הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים
30 באוגוסט 2010
אנו מדגימים intraperitoneal הזרקה לתוך דג הזברה מבוגר. אנו משתמשים microsyringe 10 NanoFil μl נשלט על ידי בקר Micro4 ו UltraMicroPump III. הפגנה זו כוללת את השימוש במים קרים כחומר הרדמה.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להזריק תמיסה לחלל הפריטונאום של דג זברה בוגר. בדוגמה זו, נזריק גלוקוז במעבדה שלנו. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור הומיאוסטזיס של גלוקוז בדם.
דבר זה מושג תחילה על ידי שקילת הדג כדי לקבוע את כמות התמיסה להזרקה לכל גרם ממשקל הגוף. השלב השני של הפרוטוקול הוא הרדמת הדג באמצעות מים קרים. השלב השלישי של הפרוטוקול הוא העברת הדג לבמה של המיקרוסקופ וביצוע ההזרקה.
השלב הסופי של הפרוצדורה הוא החזרת הדג לאקווריום שלו לצורך התאוששות. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות שינויים בהומאוסטזיס של הגלוקוז באמצעות מדידת רמות הגלוקוז בדם. שלום, אני מרי קינקל מהמעבדה של ויקטוריה פרינס במחלקה לביולוגיה של אורגניזמים ואנטומיה באוניברסיטת שיקגו.
אני סטפני איימס, גם אני ממעבדת פרינס. היום נדגים לכם פרוצדורה להזרקה תוך-peritoneale (אינטraperitoneale) לדגי זהב בוגרים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את הבקרה על ההומאוסטזיס של הגלוקוז בדם.
אז בואו נתחיל. כדי להכין את הדגים להזרקה, התחילו בהעברת הדגים למכל נקי והשאירו אותם ללא מזון. השאירו את הדגים בצום למשך 24 שעות כדי לרוקן את תכולת הנורה המעיית, ולמשך 72 שעות כדי להוריד את רמות הגלוקוז בדם לרמות הבסיס.
הצפיפות המשמשת בפרוטוקול זה היא 10 עד 12 פרטים מאוכלוסייה מעורבת מינית. דגים לכל מיכל של תשעה ליטר עם שלוש שכבות של גולה, כאשר הגולות מבודדות את הביצים כדי שלא ייאכלו. יש להסיר ביצים ופסולת מדי יום באמצעות סינון (siphoning) של המיכל.
בשלב הבא, הכינו תמיסת מלח Cortland המכילה 124.1 millimolar sodium chloride, 5.1 millimolar potassium chloride, 2.9 millimolar sodium pyrophosphate, 1.9 millimolar magnesium sulfate heptahydrate, 1.4 millimolar calcium chloride dihydrate, 11.9 millimolar sodium bicarbonate, ארבעה גרם של polyvinyl pyrrolidone ו-1000 USP units של heparin, עד לנפח סופי של 100 milliliters באמצעות מים דה-יוניזים; סננו, סטריליזו ואחסנו בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, המיסו חמישה גרם של glucose ב-10 milliliters של תמיסת מלח Cortland. כדי להכין תמיסת glucose בריכוז של 0.5 mg/µL, סננו, סטריליזו ואחסנו בטמפרטורה של 4 °C.
לאחר מכן, הכין את שולחן הניתוח על ידי חיתוך ספוג רך לגובה של כ-20 millimeter בפניו השטוחות. בצע חיתוך בעומק של 10 עד 15 millimeter כדי להחזיק את הדג לצורך ההזרקה. הנח את הספוג בתוך Petri dish בנפח של 60 millimeter, והנח את ה-Petri dish עם הספוג בתוך מכסה של קופסת טיפים של פיפטה P 200.
בשלב הבא, הכינו את המיקרוסקופ על ידי כיסוי בסיס המיקרוסקופ בניילון נצמד ובנייר סופג לצורך הגנה. למקרה של שפיכה, הניחו את שולחן הניתוח מעל נייר הסופג. בצעו כיוון מוקד ראשוני על ידי התבוננות בשולחן הניתוח ומיקוד על הספוג.
הנח את האצבע על הספוג ומקד אותה כדי למזער התאמות מיקוד נוספות כאשר הדג יהיה על שולחן הניתוח. לאחר מכן, שקול את הדג על ידי מילוי של כית חמש מאות מיליליטר (500 milliliter) בערך עד לשליש מתוכנה במים ממתקני הדגים. העבר את הדג עם הרשת למשקל, ומשם לכלי עם מעט ככל האפשר מים עודפים, ורשום את המשקל. העבר כל דג שנשקל למכל שקוף ומסומן.
חשבו את נפח ההזרקה בהתבסס על המשקל. בדוגמה זו, נזריק תמיסה של 0.5 milligrams לגרם משקל גוף של גלוקוז המומס בתמיסת מלח Cortland. מכיוון שהתמיסה שלנו היא בריכוז של 0.5 milligrams ל-microliter, החישוב הוא פעם אחת משקל הדג בגרמים שווה לנפח להזרקה ב-microliters; הכינו את המזרק ואת ציוד ההזרקה הרלוונטי.
פרוטוקול זה משתמש במחט פלדה משופעת 30G 5, במשאבה אולטרה-מיקרו (ultra micro pump), ובמעבד micro four, ובמזרק מיקרו nano fill של 10 microliter להזרקת גלוקוז; מלאו את המזרק בגלוקוז בריכוז של 0.5 milligrams per microliter המומס בתמיסת מלח Cortland. חשוב להסיר את כל בועות האוויר מהמזרק, להתקין את המזרק על המשאבה האולטרה-מיקרו ותכננו את נפח ההזרקה עבור הדג הראשון על ידי הזנת הנפח בננוליטרים, באמצעות לוח המקשים המספרי של מעבד ה-micro four. לבסוף, הכינו את הרדמה הקרה על ידי ריסוק של מספיק קוביות קרח שהוכנו ממי מתקן הדגים.
כדי למלא דלי קרח, הניחו את שולחן הניתוחים בתוך מכל גדול יותר, כגון מכל אחסון מזון עשוי גומי בנפח 2.4 ליטר. שפכו מעט מי ברז חמימים לתוך המכל החיצוני ולתוך שולחן הניתוחים. החזיקו בסמיכות מיכל רזרבה של מי ברז חמימים.
חברו מדחום למכל החיצוני. הניחו את המכל החיצוני של חומר ההרדמה יחד עם שולחן הניתוח בסמיכות למיקרוסקופ. השאירו את דלי שבבי הקרח בקרבת מקום.
התחילו להוסיף שבבי קרח עד שטמפרטורת המים תגיע ל-17 °C. אין לרדת מ-17 °C בשלב זה. השתמשו ברשת כדי להעביר את הדגים למכל החיצוני.
בטמפרטורה של 17 מעלות או מעט פחות, הדג בדרך כלל יפרוש את סנפירי החזה אופקית, ינשום בכבדות ויבצע תנועות אוזניות מהירות. הוסיפו לאט שבבי קרח למכל כדי להוריד את הטמפרטורה ל-12 °C במהלך מספר דקות. ככל שהטמפרטורה תירד, הדג ישחה לאט יותר ובסופו של דבר יפסיק לשחות.
בסופו של דבר, הפהפוי ייפסק ותנועות הסנפירים יואטו. הדג מוכן להזרקה כאשר הוא אינו מגיב לטיפול בו. עם הגעה לטמפרטורה הנדרשת, לחצו על הספוג כדי להספיגו.
השאירו את אצבעותיכם במים הקרים מספיק זמן כדי שלא יחממו את הדג ויעילו אותו מההרדמה. בזמן הטיפול באצבעות קרות, העבירו בעדינות את הדג אל תעלת הספוג. מקמו את הדג כאשר הבטן פונה כלפי מעלה והזימים נמצאים בתעלה.
העבירו במהירות את שולחן הניתוח לבמה של המיקרוסקופ. תוך עבודה מהירה, מקמו בזהירות את המחט כך שהחוד פונה לכיוון הקרני얼 (cran) ונמצא קרוב יותר לחגורת האגן מאשר לפיגוס. הכניסו את המחט לקו האמצע שבין סנפירי האגן.
אתם אמורים להרגיש כאשר המחט מגיעה לעומק דופן הגוף. בעת החדרת המחט, ניתן להרגיש את השחרור של דופן הגוף. כאשר המחט חודרת לחלל הבטן, הזריקו את הנפח המתאים באמצעות המיקרו-פרוססור.
השתמשו בדוושה כדי להזריק 1 µL לכל גרם ממשקל גוף הדג; לאחר ההזרקה, הוציאו את המחט והעבירו מיד את הדג בחזרה למיכל המים החמימים להחלמה. שחררו את הדג מהספוג אל תוך מיכל המים ובדקו את המחט תחת המיקרוסקופ. לעיתים תהיה קשקשת דבוקה למחט, ויש להסירה לפני ההזרקה הבאה.
לאחר פרק זמן מתאים, המשיכו בבדיקה הבאה. מצאנו כי נדרש צום של 72 שעות כדי להוריד את רמות הגלוקוז בדם לרמת בסיס לפני ההזרקה. באיור זה, נתוני הביקורת ללא הזרקה המוצגים בירוק מראים ערכי גלוקוז בדם שאינם שונים באופן מובהק מביקורות שהוזרק להן vehicle המוצגות כאן באדום.
עם זאת, הקו הכחול מציג את ערכי הגלוקוז בדם עבור דגים שהוזרקה להם גלוקוז, ומציג את העלייה והירידה של הגלוקוז במחזור הדם. לאורך הזמן, הן החיות שהוזרקה להן גלוקוז והן אלו שהוזרק להן חומר פלסבו (vehicle) היו תחת הרדמה כירורגית במהלך הליך ההזרקה, בעוד שביקורות שלא הזרקו לא היו תחת הרדמה כירורגית. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע הזרקה תוך-peritoneal (intraperitoneal) לדגי זהב בוגרים.
במעבדה שלנו, אנו חוקרים שינויים בריכוז הגלוקוז בדם בנקודות זמן שונות לאחר הזרקה תוך-peritoneum (IP) של תמיסת גלוקוז. עם זאת, ניתן להשתמש בטכניקה שהדגמנו כעת כדי להזריק את התמיסה הרצויה עבורכם. בעת ביצוע הליך זה, זכרו להרדים את הדג באיטיות ולטפל בו בעדינות.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את הפרוצדורה להזרקה תוך-פריטונית בדגי זהב zebrafish בוגרים, תוך שימוש במיקרו-מזרק NanoFil והרדמה במי קרח. השיטה נועדה לבדיקת הומיאוסטזיס של גלוקוז בדם באמצעות הזרקות מדויקות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- פיזיולוגיה
רקע
- הזרקות תוך-פריטוניות הן חיוניות להחדרה ישירה של חומרים אל החלל הפריטוני.
- דגי Zebrafish מהווים אורגניזם מודל בעל ערך לחקר תהליכים מטבוליים.
- הבנת ויסות הגלוקוז בדם היא קריטית להשגת תובנות לגבי הפרעות מטבוליות.
- השימוש באלחלוש נחוץ כדי למזער את הלחץ במהלך הפרוצדורה.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה מהימנה להזרקה תוך-peritoneale (intraperitoneal) בדגי zebrafish.
- להקל על מחקר בנושא הומואוסטזיס של גלוקוז והבקרתו.
- לספק פרוטוקול שניתן לשחזר במעבדות אחרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת הדגים באמצעות צום ושקילה כדי לקבוע את נפח ההזרקה.
- הרדמת הדגים באמצעות מים קרים להבטחת תנועה מינימלית במהלך ההזרקה.
- הזרקת תמיסת גלוקוז לחלל הפריטונאום באמצעות מיקרו-מזרק מדויק.
- ניטור התאוששות הדגים לאחר ההזרקה להערכת השפעת הפרוצדורה.
תוצאות עיקריות
- הפרוצדורה מאפשרת בהצלחה הזרקה של חומרים לדגי זהב Zebrafish בוגרים.
- ניתן למדוד את רמות הגלוקוז בדם לאחר ההזרקה כדי לחקור שינויים מטבוליים.
- הדגים מחלימים היטב לאחר הפרוצדורה, מה שמעיד על יעילות ההרדמה ששימשה.
- התוצאות תורמות להבנה טובה יותר של הומיאוסטזיס של גלוקוז ב-Zebrafish.
מסקנות
- שיטה זו מהווה כלי בעל ערך עבור חוקרים הלומדים תהליכים מטבוליים בדגיג זאב (zebrafish).
- הזרקה תוך-פריטוניאלית היא טכניקה ישימה ואפקטיבית להגשת תמיסות.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על פרוטוקול זה כדי לחקור מצבים מטבוליים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
הגשה מדויקת של תרכובות בדגי זברה מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות מטבוליות על ידי ביסוס קשרי מינון-תגובה במערכת של בעלי חולbackbone. גישה זו תומכת בתיקוף המטרה באמצעות הפרעה מבוקרת של הומאוסטזיס הגלוקוז, ובכך מפחיתה עמימות בחקירת המסלולים. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת תוצאות פנוטיפיות כמותיות וניתנות לשחזור, הרלוונטיות למידול מחלות מטבוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מתן מינונים מוגדרים להערכת מעורבות המטרה (target engagement) במסלולי ויסות הגלוקוז.
- ערך תפעולי: מספק מתן תרכובות הניתן לשחזור כדי למזער שונות בהערכת הפנוטיפ המטבולי.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידה ישירה של שינויים ברמות הגלוקוז בדם כמדד תפקודי של מודולציה של מטרה מטבולית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדידות כמותיות של משתנים תלויים (רמות גלוקוז בדם), המאפשרות ניתוח תגובה למינון לצורך זיהוי מובילים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של נפח ההזרקה בהתבסס על משקל הדג, דבר המשפר את השחזוריות של הבדיקה בין סדרות ניסוייות.
- ערך מדעי: מקל על הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של סריקה מטבולית בהמשך.
מחקר תרגומי וקדם-קלני
- ערך מדעי: תואם למערכות רלוונטיות למחלה על ידי מידול הפרעה בהומאוסטזיס של הגלוקוז הרלוונטית לפתופיזיולוגיה של סוכרת.
- ערך תפעולי: מבטיח עקביות פרוצדורלית באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של צום, הרדמה והזרקה, ובכך תומך ביכולת שכפול בין מעבדות.
- ערך מדעי: מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד ההשפעה של התרכבים המוזרקים מעלייה ברמת הגלוקוז המושרה על ידי סטרס, באמצעות בקרות vehicle.
שילוב זרימת עבודה וpipeline
השיטה נשזרת ברצף התגליות, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של תרכיבי מוביל, על ידי אספקת נתיב מהימן למתן תרכובים בבדיקות מטבוליות בדגי zebrafish.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור נתיבים בבקרת גלוקוז על ידי מתן מדויק של תרכובות לדגי זהב בוגרים.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות נפחי הזרקה סטנדרטיים המבוססים על משקל, המבטיחים חשיפה עקבית לתרכובת.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של גלוקוז בדם המאפשרות השוואה של תגובות מטבוליות בין קבוצות טיפול.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות שימוש במודל של חולייתן עם מנגנוני הומאוסטזיס של גלוקוז שמורים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת לשימוש חוזר לסריקת פנוטיפ מטבולי על פני סדרות תרכובות ומחלקות מטרות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בניתוח מסלולים מטבוליים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה באמצעות נפחי הזרקה מוגדרים והליכי הרדמה מבוקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת נתוני תגובה-למינון ברורים על ויסות הומאוסטזיס של גלוקוז.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם-סיכון, בהתבסס על השפעות מטבוליות מתוקפות במערכת של אורגניזם שלם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בדגי זברה, הרדמה וטכניקות הזרקה באמצעות מיקרו-מזרק.
- תלוי בגישה למשאבות אולטרה-מיקרו, מזרקי NanoFil ומערכות הרדמה עם בקרת טמפרטורה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לגבי משך הצום, מדידת המשקל וחישוב נפח ההזרקה.
- כולל שיקולי התאמה למסיסויות שונות של תרכובות ונפחי הזרקה שונים בתוך תמיסת מלח Cortland המשמשת כנושא.
- מוגבל על ידי המיומנות הטכנית הנדרשת לשמירה על אוורור הזיקים ומניעת טראומה באתר ההזרקה במהלך ביצוע הפרוצדורה.
