Name: הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: למדו הזרקה תוך-בטנית בדגי זברה בוגרים לחקר הומאוסטזיס של גלוקוז בדם. השיטה משתמשת בהרדמה במים קרים ומיקרו-מזרק לדיוק מרבי במינון התרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך על ידי Juvenile Diabetes Research Foundation מענק 5-2007-97 (עד VEP), על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול כליות מענקים R01DK064973 (עד VEP), R01DK48494 (עד LHP), T32DK07074 (תמיכה SCE), K01DK083552 (כדי MDK), ועל ידי P60DK20595 לאוניברסיטת מחקר סוכרת שיקגו מרכז הדרכה. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של NIDDK או NIH.

1. טרום הזרקת תכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fast הדגים לפחות 24 שעות לפני הזריקה. זה יהיה לרוקן את המעיים (בטן) תוכן הנורה. פרוטוקול צום הבסיסי הוא להעביר את הדגים, בצפיפות הרגילה שלהם, כדי לנקות את הטנק, אז לחתול מזון. במשך הצום לטווח ארוך הדורש תנאים מחמירים יותר (למשל, ללימודי הגלוקוז בדם), ראה שיקולים נוספים בדיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון Cortland מלח (פרי et al. 1984). עבור נפח של 100 מ"ל, לפרק את הבאים מים מזוקקים: 725 מ"ג NaCl (124.1 mM) 38 מ"ג KCl (5.1 mM) 41 מ"ג Na 2 HPO 4 (2.9 mM) 24 מ"ג MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1.9 mM) 16 מ"ג CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1.4 mM) 100 מ"ג NaHCO 3 (11.9 mM) 4 גרם Polyvinylpyrrolidone (PVP) (4%) 1,000 יחידות הפרין USP סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המיקרוסקופ. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את בסיס מיקרוסקופ בניילון נצמד להגנה במקרה של נזילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים מגבת נייר על גבי עטיפת הפלסטיק. הטבלה כירורגית תשב על גבי מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להתאים להתמקד ידי הצגת הטבלה כירורגית התמקדות הספוג. </li></ul> טיפ: לשים את האצבע על החלק העליון של הספוג ולהתמקד זה. זה יהיה לבטל או לצמצם עוד יותר התאמת המוקד פעם הדגים על השולחן כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הדגים. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כוס 500 מ"ל כ 1 / 3 מלא עם מתקן מים ודגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרה את האיזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הדגים באמצעות הרשת. וויק עודפי המים מן הרשת ודגים על ידי לחיצה קצרה מספיגה נטו על מגבות נייר. מעבירים את הדג כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הדגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הדגים לאקווריום נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כל הדגים שקל למכל שלו שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את נפח הזרקה לדגים זה מבוסס על משקל הדגים. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המזרק וציוד הזרקת בנושא. עבור זריקה, אנו ממליצים מחט 35G פלדה משופעים ו microsyringe 10 NanoFil μl. הכן את המזרק NanoFil צינורות silflex הבאים הוראות היצרן. חשוב להסיר כל הבועות מן המזרק צינורות. לאחר מילוי במזרק צינורות, לעלות את המזרק על המשאבה, והתוכנית נפח הזרקה לדגים הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הטבלה כירורגית. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור ספוג רך (כגון # L800-D, Jaece תעשיות), כך הוא כ 20 מ"מ גובה. על פניו שטוח, לעשות חתך כי הוא 10-15 מ"מ עמוק. לחתוך זוהי שוקת כי תקיים את הדג להזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הספוג לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את צלחת פטרי עם ספוג לתוך מכסה מתאים בגודל קופסת פיפטה קצה. המכסה צריך להיות גדול מספיק כדי להכיל מים מנת לשמור על חום ספוג, אבל זה צריך להיות רדוד מספיק כדי לא להפריע. אנו משתמשים המכסה מהקופסה P200 טיפ כי הוא 11.4 ס"מ אורך x 7.7 ס"מ רוחב X 1.5 ס"מ ד </li></ul> שלושת הפריטים שנאספו יחד (ספוג בצלחת פטרי במכסה הקופסה) מהווים את שולחן הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההרדמה. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע באמצעות קוביות קרח מרוסק עשוי מתקן מים ודגים. </li></ul> טיפ: שימוש מגשי קוביית קרח טיפוסי, זה ייקח 3 מגשי להרדים 10-12 דגים. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים דלי קרח נקי עם קרח כתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השולחן כירורגית לתוך מיכל גדול כמו מיכל 2.4 ליטר Rubbermaid אחסון מזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מעט מים מתקן (חם) לתוך המיכל החיצוני ואת שולחן הניתוח. שמור מילואים של מתקן מים חמים בקרבת מקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מדחום לתוך המיכל החיצוני. </li></ul></li></ol> 2. , הזרקת הרדמה והתאוששות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המיכל החיצוני הרדמה כירורגית פלוס שולחן סמוך המיקרוסקופ. האם את הדלי של שבבי קרח הסמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביאו את טמפרטורת המים עד 17 ° C על ידי הוספת קוביות קרח. חשוב: אל תלך מתחת 17 ° C לצעד זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש נטו להעביר את הדגים למיכל החיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף קוביות קרח כדי המיכל להביא את הטמפרטורה עד 12 מעלות צלזיוס, במשך מספר דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התנהגות צג דגים: בגיל 17 מעלות צלזיוס או מעט נמוך יותר, בדרך כלל הדג יתפשט סנפירי החזה שלה אופקית, התנשפות, יש תנועות operculum מהירה. כאשר הטמפרטורה יורדת, דגים ישחו יותר לאט ולבסוף להפסיק לשחות. כאשר מטוס של הרדמה כירורגית הוא התקרב, מתנשם יפסיק ותנועות operculum יואט. הדג מוכן להזרקה כאשר הוא אינו מגיב מטופל. במשך רוב הדגים, 12 ° C היא מספיקה. דגים גדולים יותר עשויים לדרוש wa קרter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הטמפרטורה הנדרשת היא הגיעה (~ 12 ° C או קר), לחץ על הספוג כדי להרוות את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את האצבעות במים קרים דיים, כך שהם לא לחמם את הדגים ולהביא אותו מתוך הרדמה במהלך הטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אצבעות קרות, בעדינות להעביר את הדגים לשוקת של הספוג. מקם את הדג עם הבטן מעלה את הזימים בשוקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר במהירות את השולחן כירורגית לשלב מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במהירות, בזהירות להכניס את המחט לתוך קו האמצע בין סנפירי גחון. המחט צריכה נקודה cranially להיות מוכנס קרוב חגורת האגן מאשר בפי הטבעת. אתה אמור להיות מסוגל להרגיש כאשר המחט עמוק אל הקיר הגוף. להזריק את נפח המתאימה לשלוף את המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה, מיד להעביר את הדג בחזרה למים חמים שלה (~ 28.5 ° C) טנק להתאוששות ידי שחרור דגים מהספוג מעל המים טנק. עצה: אם הדג לא מתחיל מיד שחייה, לסייע לה להתאושש על ידי בעדינות מתערבלים המים לכיוון הזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המחט. מדי פעם בקנה מידה ניתן יהיה לעקל, ויש להסירם לפני הזריקה הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זריקות לאחר מכן, להשתמש במתקן מים חמים כדי להביא את טמפרטורת המים הרדמה בחדר האחורי עד 17 ° C לפני מציגה את הדג הבא. </li></ol> 3. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. התוצאות הבאות נציג intraperitoneal הזרקה של גלוקוז מ"ג / גרם 0.5 או רכב. דגים הם צמו במשך 72 שעות לפני הזריקה. ציר X מראה, שלאחר זמן ההזרקה. ממוצע ± SEM.

<ol><li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+SF+%22Fish+Physiology+Volume+X%3A+Gills%2C+Part+B%3A+Ion+and+Water%22">Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water</a>. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).</li>
<li>Brown, L. A. Anesthesia and restraint. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+LA+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 79-90 (1993).</li>
<li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li>
<li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li>
<li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (1995).</li>
<li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A. Anaesthetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIwama%2C+GK+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Fishes%2C+Volume+3%3A+Analytical+Techniques%22">Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques</a>. Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. , Elsevier. Amsterdam. 1-15 (1994).</li>
<li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li>
<li>Stoskopf, M. K. Surgery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoskopf%2C+MK+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 91-97 (1993).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הזרקת intraperitoneal כרוכה בחמישה שלבים: בצום, שקילה, הרדמה, זריקה, והתאוששות. לכל שלב יש את שיטות העבודה המומלצות שיכול להבטיח הצלחה. הצלחה כוללת החולה דגים בריאים, כמו גם תוצאות הניסוי טוב. צום: מהיר 24 שעות ביממה, צריך לרוקן את הנורה מעיים. נוהג זה נלקח מתוך הספרות דגים וטרינרי (למשל, בראון 1993). שיקולים נוספים הם בצום בהמשך. לטווח הארוך צום: מצאנו כי צום של 72 שעות נדרשת ירידה רמת הסוכר בדם לרמה הבסיסית לפני הזרקת (איימס et al, 2010).. מצאנו גם כי מחקרים גלוקוז יש מספר הליכים הנדרשים על מנת להבטיח כי דגים הם צמו כראוי. התחל עם טנק נקי (ללא פסולת על הקרקעית). טנקים צריך להיות מחובר, מסומן בבירור &quot;צום&quot;, וגם במקום שבו נלהב טיפול אנשי הדג לא להאכיל אותם. הערכת הסביבה החיצונית של הטנק לנקוט צעדים כדי למנוע את הדג מלהיות הדגיש מהפרעות, כמו מתח ידועה להעלות את רמת הסוכר בדם (צ&#39;אווין ו יאנג, 1970;. גרוף et al, 1999). לדוגמה, היה לנו ניסוי צום בו רדיו הופעל יומי על הספסל כי החזיק את הטנקים דגים. מצאנו כי הגלוקוז בדם היה גבוה במיוחד והגיע למסקנה כי הדגים היו לחוצים על ידי תנודות. גורם לחץ נוסף הוא הצפיפות. דגים יש לשמור על צפיפות העולה בקנה אחד עם נוהלי בעלי טוב דגים. לקבלת המלצות, לראות et al ברנד. (2002) ו Westerfield (1995). היו לנו תוצאות טובות צום הדגים שלנו בצפיפות של דגים באקווריום 10-12 9 ליטר (עם 3 שכבות של גולות תופס כמה נפח זה). הפרדת המינים עלולה לגרום ללחץ, לכן אנו ממליצים לשמור על אוכלוסייה מעורבת מין במהלך הצום. משמעות הדבר היא כי ניתן להניח ביצים, ואת הביצים צריך להיות מוחרם, כך שהם לא יהיו נאכלים. דרך פשוטה לעקל ביצים היא לכסות את תחתית המיכל עם 2-3 שכבות של גולות. איכות המים צריך להיות מתוחזק על ידי הוצאת ביצים פסולת על ידי החלפת 10-15% ממי האקווריום, מדי יום. להסרת ביצים פסולת, והעברתם עובד היטב. שקילה: כששוקלים דגים כי הם לא הרדים, יש להקפיד למזער העברת מים מן הרשת אל תוך הכוס, כדי להבטיח שקילה מדויקת. אם נטו (עם דגים) נמחקת על מגבות נייר, רוב המים העודפים ניתן להסיר, ואת משקל ניתן למדוד במדויק. זה יכול להיות קל יותר להרדים את הדג לפני שקילה, אבל אנחנו לא בחנו את ההשפעות האפשריות של הרדמה דג פעמיים ביום אחד. בדקנו את הטכניקה שלנו על ידי שקילת הדגים הראשון עם רשתות / סופג שיטה ואז שקילה מחדש את הדג לאחר שהוא מרדים, בעדינות מחק יבש. לא מצאנו הבדל משמעותי בין השיטות משקל (p = 0.7927, t-test). בנוסף, בדקנו אם זו הרשת / סופג הגלוקוז בדם מושפע השיטה, לעומת פשוט להעביר את הדגים כוס ברגע זה מרושת (לא סופג). לא מצאנו הבדל משמעותי ברמת הגלוקוז בדם בין שתי שיטות להעברת (p = 0.2241, t-test). הרדמה: הרדמה כימית מתאים מחקרים רבים. כאן יש לנו הפגינו הרדמה במים קרים כחלופה, כי הרדמה רבים (כולל tricaine/MS-222 (בראון, 1993)), להעלות את רמת הסוכר בדם. במחקרים קודמים, יש לנו מים קרים נקבע כי אין להעלות את רמת הסוכר בדם של דג הזברה (איימס et al. 2010). עבור הרדמה מים קרים, הטמפרטורה צריכה להיות ירד לאט. שיעור ירידה דומה תלוי בגודל של הדג, עם דגים קטנים הולך תחת מהר יותר מאשר דג גדול יותר. בעקבות הזרקה, ייתכן לצפות כי הדג הוא מחלים לאט מדי של חומר הרדמה (ראה להלן). זה יכול לגרום גם כאשר הטמפרטורה ההתחלתי הוא נמוך מדי, או כאשר הטמפרטורה יורדת מהר מדי. הטמפרטורה ההתחלתי הוא נמוך מדי אם מתכופף דגים רוחבית עם כניסתו למים. אם טמפרטורת המוצא היא נכונה, דגים יהיה לשמור על איזון שלה בתחילה. זה יהיה לסובב סנפירי החזה שלו למצב אופקי, התנשפות, יש תנועות operculum מהירה. בדרך כלל, זה יהיה לשחות. כאשר הטמפרטורה יורדת, תנועות יקטין ודגים יאבדו את שיווי המשקל. מטוס של הרדמה כירורגית הוא הגיע כאשר הדגים ניתן לטפל בלא להגיב. כדי לשמור על דגים תחת הרדמה כירורגית, האצבעות שלך חייב להיות קר, כדי לשמור אותם במים לפני הטיפול דגים. ספוג צריך גם להישמר בקירור בטמפרטורה זהה המים המשמשים הרדמה הדגים. חשוב להרוות את הספוג במים כי הוא sufficieקר ntly לשמור הרדמה פעם הדגים ממוקמת על זה. הזרקה: לפני זריקות התחייבות, מומלץ לנתח לפחות דג אחד כדי לקבל תחושה של עובי דופן הגוף. זה יכול לעזור לך לשפוט עד כמה המחט צריך להכניס להזין את חלל הבטן. בנוסף, כפי שאתה מכניס את המחט, אתה יכול להרגיש את הקיר הגוף &quot;לתת&quot; כאשר המחט חודר את חלל הבטן. במהלך הזריקה, לנקוט בצעדים כדי לשמור על החולה מאושר. ודא ספוג רווי מים קרים בטמפרטורה הנכונה כדי למנוע את הדגים להחיות במהלך ההזרקה. ספוג היטב רווי רך חשוב מזעור הנזק קשקשים וריר כיסוי של העור. ספוג היטב רווי חשוב גם לשמירה על הזימים סודה. אנו ממליצים בחום את הספוג קצף המפורטים להלן תחת חומרים. לבסוף, פעם הדג הוא הרדים, לעבוד במהירות כדי לצמצם את זמן הדג נמצא תחת. השחזור: הדג צריך להתאושש ההרדמה כמעט עם כניסתו מיכל מים חמים. אם הדג לא מתחיל מיד שחייה, בעדינות מערבולת המים לעבר הזימים שלו כדי להאיץ התאוששות. אם התאוששות איטית, אז הדג אל מתחת מהר מדי ואתה צריך להתאים את הליך ההרדמה כראוי. הסיבות האפשריות של התאוששות איטית נידונים תחת הרדמה.

<table><tbody><tr><td>ספוג קצף</td><td>Jaece Industries</td><td>L800-D</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכסה של קופסת טיפים לפיפט</td><td></td><td></td><td>לא עמוק מדי, לדוגמה 1.5 cm</td></tr><tr><td>מכל אחסון מפלסטיק</td><td></td><td></td><td>עמוק, לדוגמה 7 cm</td></tr><tr><td>מדחום</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קרח גרוס</td><td></td><td></td><td>עשוי ממי ברז של המעבדה</td></tr><tr><td>מי ברז חמימים</td><td></td><td></td><td>1 liter או יותר</td></tr><tr><td>ביקר 500 ml</td><td></td><td></td><td>לשקילה</td></tr><tr><td>מזרק NanoFil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>או מזרק Hamilton</td></tr><tr><td>מחט 35 gauge</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NF35BV-2</td><td>אלכסונית</td></tr><tr><td>צינור Silflex</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SILFLEX-2</td><td></td></tr><tr><td>משאבת UltraMicroPump III ובקר Micro4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMPS-1</td><td></td></tr><tr><td>דוושת רגל</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15867</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניילון נצמד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נייר סופג</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח Cortland</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

שיטה נוחה כימית בטיפול דג הזברה היא להציג מגיב למים טנק, איפה זה יהיה תפוס על ידי הדגים. עם זאת, שיטה זו מקשה לדעת כמה מגיב נספג או נלקח לכל הדגים. כמה שאלות ניסיוניות, במיוחד אלה הקשורים מחקרים מטבוליים, ניתן לפנות טוב יותר על ידי מתן כמות מוגדרת דגים כל, בהתבסס על המשקל. כאן אנו מציגים שיטה הזרקה (IP) intraperitoneal לתוך דג הזברה מבוגר. הזרקה היא לתוך חלל הבטן, אחורי אל חגורת האגן. הליך זה מותאם משיטות וטרינרי המשמש דגים גדולים יותר. זה בטוח, כפי שכבר ציין התמותה אפס. בנוסף, ראינו דימום במקום ההזרקה ב 5 מתוך 127 זריקות בלבד, ובכל אחד מהמקרים האלה הדימום היה קצר, שנמשך מספר שניות, וכמות הדם שאבד היה קטן. הצלחה עם הליך זה דורש טיפול עדין של הדג באמצעות מספר צעדים, כולל צום, שקילה, זריקת הרדמה, התאוששות. אמצעי זהירות נדרשים כדי למזער את הלחץ לאורך כל ההליך. אמצעי הזהירות שלנו כוללים שימוש נפח הזרקה קטן מחט 35G. אנו משתמשים בפתרון Cortland מלח כמו הרכב, אשר מאוזנת אוסמוטי של דגי מים מתוקים. אוורור של הזימים נשמר במהלך ההליך הזרקת ידי הראשון להביא את הדג לתוך מטוס כירורגית של הרדמה, אשר מאפשר תנועות operculum איטית, ושנית, על ידי החזקת דגים שוקת בתוך ספוג מים רוויים במהלך ההזרקה עצמה. אנו מדגימים את כלי ה-IP של הזרקת ידי הזרקת גלוקוז ניטור עלייה ברמת הגלוקוז בדם ולחזור הבאים שלה למצב נורמלי. כאשר הלחץ ידוע להגדיל הגלוקוז בדם בדגים teleost, אנו משווים את רמות הגלוקוז בדם אצל מבוגרים, הרכב מוזרק ולא מוזרק ולהראות כי ההליך אינו גורם לעלייה משמעותית רמת הסוכר בדם.

אנו מדגימים intraperitoneal הזרקה לתוך דג הזברה מבוגר. אנו משתמשים microsyringe 10 NanoFil μl נשלט על ידי בקר Micro4 ו UltraMicroPump III. הפגנה זו כוללת את השימוש במים קרים כחומר הרדמה.

שיטה נוחה לטיפול כימי בדגי זברה היא הוספת الريאגנט למי המכל, ממנה יספגו אותו הדגים. עם זאת, ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להזריק תמיסה לחלל הפריטונאום של דג זברה בוגר. בדוגמה זו, נזריק גלוקוז במעבדה שלנו. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור הומיאוסטזיס של גלוקוז בדם.דבר זה מושג תחילה על ידי שקילת הדג כדי לקבוע את כמות התמיסה להזרקה לכל גרם ממשקל הגוף. השלב השני של הפרוטוקול הוא הרדמת הדג באמצעות מים קרים. השלב השלישי של הפרוטוקול הוא העברת הדג לבמה של המיקרוסקופ וביצוע ההזרקה.השלב הסופי של הפרוצדורה הוא החזרת הדג לאקווריום שלו לצורך התאוששות. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות שינויים בהומאוסטזיס של הגלוקוז באמצעות מדידת רמות הגלוקוז בדם. שלום, אני מרי קינקל מהמעבדה של ויקטוריה פרינס במחלקה לביולוגיה של אורגניזמים ואנטומיה באוניברסיטת שיקגו.אני סטפני איימס, גם אני ממעבדת פרינס. היום נדגים לכם פרוצדורה להזרקה תוך-peritoneale (אינטraperitoneale) לדגי זהב בוגרים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את הבקרה על ההומאוסטזיס של הגלוקוז בדם.אז בואו נתחיל. כדי להכין את הדגים להזרקה, התחילו בהעברת הדגים למכל נקי והשאירו אותם ללא מזון. השאירו את הדגים בצום למשך 24 שעות כדי לרוקן את תכולת הנורה המעיית, ולמשך 72 שעות כדי להוריד את רמות הגלוקוז בדם לרמות הבסיס.הצפיפות המשמשת בפרוטוקול זה היא 10 עד 12 פרטים מאוכלוסייה מעורבת מינית. דגים לכל מיכל של תשעה ליטר עם שלוש שכבות של גולה, כאשר הגולות מבודדות את הביצים כדי שלא ייאכלו. יש להסיר ביצים ופסולת מדי יום באמצעות סינון (siphoning) של המיכל.בשלב הבא, הכינו תמיסת מלח Cortland המכילה 124.1 millimolar sodium chloride, 5.1 millimolar potassium chloride, 2.9 millimolar sodium pyrophosphate, 1.9 millimolar magnesium sulfate heptahydrate, 1.4 millimolar calcium chloride dihydrate, 11.9 millimolar sodium bicarbonate, ארבעה גרם של polyvinyl pyrrolidone ו-1000 USP units של heparin, עד לנפח סופי של 100 milliliters באמצעות מים דה-יוניזים; סננו, סטריליזו ואחסנו בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, המיסו חמישה גרם של glucose ב-10 milliliters של תמיסת מלח Cortland. כדי להכין תמיסת glucose בריכוז של 0.5 mg/µL, סננו, סטריליזו ואחסנו בטמפרטורה של 4 °C.לאחר מכן, הכין את שולחן הניתוח על ידי חיתוך ספוג רך לגובה של כ-20 millimeter בפניו השטוחות. בצע חיתוך בעומק של 10 עד 15 millimeter כדי להחזיק את הדג לצורך ההזרקה. הנח את הספוג בתוך Petri dish בנפח של 60 millimeter, והנח את ה-Petri dish עם הספוג בתוך מכסה של קופסת טיפים של פיפטה P 200.בשלב הבא, הכינו את המיקרוסקופ על ידי כיסוי בסיס המיקרוסקופ בניילון נצמד ובנייר סופג לצורך הגנה. למקרה של שפיכה, הניחו את שולחן הניתוח מעל נייר הסופג. בצעו כיוון מוקד ראשוני על ידי התבוננות בשולחן הניתוח ומיקוד על הספוג.הנח את האצבע על הספוג ומקד אותה כדי למזער התאמות מיקוד נוספות כאשר הדג יהיה על שולחן הניתוח. לאחר מכן, שקול את הדג על ידי מילוי של כית חמש מאות מיליליטר (500 milliliter) בערך עד לשליש מתוכנה במים ממתקני הדגים. העבר את הדג עם הרשת למשקל, ומשם לכלי עם מעט ככל האפשר מים עודפים, ורשום את המשקל. העבר כל דג שנשקל למכל שקוף ומסומן.חשבו את נפח ההזרקה בהתבסס על המשקל. בדוגמה זו, נזריק תמיסה של 0.5 milligrams לגרם משקל גוף של גלוקוז המומס בתמיסת מלח Cortland. מכיוון שהתמיסה שלנו היא בריכוז של 0.5 milligrams ל-microliter, החישוב הוא פעם אחת משקל הדג בגרמים שווה לנפח להזרקה ב-microliters; הכינו את המזרק ואת ציוד ההזרקה הרלוונטי.פרוטוקול זה משתמש במחט פלדה משופעת 30G 5, במשאבה אולטרה-מיקרו (ultra micro pump), ובמעבד micro four, ובמזרק מיקרו nano fill של 10 microliter להזרקת גלוקוז; מלאו את המזרק בגלוקוז בריכוז של 0.5 milligrams per microliter המומס בתמיסת מלח Cortland. חשוב להסיר את כל בועות האוויר מהמזרק, להתקין את המזרק על המשאבה האולטרה-מיקרו ותכננו את נפח ההזרקה עבור הדג הראשון על ידי הזנת הנפח בננוליטרים, באמצעות לוח המקשים המספרי של מעבד ה-micro four. לבסוף, הכינו את הרדמה הקרה על ידי ריסוק של מספיק קוביות קרח שהוכנו ממי מתקן הדגים.כדי למלא דלי קרח, הניחו את שולחן הניתוחים בתוך מכל גדול יותר, כגון מכל אחסון מזון עשוי גומי בנפח 2.4 ליטר. שפכו מעט מי ברז חמימים לתוך המכל החיצוני ולתוך שולחן הניתוחים. החזיקו בסמיכות מיכל רזרבה של מי ברז חמימים.חברו מדחום למכל החיצוני. הניחו את המכל החיצוני של חומר ההרדמה יחד עם שולחן הניתוח בסמיכות למיקרוסקופ. השאירו את דלי שבבי הקרח בקרבת מקום.התחילו להוסיף שבבי קרח עד שטמפרטורת המים תגיע ל-17 °C. אין לרדת מ-17 °C בשלב זה. השתמשו ברשת כדי להעביר את הדגים למכל החיצוני.בטמפרטורה של 17 מעלות או מעט פחות, הדג בדרך כלל יפרוש את סנפירי החזה אופקית, ינשום בכבדות ויבצע תנועות אוזניות מהירות. הוסיפו לאט שבבי קרח למכל כדי להוריד את הטמפרטורה ל-12 °C במהלך מספר דקות. ככל שהטמפרטורה תירד, הדג ישחה לאט יותר ובסופו של דבר יפסיק לשחות.בסופו של דבר, הפהפוי ייפסק ותנועות הסנפירים יואטו. הדג מוכן להזרקה כאשר הוא אינו מגיב לטיפול בו. עם הגעה לטמפרטורה הנדרשת, לחצו על הספוג כדי להספיגו.השאירו את אצבעותיכם במים הקרים מספיק זמן כדי שלא יחממו את הדג ויעילו אותו מההרדמה. בזמן הטיפול באצבעות קרות, העבירו בעדינות את הדג אל תעלת הספוג. מקמו את הדג כאשר הבטן פונה כלפי מעלה והזימים נמצאים בתעלה.העבירו במהירות את שולחן הניתוח לבמה של המיקרוסקופ. תוך עבודה מהירה, מקמו בזהירות את המחט כך שהחוד פונה לכיוון הקרני얼 (cran) ונמצא קרוב יותר לחגורת האגן מאשר לפיגוס. הכניסו את המחט לקו האמצע שבין סנפירי האגן.אתם אמורים להרגיש כאשר המחט מגיעה לעומק דופן הגוף. בעת החדרת המחט, ניתן להרגיש את השחרור של דופן הגוף. כאשר המחט חודרת לחלל הבטן, הזריקו את הנפח המתאים באמצעות המיקרו-פרוססור.השתמשו בדוושה כדי להזריק 1 µL לכל גרם ממשקל גוף הדג; לאחר ההזרקה, הוציאו את המחט והעבירו מיד את הדג בחזרה למיכל המים החמימים להחלמה. שחררו את הדג מהספוג אל תוך מיכל המים ובדקו את המחט תחת המיקרוסקופ. לעיתים תהיה קשקשת דבוקה למחט, ויש להסירה לפני ההזרקה הבאה.לאחר פרק זמן מתאים, המשיכו בבדיקה הבאה. מצאנו כי נדרש צום של 72 שעות כדי להוריד את רמות הגלוקוז בדם לרמת בסיס לפני ההזרקה. באיור זה, נתוני הביקורת ללא הזרקה המוצגים בירוק מראים ערכי גלוקוז בדם שאינם שונים באופן מובהק מביקורות שהוזרק להן vehicle המוצגות כאן באדום.עם זאת, הקו הכחול מציג את ערכי הגלוקוז בדם עבור דגים שהוזרקה להם גלוקוז, ומציג את העלייה והירידה של הגלוקוז במחזור הדם. לאורך הזמן, הן החיות שהוזרקה להן גלוקוז והן אלו שהוזרק להן חומר פלסבו (vehicle) היו תחת הרדמה כירורגית במהלך הליך ההזרקה, בעוד שביקורות שלא הזרקו לא היו תחת הרדמה כירורגית. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע הזרקה תוך-peritoneal (intraperitoneal) לדגי זהב בוגרים.במעבדה שלנו, אנו חוקרים שינויים בריכוז הגלוקוז בדם בנקודות זמן שונות לאחר הזרקה תוך-peritoneum (IP) של תמיסת גלוקוז. עם זאת, ניתן להשתמש בטכניקה שהדגמנו כעת כדי להזריק את התמיסה הרצויה עבורכם. בעת ביצוע הליך זה, זכרו להרדים את הדג באיטיות ולטפל בו בעדינות.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

intraperitoneal-injection-into-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנחנו מראים איך לעשות רטרו מסלולית הזרקת דג הזברה מבוגר.

רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

סרטון זה מתאר את הטכניקה של הזרקה תוך שרירית להעברת תרכובות לשרירים הגביים של דג זברה בוגר.

הזרקה תוך שרירית (IM): העברת תרכובת לשריר הגבי של דג זברה בוגר

סרטון זה מתאר טכניקה של הזרקה תוך צפקית, שיטה להעברת תמיסות לחלל הבטן של דגי זברה בוגרים.

הזרקה תוך צפקית: שיטה להעברת תמיסה לחלל הבטן של דג זברה בוגר

סרטון זה מתאר את הטכניקה של העברת תרכובות לליבם של דגי זברה בוגרים באמצעות הזרקה תוך חזה.

הזרקה תוך חזה: משלוח תרכובות ללב דג הזברה הבוגר

כאן נתאר החיסונים של הבוגרים דג זברה (רזבורה rerio) עם חיסון מבוסס DNA עבור פרוטוקול להדגים את האימות של אירוע מוצלח חיסון. שיטה זו מתאימה להקרנה פרה של החיסון מועמדים במודלים שונים של זיהום.

חיסונים של דג זברה בוגרת להקרנה פרה של חיסונים מבוסס DNA

שיטה זו מסתמכת על הזרקה של 0.5-3 μL של הפתרון לתוך החזה של דג מבוגר. ההליך מספק ביעילות חלבונים ותרכובות כימיות לתוך הסמיכות של הלב דג זברה מבלי לפגוע האיבר. הגישה מתאימה לבדיקת ההשפעות של גורמי אקסוגני על רקמות שונות של הלב.

הזרקת תוך-החזה לחקר בוגרים של לב זברדג

מתוארת שיטת הזרקה תוך-צפקית חדשה (IP) בדגי זברה בוגרים. בעת טיפול בתרכובות רעילות כגון דוקסורוביצין, הליך זה יעיל יותר משתי שיטות ה- IP שדווחו בעבר. הטכניקה תוכננה להיות מאומצת בקלות על ידי חוקרים בעלי ניסיון מוגבל במודל דגי הזברה.

טכניקת הזרקה תוך צפקית בדגי זברה בוגרים הממזערת נזקי גוף ותמותה נלווית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי ויעיל להזרקה תוך ורידית של תאים או חומרים פרמקולוגיים לדג זברה בוגר, וכתוצאה מכך השתלת תאים משופרת ושיעורי הישרדות מוגברים של דג הזברה המטופל.

הזרקה תוך ורידית אופטימלית בדגי זברה בוגרים

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

לאחר היווצרות בצינור העצבי, neuroepithelium מכווץ קפלי תוך הצינור מתמלא הנוזל השדרתי עובריים (eCSF) כדי ליצור את החדרים במוח העוברי. פיתחנו טכניקה זו זריקה החדר כדי להמחיש טוב יותר את החלל מילא נוזל לעומת הצורה neuroepithelial בעובר חי.

החדר דג הזברה המוח Injection

למדו הזרקה תוך-בטנית בדגי זברה בוגרים לחקר הומאוסטזיס של גלוקוז בדם. השיטה משתמשת בהרדמה במים קרים ומיקרו-מזרק לדיוק מרבי במינון התרופות.

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

גלה סרטונים נוספים