הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג'ין

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות מטרות גנומיות של KDM חמש א ג'ארד, RBB שני היסטון דמתילאז. זה מושג על ידי הכנת כרומטין צולב שעובר סוניקציה לייצור שברי DNA בגודל המתאים כשלב שני. שני מקטעי DNA קשורים של RBB משקעים חיסונית עם שני נוגדנים RBB.

לאחר מכן, ה-DNA הגנומי המשוחזר מוגבר על ידי PCR לריצוף. לבסוף, קריאות קצרות ברצף של Illumina מיושרות באופן ייחודי לגנום האנושי, ופסגות משמעותיות מזוהות ומוסרות לגנים הקרובים ביותר. על מנת לזהות rbbb, מתקבלות תוצאות של שני גני מטרה המראים פונקציות מולקולריות הקשורות ל-Rrb B, שני גני מטרה המבוססים על זיהוי גנומי של Rbbb, שני אזורים מועשרים.

היי, אני מייק. היא מהמעבדה של ד"ר אליזבת בנסיה במחלקה לביוכימיה וגנטיקה מולקולרית באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. ואני מהמעבדה לגנומיקה ביו-רפואית בהובלת ד"ר NGA באוניברסיטת פארק המחקר הביו-רפואי BARCEL PO P fea.

ואני דניאל דאל. ואני ויליאם ריכטר. שנינו גם נמצאים במעבדת מיומנויות הנדיבות.

היום אנו הולכים להראות לכם נוהל לכרומטין, משקעים חיסוניים וריצוף. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את אתר הקישור של רופא העור שלו. אז בואו נתחיל.

כדי להתחיל בהליך זה, גדל כ -10 עד התאים השמיניים. עבור כל משקעים חיסוניים או ip. כאן, לימפומה אוסטאוליטית מפושטת.

תאי U 9 37 משמשים ומושרים להתמיינות מונוציטית עם TPA למשך 96 שעות לאחר צמיחת התאים בתמיסת פורמלדהיד ישירות למדיה לריכוז סופי של 1%ואז סובב את הבקבוק לזמן קצר ואפשר להם לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן שאפו את המדיה ושטפו את התאים עם 15 מיליליטר PBS קר כקרח. חזור על שטיפה זו פעם אחת.

לאחר מכן, הוסף שישה מיליליטר של מאגר ליזה אחד לכל אחת מהצלוחיות על הקרח. לאחר מכן נדנד את הצלוחיות למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לבסוף, קצרו את התאים באמצעות מגרד תאים והעבירו אותם לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר.

בשלב זה, ניתן לאחסן את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס. אם התאים היו קפואים, הוציא אותם החוצה. לאחר ההפשרה, סובב את התאים כלפי מטה והשליך את החבטה.

לאחר מכן השעו מחדש את התאים בשישה מיליליטר של מאגר ליזה שני, נדנדו את הצינורות בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. חזור על הצנטריפוגה והשהה מחדש את התאים ב-2.5 מיליליטר של מאגר ליזה שלוש. לאחר מכן, הכינו את המתלה לסוניקציה על ידי הנחתו בכוס מים קפואים עם קצה המיקרו של ברנסון 450 סונייר מוגדר בין 50 ל-60% משרעת.

סוניקציה את התמיסה לפרץ קבוע 32 ולהתקרר על קרח. במשך דקה אחת, חזור על הפולסים הללו 10 עד 15 פעמים, ואז פיפטה את תוכן הצינור למעלה ולמטה והעביר אותם לצינור חדש. המשיכו לפעום ולקרר את התמיסה.

חמש פעמים נוספות לאחר סוניקציה, הוסף 10% Triton X 100 לעשירית מנפח הפתרון. לאחר מכן העבירו את הליזטים לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, וסובבו את הפסולת החוצה במיקרו צנטריפוגה לפני כרומטין, משקעים חיסוניים או שבב. שמור 50 מיקרוליטר של ליזאט התא כדגימת הקלט.

לאחר מכן שילבו את הליזאט של התא הנקי עם חרוזי דינה הקשורים לנוגדנים שהוכנו בעבר כמתואר בפרוטוקול הכתוב. נדנדו את התערובת בנוסף לדגימת הקלט של 50 מיקרוליטר בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. שוטפים את החרוזים עם מיליליטר אחד של מאגר כביסה.

לאחר מכן השתמש במעמד מגנטי כדי לאסוף את החרוזים ולהסיר את הסופרנטנט. חזור על שטיפה זו שש עד שמונה פעמים. בצע שטיפה אחרונה עם מיליליטר אחד של TE בתוספת 50 מילי-מולרי נתרן כלורי.

סובב את החרוזים במיקרו צנטריפוגה לאחר צנטריפוגה, שאב כל שאריות מאגר TE. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר אלו לדגימות. מיד לאחר מכן.

דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. גרד את הצינורות כנגד פקק צינור של 1.5 מיליליטר כל שתי דקות כדי לשמור על החרוזים בתלייה. אסוף את החרוזים באמצעות צנטריפוגה והמעמד המגנטי והעביר את ה-SNAT לצינור PCR.

לאחר מכן אחזר את דגימת הקלט שנשמרה בעבר והוסף שלושה נפחים של מאגר הפליטה. לבסוף, הנח את דגימות ה-IP והקלט לתוך המחזור התרמי למשך הלילה ב-65 מעלות צלזיוס. כדי להפוך את הקישורים הצולבים למחרת, הוסף נפח אחד של חוצץ TE לדגימות.

לאחר מכן הוסף RNA A לריכוז סופי של 0.2 מיקרוגרם למיקרוליטר. דגרו את הדגימות במחזור התרמי למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה יש להוסיף פרוטאינאז K לריכוז סופי של 0.2 מיקרוגרם למיקרוליטר.

לאחר מכן דגרו דגימות במחזור התרמי בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, חלץ את הדגימות פעם אחת עם נפח אחד של פנול. חלץ את הדגימות בפעם השנייה עם נפח אחד של אלכוהול איזואמיל פניל כלורופורם.

לבסוף חלץ את הדגימות פעם נוספת עם נפח אחד של אלכוהול איזואמיל כלורופורם. לאחר מכן הוסף 30 מיקרוגרם גליקוגן לכל דגימה. כמו כן, הוסף נתרן כלורי לריכוז סופי של 0.2 מולארי ושני נפחים של אתנול לדגימות.

דגרו אותם למשך 30 דקות במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, סובבו את הדגימות ושפכו את החבטה. שטפו את הכדורים עם 500 מיקרוליטר של אתנול 75%, ואז יבשו את הכדורים והשעו אותם מחדש ב-40 מיקרוליטר מים.

כדי לבדוק את הגדלים של שברי ה-DNA המיוצרים על ידי הליך הסוניקציה, טען חמישה מיקרוגרם של דגימת הקלט המטוהר בג'ל אגרו של 1.8% והפעל את הג'ל. הליך הסוניקציה אמור לייצר שברים בטווח של 150 עד 350 זוגות בסיסים. עם זאת, אם השברים אינם נופלים בטווח זה, יש להתאים את הליך הסוניקציה על ידי שינוי מספר ההתפרצויות והמשרעת לפני הגברת ה-DNA הגנומי.

בדוק את הגודל, הריכוז וההעשרה של הדגימות כמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להתחיל בהגברה של DNA גנומי, השג 34 מיקרוליטר מדגימת ה-IP ו-200 ננוגרם מדגימת הקלט. בצע ותקן הוספה וקשירה של מתאמים לשברי DNA באמצעות ערכת הכנת דגימת DNA גנומית של Illumina כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

טהר את ה-DNA באמצעות ערכת טיהור PCR מיני lut ולאחר מכן הוצא אותו במאגר EB שחם מראש ל-50 מעלות צלזיוס. השתמש ב-23 מיקרוליטר ו-46 מיקרוליטר עבור דגימות ה-IP וה-DNA הקלט בהתאמה. בצע את תגובת ה-PCR באמצעות 23 מיקרוליטר DNA עם מתאמים 25 מיקרוליטר היתוך, DNA פולימראז מהערכה.

מיקרוליטר אחד של 20 סוליה מיקרומולרית, PCR אחד ומיקרוליטר אחד של 20 מיקרומולר. אז PCR 2 מריץ את תגובת ה-PCR כמתואר בפרוטוקול הכתוב לאחר הגברת PCR. טהר את ה-DNA עם ערכת טיהור ה-PCR של Qiagen mini loop.

מחממים מראש 15 מיקרוליטר של מאגר EB ל-50 מעלות צלזיוס ומדללים את ה-DNA, מדללים 0.5 מיקרוליטר מהדגימה 1 עד 4 ומבצעים קריאת NanoDrop כדי לטהר את המוצרים המוגברים. הכינו ג'ל 1.8% AGROS של 50 מיליליטר באמצעות מים בדרגת HPLC הוסיפו TAE וברומיד לאחר שהאגרוס נמס. ואז שופכים את הג'ל, טוענים את הג'ל.

לאחר הוספת ארבעה מיקרוליטר של מאגר טעינה לדגימות הקלט וה-IP, הפעל את הג'ל ב-120 וולט למשך 45 דקות. נתח את הג'ל לאחר הפעלתו. הם אמורים לחשוף כי נוצרים שברים בטווח שבין 150 ל-350 זוגות בסיסים.

הם מייצגים מקטעי DNA גנומיים באורך של בין 50 ל-250 זוגות בסיסים. ומתאם מסיר את אזור הג'ל המכיל את החומר בטווח זוגות הבסיסים של 150 עד 350 בעזרת אזמל. הקפד להימנע מכריתת רצועת המתאם של המתאם, הפועלת בכ-120 זוגות בסיסים.

שחזר את ה-DNA באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מהירה של קיאק לפי הוראות היצרן. יבש את הדגימה ל-11 מיקרוליטר בדיוק במהירות חזרה ללא חום. הסר מיקרוליטר אחד מהדגימה ומדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop.

לבסוף, זהה תוצרי גנים מועשרים באמצעות מנתח הגנום של Illumina ונתח את אתרי הקישור וגני היעד כמתואר בפרוטוקול הכתוב. קואורדינטות גנומיות של חלבון קושר RB מועשר שזוהה שניים או RBP שני אזורי קשירה מוצגים בפורמט כרומוזומי. ניתן לדמיין תפוסות של גנים אנסמבל בכרומוזומים כ-VAR שחורים.

כאן מוצגים תפוסות כרומוזום 10 rbp שני אזורי קשירה מוצגים כקווים אנכיים. הפאנל האמצעי מציג את כל rbp שני אזורי קשירה איזופורמיים בכרומוזום 10, והפאנל התחתון מציג rbp שני אזורי קשירה איזופורמיים גדולים. מידע זה נותן סקירה כללית של תפוסה חופפת וספציפית של שני איזופורמים של RBP בכרומוזום 10.

כאן מוצגת מפת חום עם שיעור גילוי שגוי או FDR מתוקן משמעותית אונטולוגיה של גנים או קטגוריות תפקוד מולקולרי בין הגנים הקשורים ב-rbp. שני צבעים לכיוון אדום מצביעים על מובהקות סטטיסטית גבוהה. צהוב מציין מובהקות סטטיסטית נמוכה, ואפור מציין שאין מובהקות סטטיסטית.

ניתוח העשרה מראה את הפונקציות המולקולריות החופפות והאיזופורמיות הספציפיות של R, BP, שני גני מטרה. זה עתה הראינו לך כיצד לזהות אתרי קשירה של גורם שעתוק במהלך הליך זה. חשוב לייצר מקטעי DNA בטווח הגודל והתפוקה המתאימים.

ניתן להשיג זאת על ידי ביצוע ההנחיות שלנו במהלך שלב הסוניקציה. אז זהו. בהצלחה בניסויים שלך ותודה על הצפייה.