות במקום חשוך בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד לדרישה להדמיות במיקרוסקופ. לצורך רכישת תמונות דיגיטליות נעשה שימוש במיקרוסקופ פוקאלי Zeiss LSM 510 META עם עדשת שיקוע (immersion) של 63x, תוך שימוש בלייזר ארגון ולייזר הליום-ניאון באורך גל של 488 nm עבור Alexa Fluor 488 וב-543 nm עבור צבע Propidium Iodide.כל שדה כלל שמונה עד 15 חיתוכי Z אופטיים עם גודל צעד של 0.5 µm וזום חד-פעמי. התמונות מיוצאות כקבצי TIF בודדים ומנותחות באמצעות metamorph. תמונות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ Zeiss LSM 510 Meta הפוקאלי נפתחות בתוכנת metamorph לצורך ניתוח תמונות וספירה ראשונית בעין. תמונות פלואורסצנטיות שנרכשו כסדרת Z עוברות דקונבולוציה (deconvolution) וערמה כדי להפיק תמונה דו-ממדית באמצעות מסנני היטל מקסימלי (maximum projection filters).פעולה זו בוצעה כדי למזער את אובדנם של מוקדים בעוצמה נמוכה יותר. התמונות המקרינות המקסימליות הומרו לתמונה בינארית ומופעלים מסננים מורפולוגיים, כגון top hat, כדי להפחית את הרקע וכן לשפר את הרגישות של זיהוי המוקדים. תמונות propidium iodide תואמות נטענו ואז זוהו אזורים גרעיניים.אזורים אלו הודגשו על ידי שרטוט ידני של אזורים סביב הגרעינים כדי לספור את מספר המוקדים לכל שדה. האזורים הועברו לתמונות ה-top hat והוחלו מסנני סף אור (light threshold filters). סף החיתוך נבחר בקפידה באמצעות השוואה חזותית בהתאם למוקדים, וזאת כדי למנוע הכללה של רעשי רקע בתוך כל שדה.ניתוח מורפולוגי משולב באמצעות IMA שימש לספירת המוקדים. לחלופין, ניתן לבצע ספירה ידנית כדי להבטיח את מהימנות התוצאות. ובכך מסתיימ הפרוטוקול לצביעה אימונופלואורסצנטית in vivo לקביעת מידת הנזק ל-DNA ברקמות חולות.טכניקה זו מתאימה לגילוי נזקי DNA הנגרמים על ידי גירויים שונים. עם זאת, היא תהיה המתאימה ביותר להערכת תגובות לקרינה מייננת ורגישות לקרינה. וזהו זה.תודה שצפיתם.

quantitation-of-h2ax-foci-in-tissue-samples

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כימות של גדיל הדנ"א הכפול פסים באמצעות היווצרות γH2AX כסמן המולקולרית הפכה כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור כימות γH2AX מוקדים לאחר חשיפה לקרינה של תאים.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

ניתוח מיקרוסקופי של γH2AX מוקדים, אשר הטופס הבא זירחון של H2AX ב Ser-139 בתגובה פעמיים גדיל הדנ"א נשבר, הפך להיות כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן השתמשנו נוגדנים מונו מפוגל היסטון H3 ב ליזין 4 כסמן epigenetic של euchromatin פעיל לתעתוק, כדי להעריך את הפריסה המרחבית של היווצרות γH2AX קרינה הנגרמת בתוך הגרעין.

הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת המיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי כדי לזהות חלבונים ספציפיים של תגובת נזק לדנ"א הממוקמים באתרים של שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאים חד-גרעיניים אנושיים. החלבונים מזוהים על ידי נוגדנים ראשוניים ספציפיים, אשר בתורם נקשרים לנוגדנים משניים המתויגים בפלואורופור הפולטים פלואורסצנט במהלך הדמיה מיקרוסקופית, ומאפשרים הדמיה של החלבונים כמוקדים פלואורסצנטיים נפרדים בתוך גרעיני התא.

מיקרוסקופ אימונופלואורסנציה לניתוח שברים דו-גדיליים של DNA

הזדקנות תאית, המדינה ההפיכה של מעצר מחזור התא, יכולה להיגרם על ידי מדגיש הסלולר שונה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לגרום הזדקנות תאית שיטות להערכת סמנים של הזדקנות.

טכניקות כדי להשרות ולכמת סלולר הזדקנות

כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

השיטה המוצגת משלבת את הניתוח הכמותי של מעברי ה-DNA כפול סטרנד (DSBs), מחזור התא הפצה ו אפופטוזיס כדי לאפשר מחזור התא הערכה ספציפית של האינדוקציה DSBS ותיקון, כמו גם את ההשלכות של כשל בתיקון.

מחזור התא-מדידה ייחודית של γH2AX ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה Cyהמטריה

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

פרוטוקול זה מציג את הכנת השקופית ואת הניקוד האוטומטי של γ-H2AX foci בדיקה על לימפוציטים דם היקפיים. כדי להמחיש את השיטה והרגישות של ההסתה, לימפוציטים מבודדים היו מוקרן במבחנה. שיטה אוטומטית זו של זיהוי DNA DSB שימושית עבור יישומי dosimetry ביולוגיים מהירים ותפוקה גבוהה.

שיטת ניקוד מיקרוסקופית אוטומטית לבדיקת מוקדי γ-H2AX בלימפוציטים אנושיים היקפיים

פרוטוקול זה מציג שיטה להערכת היווצרות ותיקון של פריצות דו-גדילי DNA באמצעות זיהוי סימולטני של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בגרעינים בין-פאזיים של לימפוציטים היקפיים אנושיים שטופלו בבלומיצין.

אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ומהיר לזיהוי אינטראקציה של חלבונים באתרי נזק לדנ"א.

בדיקת ליגנד קרבה למיקום חלבונים באתרי נזק לדנ"א

למדו פרוטוקול אימונופלואורסצנציה לזיהוי וכימות מוקדי γH2AX ברקמות עכברים. שיטה זו מאפשרת הערכת נזק DNA במודלים של מחלות ומדידת רגישות לקרינה.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

גלה סרטונים נוספים