Name: המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: למדו לייצר מכשיר microfluidic מ-PDMS להפרדת סומה ואקסונים של נוירונים בתרבית. השיטה מאפשרת טיפולים נפרדים בכל תא ומחקר התחדשות עצבית מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

חלק 1: הכנת התקן נוירון microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 &quot;פרוסות סיליקון עם דפוס עשוי SU-8 על ידי photolithography משמש להטיל את התבנית (PDMS) polydimethylsiloxane microfluidic. אנו מתייחסים רקיק SU-8 תבניות סיליקון בדוגמת כמו הורים, או&quot; מאסטרים &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS מעורבב עם סוכן ריפוי ביחס aw / w של 10:01, כלומר, עבור 10 גרם של PDMS, 1 גרם של סוכן ריפוי מתווסף אליו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS הוא מעורב אז גם ושפך על גבי פרוסות סיליקון. פרוסות סיליקון הכלול בתוך צלחת פטרי 10 ס&quot;מ קלקר. זה לוקח בערך 12 גרם עד 15 גרם של PDMS לכיסוי הורים עם עובי של כ 4 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האדון עם PDMS ממוקם אז dessicator ואקום עם מכסה את צלחת פטרי, ואקום מוחל. זה נעשה כדי לסייע להסיר בועות אוויר מן PDMS שהוצגו במהלך תזוזה של הסוכן ריפוי. זה לוקח בערך 15 דקות את בועות האוויר כדי להסירו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האדון עם PDMS יוסר dessicator. אקדח אוויר עם מסנן 0.45 אממ משמש כדי להסיר בועות הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמן ממוקם אז על צלחת 80 מעלות צלזיוס חם במשך שעה 1 כדי לרפא. </li></ol> הערה: אם dessicator ואקום אינו זמין, האב ניתן להשאיר בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. בועות אוויר בסופו של דבר להפיג בכוחות עצמם. אם צלחת חמה אינו זמין, PDMS ירפא בטמפרטורת החדר לאחר 24 שעות. הערה: חשוב גם לוודא כי האדון הוא ברמה במהלך תהליך ריפוי. חלק 2: לחתוך את המכשיר microfluidic נוירון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע PDMS נרפא הבסיס, הוא נלקח אל מכסה המנוע נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בלהב כירורגי, עיגול הוא חתך מסביב המכשירים. כשאדם מכניס את הלהב לתוך PDMS, חשוב ליצור קשר עם פרוסות סיליקון, אבל לא לשים יותר מדי לחץ על פרוסות סיליקון, אחר המאסטר ייסדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם עיגול לחתוך את כל הדרך סביב המכשירים (יש 4 מכשירים לכל אחד מאסטר 3 הסיליקון &quot;), PDMS הוא הרים בזהירות את המאסטר. זה יכול להיות נכתבו על ידי מסובב בעדינות את להב כירורגי כפי שהוא מוכנס לתוך לחתוך לפני . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, הם מאגרים אגרוף לתוך המכשיר באמצעות רקמות 8 מ&quot;מ ביופסיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנים הם לרבעים ואז PDMS עודף גזוז משם כך שהמכשיר יתאים בצורה מסודרת על כיסוי הזכוכית קורנינג (מס &#39;1) 24 מ&quot;מ x 40 מ&quot;מ. חנקן באוויר משמש לסלק כל פסולת עודף. פסולת עיקש ניתן גם להסיר באמצעות 3M סקוטש 471 ברנד סרט ויניל. </li></ol> חלק 3: פלזמה מליטה התקנים תלושי כיסוי זכוכית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקה פלזמה משמש האג&quot;ח Harrick המכשירים נוירון את תלושי לכסות. בקצרה, המכשירים מוצבים שואב פלזמה משאבת ואקום משמש לפנות אוויר החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הלחץ ואקום הגיע 300 milliTorr, כוח מופעל על סליל חשמלי מוגדר גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סליל חשמלי יוצר פלזמה &quot;גז מיונן חלקית בהיקף של אלקטרונים, יונים או מולקולות אטומים נייטרלים&quot; - <a href="http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php">http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php</a> , מתוך מולקולות האוויר הנותר נשאר בחדר. פלזמה יוצר מינים תגובתי על פני השטח של הזכוכית את המכשיר, אשר כאשר מציבים יחד יהוו קשר קבוע. פלזמה גם הופך את משטחי הידרופילי, אשר מסייע להקל על תוספת של נוזלים. בנוסף, מנקה פלזמה sterilizes המכשירים. פני השטח של המכשיר PDMS המכיל את המכשיר microfluidic ממוקם עם הפנים כלפי מעלה לתוך שואב פלזמה יחד עם שקופיות הזכוכית. משטחים פלזמה טיפול של הזכוכית המכשיר microfluidic הם התאספו על קשר אחד עם השני על ספסל נקי, הניח אז 60 מנות סטרילי מ&quot;מ. משטחים מטופלים ליצור קשר הדוק בלתי הפיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 10 דקות של פלזמה מליטה התקנים זכוכית, פולי-L-ליזין (PLL) מתווסף אל המכשיר. לאחר 10 דקות, hydrophilicity של המכשיר יקטין שהקשה על PLL כדי להזין את המכשיר. הערה: חשוב לבדוק את בועות האוויר במכשיר לאחר תוספת של PLL. בועות האוויר בערוץ העיקריים הם רצויים, כפי שהם היו התאים לחמצן. שיטה קלה להסיר כל בועות האוויר הקיימות היא להשתמש pipet P200 מלא ul 150 של הנוזל (במקרה זה PLL), הצב את קצה ישירות בפתיחת הערוץ הראשי, לדכא בכוח P200. זה עלול צורך לחזור כמה פעמים אבל בסופו של דבר את הכוח מן pipet יניעו את הבועות החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכשירים המכיל PLL מותר דגירה לילה בתרבות תקן רקמות החממה ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, דההחטאים הם שטפה פעמיים במהירות עם dH2O autoclaved. במהלך תהליך זה, נוזל לא יוסר לחלוטין מן הערוצים העיקריים, רק מתוך המאגרים. הסרת נוזל מן הערוצים העיקריים יציג בועות. אחרי 2 שטיפות מהיר, התקנים הם מלאים dH2O autoclaved והניח בחזרה מינימום של 3 שעות לתוך האינקובטור, או לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, התקנים הם שטפה שוב 2 פעמים מהר עם dH2O autoclaved. ואז, מדיה הבסיס העצבי, המכיל את התוספים הדרושים B27 ו glutamax עבור נוירונים culturing העיקרי עכברוש, הוא הוסיף את המכשירים. המכשירים מוצבים בחזרה לשימוש עתידי בחממה. המכשירים נמצאים כעת לקראת זריעה של נוירונים. </li></ol>

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
</ol>

בסרטון זה אנו הדגימו כיצד לבצע ולהכין את מכשיר microfluidic PDMS שבו אנו משתמשים כדי נוירונים תרבות פנימה המכשיר מאפשר לנו להשיג שבריר axonal טהור מופרדות microgrooves מן התא המכיל תערובת של גופי התא, דנדריטים, ואת האקסונים . מכשירים אלה מאפשרים לחוקר לחקור את ההשפעות של טיפולים שונים, כמו גם לספק פלטפורמה לבצע פגיעה פיזית על האקסונים ולבחון מה ההשפעות טיפולים אלה על הנוירונים. המכשיר מספק גם רמת כדי נוירונים culturing המסייעת להקל על מחקרים התחבורה. בנוסף, microgrooves, אשר מפרידים בין תא תרבית תאים מתא האקסון, מאפשר בידוד fluidic בין שני תאים כך שניתן לטפל צד אחד של המכשיר ללא ולחולל את הצד השני של המכשיר ישירות עם הטיפול. תכונה זו מאפשרת לחוקר לבחון תופעות כגון התמרה האות התחבורה הנגרמות כתוצאה מהטיפול.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>ריאגנט</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 עם חומר מקשה. אנא פנו ל-Dow Corning כדי למצוא ספק בקרבתכם</td></tr><tr><td>מנקה פלזמה</td><td>כלי</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td></td><td>http://www.harrickplasma.com/</td></tr><tr><td>Neural Basal Media</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Neural Basal Media נרכש מ-Invitrogen תחת קו ריאגנטים לתרביות תאים של Gibco.</td></tr><tr><td>B27</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 הוא תוסף קנייני הזמין דרך Invitrogen תחת קו ריאגנטים לתרביות תאים של Gibco.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Glutamax זמין דרך Invitrogen תחת קו ריאגנטים לתרביות תאים של Gibco.</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי Cornig No. 1</td><td>זכוכית כיסוי</td><td>Corning</td><td>Corning No. X2935 244</td><td>זמין דרך Fisher Scientific, מספר קטלוג Fisher 12-531D</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 mm</td><td>כלי</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td>צלחות פטרי סטריליות מפוליסטירן בנפח 60 mm משמשות להצבת ההתקן המחובר לזכוכית.</td></tr><tr><td>מבחנת BD Falcon 50 ml</td><td>כלי</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352098</td><td>זמין דרך Fisher Scientific מספר קטלוג 14-959-49A</td></tr><tr><td>מבחנת BD Falcon 15 ml</td><td>כלי</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>זמין דרך Fisher Scientific מספר קטלוג 14-959-70C</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>פריט חדש</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של neuron סומה האקסונים

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הטכניקה של ליתוגרפיה רך עם polydimethyl siloxane (PDMS) שבו אנו משתמשים כדי להמציא מכשיר microfluidic עבור נוירונים culturing. בעבר, היה פרוסות סיליקון בדוגמת עם העיצוב של המכשיר נוירון microfluidic באמצעות SU-8 ו photolithography ליצור עובש מאסטר, או מה שאנו מכנים בפשטות &quot;אמן&quot;. בשלב הבא, אנחנו יוצקים פולימר סיליקון PDMS על גבי האדון אשר הוא נרפא לאחר מכן על ידי חימום PDMS עד 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. PDMS יוצר תבנית שלילית של המכשיר. PDMS הוא אז לחתוך בזהירות והרים מן האדון. חורים הם אגרוף שבו מאגרי יהיה ואת PDMS עודף גזוז מן המכשיר. חנקן משמש לסלק כל פסולת עודף מהמכשיר. בשלב זה שני המכשירים נמצאים כעת מוכן לשימוש וניתן ערובה או זכוכית קורנינג לכסות מס &#39;1 עם מעקר פלזמה / מנקה או יכול להיות מחויב הפיך לזכוכית לכסות פשוט על ידי הנחת המכשיר על גבי זכוכית המכסה. מליטה הפיך של המכשיר כדי זכוכית מכוסה וידאו נפרד דורש הראשונה את המכשיר לעקר או אתנול עם 70% או מעוקר. פלזמה בטיפול sterilizes המכשירים כך שאין טיפול נוסף הוא הכרחי. היא, לעומת זאת, חשוב, כאשר פלזמה בטיפול התקנים, כדי להוסיף נוזל המכשירים בתוך 10 דקות של טיפול פלזמה בעוד משטחים עדיין הידרופילי. מחכים יותר מ 10 דקות להוסיף נוזל למכשיר מקשה על הנוזל להזין את המכשיר. המכשירים נוירון הם בדרך כלל פלזמה חייב לכסות זכוכית 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​poly-L-ליזין (PLL) במאגר borate 8.5 pH הוא הוסיף מיד למכשיר. לאחר מינימום של 3 שעות דוגרים עם PLL, המכשירים נשטפים במים dH2O מינימום של 3 פעמים עם 15 דקות לפחות בין כל לשטוף. לאחר מכן, המים יוסר התקשורת טריים הוא הוסיף למכשיר. בשלב זה המכשיר מוכן לשימוש. חשוב לזכור בשלב זה לא להוציא את כל המדיה מהמכשיר. תמיד להשאיר את התקשורת בערוץ הראשי.

בסרטון הזה אנחנו מדגימים את הטכניקה של ליתוגרפיה רך עם polydimethyl siloxane (PDMS) שבו אנו משתמשים כדי farbricate מכשיר microfluidic עבור נוירונים culturing.

המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת הליתוגרפיה הרכה באמצעות פולידימეთילסילוקסן (PDMS), המשמשת אותנו לייצור התקן מיקרופלואידי עבור...

ברוכים הבאים למעבדה של ד"ר Newly John. מעבדת John מתמחה בהנדסת פלטפורמות מיקרופלואידיות ליישומים ביולוגיים. בסרטון זה, נדגים את הייצור והשימוש במכשיר מיקרופלואידי שנועד להפרדה לתאים (compartmentalization) ולתרבית של נוירונים ראשוניים.מכשיר הנוירון פורסם לראשונה ב-Nature Methods באוגוסט 2005. מאז הצגתו, נעשה שימוש נרחב במכשיר הנוירון על ידי שותפים למחקר מרחבי העולם. מכשיר הנוירון מורכב מחלק של PDMS שהוטבע על גבי פרוסת סיליקון המכילה תבנית SUA של המכשיר, אשר נוצרה קודם לכן באמצעות פוטוליתוגרפיה.להתקן שלושה מאפיינים עיקריים: ארבעה מאגרי נוזלים, שקוטרם שמונה מילימטרים; שני תעלות ראשיות, שכל אחת מהן היא ברוחב 1.5 מילימטר, באורך שבעה מילימטרים ובגובה מאה מיקרון; וחריצים מיקרוסקופיים, שרוחבם 10 מיקרומטר וגובהם שלושה מיקרומטר, המחברים בין שתי התעלות הראשיות. אורך החריצים המיקרוסקופיים יכול להשתנות בין 150 מיקרון ל-900 מיקרון, אם כי האורך הסטנדרטי הנבחר הוא 450 מיקרון. בבחינת ההתקן כאשר התעלות הראשיות והחריצים המיקרוסקופיים ניצבים, ניתן לראות כי מאגרי הנוזלים משמאל לחריצים מחוברים באמצעות התעלות הראשיות, וכך גם מאגרי הנוזלים מימין.מאפיין זה מאפשר לנוזלים לזרום דרך התעלה הראשית, דבר המהווה יתרון משמעותי המאפשר להטעין תאים ולהחליף מצע גידול. למכשיר הנוירונים ישנם שלושה יתרונות מרכזיים על פני פלטפורמות מסורתיות לתרבית רקמות. ראשית, הוא מאפשר הפרדה לתאים נפרדים של גופי התא או הסומה והאקסונים. באמצעות מכשיר הנוירונים, ניתן להפיק פראקציות אקסונליות טהורות.הגודל והאורך של החריצים המיקרוסקופיים מאפשרים לאקסונים לעבור דרך הערוץ הראשי השני תוך מניעת מעבר של גופי התאים. שנית, בשל תכנון המכשיר ובניצול הלחץ ההידרוסטטי, ניתן להעביד את צד התאים ו/או את צד האקסונים של המכשיר בטיפולים נפרדים, פשוט על ידי שמירת הנפח והמאגרים בגובה רב יותר בצד אחד של המכשיר לעומת הצד השני. ושלישית, ניתן לנתק את פראקציית האקסונים הטהורה של המכשיר באמצעות שאיבת ואקום, מה שמאפשר לחוקר ללמוד ולצפות בהתחדשות אקסונלית.החוקרת Hina Lee תדגים כעת את הכנת התקן המיקרופלואידי לנוירונים. עבור יציקת התבנית המיקרופלואידית מ-poly dimethyl siloxane (PDMS), נעשה שימוש בסיליקון וייפר בעובי 3 Ang עם תבנית המורכבת מ-SU-8 שנוצרה באמצעות פוטוליתוגרפיה. אנו מכנים את סיליקון הוייפר עם תבנית ה-SU-8 כתבניות מאסטר (master molds) או פשוט מאסטרים.מערבבים PDMS עם חומר מעבד ביחס משקלי של 10 ל-1. כך, למשל, 15 גרם של PDMS לכל 1.5 גרם של חומר מעבד. לאחר מכן מערבבים את ה-PDMS היטב ומוזגים אותו על גבי פרוסת סיליקון.פלטת הסיליקון מוצבת בתוך צלחת פטרי מפוליסטירן בקוטר 10 סנטימטר. נדרשים כמעט 12 גרם עד 15 גרם של PDMS כדי לכסות את ה-MAs בעובי של כארבעה מילימטר. לאחר מכן, התבנית עם ה-PDMS מוcephal-בתוך תא ואקום (desiccator) כאשר מכסה צלחת הפטרי פתוח, ומופעל ואקום.פעולה זו נעשית כדי לסייע בהסרת בועות אוויר מה-PDMS שהוכנסו במהלך ערבוב חומר ההקשיה. נדרשים כ-15 דקות להסרת בועות האוויר. את התבנית עם ה-PDMS מוציאים מהמייבש לאחר 15 דקות במייבש הוואקום.עדיין נותרו מספר בועות על תבנית ה-PDMS. נעשה שימוש בנשיפת אוויר עם מסנן של 0.45 micron כדי להסיר את כל הבועיות שנותרו. לאחר מכן, התבנית מונחת על פלטה חמה בטמפרטורה של 80 °C למשך שעה אחת לצורך הקשיה.אם אין מכשיר ייבוש בוואקום (vacuum desiccator), ניתן להשאיר את התבנית בטמפרטורת החדר למשך מספר שעות. בועות האוויר יתפוגגו בסופו של דבר מעצמן. אם אין פלטה מחממת, ה-PDMS יתרפא בטמפרטורת החדר לאחר 24 שעות.חשוב לוודא שהתבנית (master) מפולסת במהלך תהליך הפילם. לאחר שה-PDMS התגבש על התבנית, הוא מופרד ממנה באמצעות להב ניתוחי ומועבר למC-hood נקי. לאחר מכן, מבצעים חיתוך מעגלי מסביב להיקף המכשירים.חשוב להחדיר את הלהב לתוך ה-PDMS כך שייצור מגע עם פרוסת הסיליקון, אך אין להפעיל לחץ רב מדי על הפרוסה, אחרת התבנית (master) תיסדק בחתך מעגלי מסביב להתקנים. בכל תבנית סיליקון של 3 אינץ' ישנם ארבעה התקנים. ה-PDMS מופרד בזהירות מהתבנית.ניתן להתחיל זאת על ידי סיבוב עדין של הלהב הכירורגי בעת השחלתו לתוך החתך הקודם. השכבה דקה מאוד כאשר התקני ה-PDMS נמצאים על התבנית. מאגרים הפונים כלפי מעלה ננקבים במכשיר באמצעות מחורר ביופסיה לרקמות בקוטר שמונה מילימטרים.השאריות שנותרו במנקב נדחפות החוצה באמצעות מוט. לאחר מכן, המכשירים מחולקים לרבעים ועודפי PDMS נגזמים כך שהמכשיר יתאים בדיוק למכסה של Corning. זכוכית מספר 1 בגודל 24 millimeter by 40 millimeter וזרם חנקן משמשים להסרת שאריות עודפות.ניתן להסיר שאריות עקשניות גם באמצעות סרט ויניל מסוג 3M Scotch Brand 4 7 1. המכשירים הנקיים מוכנים כעת להדבקה בפלסמה. מנקה פלסמה מסוג herrick משמש להדבקה קצרה של מכשיר הנוירונים לכיסויי הזכוכית (cover slips).המכשירים וזכוכית המכסה מונחים על מגש, ולאחר מכן המגש יוכנס למנקה הפלסמה ומשאבת ואקום תשמש לפינוי האוויר מתא המכשיר. חשוב לציין כי מכשירי ה-PDMS מונחים כשפניהם כלפי מעלה. כלומר, צד התכנון פונה למעלה כדי שיהיו חשופים לגז הפלסמה.לאחר שלחץ הוואקום הגיע ל-300 millitorr, מופעל החשמל לסליל החשמלי ומוגדר לעוצמה גבוהה. פתח הדלת מעט כדי לאפשר כניסה של כמות קטנה של אוויר לתא, דבר שיסייע ביצירת הפלזמה. המכשירים וזכוכית הכיסוי עוברים טיפול בפלזמה למשך שתי דקות.שימו לב לצבע הסגול בתא. זהו הפלסמה בפועל. הסליל החשמלי יוצר פלסמה, שהיא גז מיונן חלקית המורכב מאלקטרונים, יונים ואטומים או מולקולות ניטרליים.הפלסמה יוצרת מינים ריאקטיביים על פני השטח של הזכוכית ושל המכשיר, אשר כאשר הם מונחים יחד, יצרו קשר קבוע. הפלסמה גם הופכת את פני השטח להידרופיליים, מה שמסייע בהוספת נוזלים. מנקה הפלסמה גם מעקר את המכשירים.לאחר טיפול בפלזמה למשך שתי דקות, הכוח בוואקום כובה ואוויר מוזרם אל התא. המשטחים שעברו טיפול בפלזמה של הזכוכית וההתקן המיקרופלואידי מורכבים במגע זה עם זה בתא עבודה סטרילי (clean bench). לאחר מכן, ההתקנים מונחים בצלחות סטריליות של 60 מילימטר.המשטחים המטופלים בפלסמה של הזכוכית והמכשיר יוצרים קשר בלתי הפיך והדוק. תוך 10 דקות מההדבקה בפלסמה, המכשיר מודבק לזכוכית ומוסיפים למכשיר polyol lysine. לאחר 10 דקות, ההידרופיליות של המכשיר תפחת.הדבר מקשה על חדירתו של ה-PLL אל תוך המכשיר. חשוב לבדוק אם קייות בועות אוויר במכשיר לאחר הוספת ה-PLL. שיטה פשוטה להסרת בועות אוויר קיימות היא שימוש בפיפטה P 200 מלאה ב-100 µL של נוזל.במקרה זה, יש להניח את קצה הפ pipette של ה-PLL ישירות בפתח התעלה הראשית, ולאחר מכן ללחוץ בעוצמה על ה-P 200. ייתכן שיהיה צורך לחזור על פעולה זו מספר פעמים, אך בסופו של דבר הכוח מה-pipette ידחוף את הבועות החוצה. המכשירים המכילים PLL נשארים לדגירה למשך הלילה באינקובטור סטנדרטי לתרביות רקמה ב-37 degrees עם 5%CO2.לאחר 24 שעות של דגירה עם PLL, שוטפים את ההתקנים פעמיים במהירות במים דה-יוניזים שעברו אוטוקלאב. במהלך תהליך זה, אין להסיר את הנוזל לחלוטין מהתעלים הראשיים, אלא רק מהמאגרים. הסרת הנוזל מהתעלים הראשיים תגרום להיווצרות בועות.לאחר שני שטיפות מהירות, המכשירים ממולאים שוב במים דה-יוניזים שעברו עיקור באוטוקלאב ומוחזרים לאינקובטור למשך שלוש שעות לפחות או למשך הלילה. למחרת, לאחר שהמכשירים דגרו עם מים למשך הלילה או למשך שלוש שעות לפחות, הם מועברים שוב למCבנטת הבטיחות הביולוגית ונשטפים פעמיים במים דה-יוניזים. לאחר מכן, למכשירים מתווסף מצע בסיסי עצבי (neural basal media) המכיל את התוספים הדרושים, B 27 וגלוטמט לגידול נוירונים ראשוניים של חולדה.לאחר מכן, המכשירים מוחזרים לאינקובטור לשימוש עתידי. המכשירים מוכנים כעת להזרעת נוירונים. בסרטון זה, הדגמנו את טכניקת הליטוגרפיה הרכה, המשמשת אותנו לייצור מכשירי הנוירונים שלנו.ניתן להשתמש במכשירים אלו לתרבית של נוירונים וסוגי תאים אחרים בעלי עניין. היתרון העיקרי של מכשירים אלו הוא היכולת להפריד ולחלק למדורות את התרבית של גופי התאים הנוירונליים בצד אחד של המכשיר מאקצירה אקסונלית טהורה בצדו השני של המכשיר. בסרטון הבא, נראה לכם כיצד אנו מכינים נוירונים קורטיקליים מעוברים של חולדה ביום E 18 וכיצד אנו טוענים את התאים לתוך המכשיר.זהו כל הסיכום ממעבדה של ג'ון. תודה שצפיתם.

fabrication-microfluidic-device-for-compartmentalization-neuron-soma

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה אנחנו מדגימים הכנת E18 עכברוש נוירונים בקליפת המוח.

הכנת E18 נוירונים עכברוש קליפתיים עבור מידור בתוך המכשיר microfluidic

BioMEMS: Forging שיתופי פעולה חדשים בין ביולוגים ומהנדסים

פיתחנו רומן רב תא שיתוף תרבות נוירון פלטפורמה עבור microsystem ב CNS מחקר במבחנה אינטראקציה האקסון, גליה. פלטפורמה המסוגלת לנהל עד שישה ניסויים עצמאיים במקביל היה מפוברק באמצעות פיתח מאקרו / מיקרו שיטת ייצור כלאיים.

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

סרטון זה מדגים את השימוש בשבב מיקרופלואיד פלסטי שהורכב מראש עבור תרבית ממודרת של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה. תאי העצב מצופים באחד התאים המיקרופלואידים, שם הם מתחברים וגדלים, ומאריכים את האקסונים שלהם דרך המיקרו-חריצים של השבב לתוך התא הסמוך. המיקרו-חריצים הצרים מונעים מגופי תאי עצב להיכנס, ובכך מאפשרים הפרדה פיזית בין התאים הסומטיים והאקסונליים.

תרבית נוירונים ראשונית ממודרת באמצעות שבבים מיקרופלואידים מפלסטיק

הסרטון מדגים התמיינות של תאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר מיקרופלואידי הכולל תא סומטי ותא אקסונלי המופרדים על ידי מחסום מיקרוגרוב. NSCs מוכנסים לתוך התא סומטי מותר לדבוק. תאי הגזע המוחיים מתמיינים לתאי עצב בתוך התא הסומטי ומאריכים אקסונים דרך מחסום המיקרו-גרוב אל התא האקסונלי.

התמיינות תאי גזע עצביים לתאי עצב באמצעות מכשיר מיקרופלואידי ממודר

פרוטוקולים לעריכה אחת נוירון microfluidic ומיסוך מים לדפוסי פלזמה בשבב של ציפויים ביולוגי מתוארים. ניתן להכין שיתוף תרבויות מקושרות ביותר באמצעות תשומות תא מינימליות.

הכנת עצבית שיתוף תרבויות עם Precision תא בודד

כתב היד הזה מפרט את ייצור של רקמות מיקרו- רקמות מהונדסות ברשתות עצביות: מבנים תלת-מימדיים בגודל מיקרון המורכבים משטחים אקסונליים ארוכי טווח המקיפים אוכלוסייה נוירונית מצטברת (s), המצופים בהידרוגול צינורי. אלה הפיגומים החיים יכולים לשמש ממסרים תפקודית לשחזר או לווסת מעגלים עצביים או כמו מיטות בדיקה ביופידלית מחקה נוירונטומי חומר אפור לבן.

אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש שבבי פלסטיק תרבות, ממדר אותם נוירונים מאתר העיקרי. . הצ'יפס הזה preassembled, ידידותי למשתמש, תואם עם רזולוציה גבוהה, לחיות, קרינה פלואורסצנטית והדימות. פרוטוקול זה מתאר את אופן צלחת החולדה הנוירונים בהיפוקמפוס בתוך הצ'יפס הזה ולבצע בידוד fluidic, axotomy ו- immunostaining.

שימוש של שבבי Microfluidic פלסטיק מראש ממדר נוירונים מאתר העיקרי

פרוטוקול זה מדגים את השימוש של שבבי microflu, ממדר מיקרופלואידים, הזרקה מחזורית אולפין קופולימר לנוירונים מתורבתים הבדיל מתאי גזע אנושיים. שבבים אלה מורכבים וקלים לשימוש מאשר התקנים ממוזגים פולי (diמתיל siloxane) מסורתיים. מספר תפיסות נסיוניות נפוצות מתוארות כאן, כולל תיוג נגיפי, בידוד פלואידיג, הוספת פיום וכתמים חיסוני.

מידור של תאי גזע האדם הנגזרים בתוך שבבי מיקרופלואידיג פלסטיק מורכבים מראש

הפרוטוקול הנוכחי מתאר זריעה והכתמה של מיטוכונדריה עצבית בתאים מיקרופלואידיים. שיפוע הלחץ הנוזלי בתאים אלה מאפשר טיפול סלקטיבי במיטוכונדריה באקסונים כדי לנתח את תכונותיהם בתגובה לאתגרים פרמקולוגיים מבלי להשפיע על תא גוף התא.

דה-פולריזציה סלקטיבית בסיוע מיקרופלואידיקה של מיטוכונדריה אקסונאלית

פרוטוקול זה מתאר מערכת מיקרופלואידית המדגמנת דינמיקה מטבולית עצבית לאחר פגיעה אקסונלית, המאפשרת הדמיה, ניתוח מולטי-אומיקס ומחקרים מכניסטיים של שיפוץ מטבולי מהותי.

שבב מיקרופלואידי עבור מודלים של פגיעות אקסונליות בנייה ומאפשר ניתוח מולטי-אומיקס

למדו לייצר מכשיר microfluidic מ-PDMS להפרדת סומה ואקסונים של נוירונים בתרבית. השיטה מאפשרת טיפולים נפרדים בכל תא ומחקר התחדשות עצבית מתקדם.

המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים

גלה סרטונים נוספים