המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים

ברוכים הבאים למעבדה של ד"ר ניו-ג'ון. מעבדת ג'ון מתמחה בהנדסת פלטפורמות מיקרופלואידיות ליישומים ביולוגיים. בסרטון זה נדגים את הייצור והשימוש במכשיר מיקרופלואידי, המיועד למידור ותרבות של נוירונים ראשוניים.

מכשיר הנוירון פורסם לראשונה ב-Nature Methods באוגוסט 2005. מאז הצגתו, מכשיר הנוירונים נמצא בשימוש נרחב על ידי משתפי פעולה בכל רחבי העולם. מכשיר הנוירון מורכב מחתיכת PDMS שנוצקה על פרוסת סיליקון המכילה דפוס SUA של המכשיר, שנוצר בעבר על ידי פוטוליתוגרפיה.

למכשיר שלושה מאפיינים עיקריים, ארבעה מאגרים בקוטר שמונה מילימטרים, שתי תעלות עיקריות ברוחב 1.5 מילימטר כל אחת, באורך שבעה מילימטרים ובגובה מאה מיקרון ומיקרו חריצים ברוחב 10 מיקרומטר ובגובה שלושה מיקרומטר המצטרפים לשני הערוצים העיקריים. אורכם של חריצי המיקרו יכול להשתנות בין 150 מיקרון ל-900 מיקרון, אם כי האורך הסטנדרטי לבחירה הוא 450 מיקרון. בהתבוננות במכשיר כך שהערוצים הראשיים וחריצי המיקרו אנכיים, אנו יכולים לראות כי המאגרים משמאל לחריצים מחוברים דרך הערוצים הראשיים, וכך גם המאגרים מימין.

תכונה זו מאפשרת לנוזל לזרום דרך התעלה הראשית, שהיא תכונה חשובה, המאפשרת לטעון תאים ולהחליף מדיה. למכשיר הנוירונים שלושה יתרונות עיקריים על פני פלטפורמות תרבית רקמות מסורתיות. האחד, זה מאפשר מידור של גופי תאים או סומה והאקסונים בעזרת מכשיר הנוירונים ניתן להשיג שברים אקסונליים טהורים.

הגודל והאורך של חריצי המיקרו מאפשרים לאקסונים לעבור דרך התעלה הראשית האחרת תוך מניעת חציית גופי המסור. שנית, בשל תכנון המכשיר וניצול הלחץ ההידרוסטטי, ניתן להכפיף את צד התא או את צד האקסון של המכשיר לטיפולים נפרדים פשוט על ידי שמירה על הנפח והמאגרים גבוהים יותר בצד אחד של המכשיר לעומת הצד השני. ומספר שלוש, ניתן לחתוך את החלק האקסונלי הטהור של המכשיר על ידי יניקת ואקום, מה שמאפשר לחוקר לחקור ולצפות בהתחדשות אקסונלית.

החוקרת הינה לי תדגים כעת את הכנת מכשיר הנוירונים המיקרופלואידיים. פרוסת סיליקון שלוש אנג עם דפוס עשוי SU שמונה על ידי פוטוליתוגרפיה משמשת ליציקת התבנית המיקרופלואידית של פולי דימתיל סלואן PDMS. אנו מתייחסים לפרוסות הסיליקון של דפוס SUA כתבניות מאסטר או פשוט מאסטרים.

PDMS מעורבב עם חומר ריפוי ביחס משקל למשקל של 10 לאחד. זהו, למשל, 15 גרם PDMS לכל 1.5 גרם חומר ריפוי. לאחר מכן מערבבים היטב את ה-PDMS ונשפכים על פרוסת הסיליקון.

פרוסת הסיליקון כלולה בצלחת פטרי פוליסטירן בגודל 10 סנטימטרים. נדרשים כ-12 גרם עד 15 גרם PDMS כדי לכסות את ה-MAs בעובי של כארבעה מילימטרים. לאחר מכן מכניסים את המאסטר עם ה-PDMS לייבוש ואקום עם המכסה מעל צלחת הפטרי ומורחים ואקום.

זה נעשה כדי לסייע בהסרת בועות אוויר מה-PDMS שהוכנסו במהלך ערבוב חומר הריפוי. לוקח בערך 15 דקות להסרת בועות האוויר. המאסטר עם PDMS מוסר מהחומר היבש לאחר 15 דקות בייבוש הוואקום.

נותרו עדיין כמה בועות על מאסטר ה-PDMS. אקדח אוויר עם פילטר 0.45 מיקרון משמש להסרת כל הבועות שנותרו. לאחר מכן מניחים את המאסטר על פלטה חמה של 80 מעלות למשך שעה לריפוי.

אם אין ייבוש ואקום, ניתן להשאיר את המאסטר בטמפרטורת החדר למשך מספר שעות. בועות האוויר יתפוגגו בסופו של דבר מעצמן. אם אין פלטה חמה זמינה, ה-PDMS יתרפא בטמפרטורת החדר לאחר 24 שעות.

חשוב לוודא שהמאסטר ברמה במהלך תהליך הריפוי. לאחר ריפוי ה-PDMS על המאסטר, הוא נלקח למכסה מנוע נקי באמצעות להב כירורגי. נוצר עיגול שנחתך סביב היקף המכשירים.

חשוב שכאשר מכניסים את הלהב לתוך ה-PDMS כדי ליצור מגע עם פרוסת הסיליקון, אך לא להפעיל לחץ רב מדי על הוופל, אחרת המאסטר ייסדק עם עיגול שנחתך לאורך כל המכשירים. ישנם ארבעה מכשירים לכל מאסטר סיליקון בגודל 3 אינץ'. ה-PDMS מורם בזהירות מהמאסטר.

ניתן להתחיל זאת על ידי סיבוב עדין של להב הניתוח כשהוא מוכנס לחתך הקודם. זה ממש דק עם התקני ה-PDMS על התבנית. מאגרים עם הפנים כלפי מעלה מנוקבים לתוך המכשיר באמצעות אגרוף ביופסיה של רקמה של שמונה מילימטרים.

הפסולת שנותרה באגרוף נדחפת החוצה בעזרת מוט. לאחר מכן המכשירים מחולקים לרבעים וחותכים PDMS עודפים כך שהמכשיר יתאים בצורה מסודרת לכיסוי קורנינג. זכוכית מספר אחת בגודל 24 מילימטר על 40 מילימטר אוויר חנקן משמשת לפיצוץ כל פסולת עודפת.

ניתן להסיר פסולת עיקשת גם באמצעות סרט ויניל 3M Scotch Brand 4 7 1. המכשירים הנקיים מוכנים כעת להדבקת פלזמה. מנקה פלזמה הריק משמש לחיבור מכשירי הנוירונים להחלקות הכיסוי לזמן קצר.

המכשירים והחלקות הכיסוי מונחים על מגש, ולאחר מכן המגש יוכנס לשואב הפלזמה ולמשאבת ואקום המשמשת לפינוי אוויר מהתא. חשוב לציין שמכשירי ה-PDMS ממוקמים עם הפנים כלפי מעלה. כלומר עם העיצוב עם הפנים כלפי מעלה כך שהם ייחשפו לגז הפלזמה.

לאחר שלחץ הוואקום הגיע ל-300, כוח המיליטור מופעל על סליל חשמלי ומוגדר לגבוה. הכל סדוק על הדלת כדי להכניס מעט אוויר לתא, מה שיעזור לייצר את הפלזמה. המכשירים וזכוכית הכיסוי מטופלים בפלזמה במשך שתי דקות.

שימו לב לצבע הסגול בתא. זו הפלזמה האמיתית. הסליל החשמלי יוצר פלזמה, שהיא גז מיונן חלקית המורכב מאלקטרונים, יונים ואטו או מולקולות ניטרליות.

הפלזמה יוצרת מינים תגובתיים על פני הזכוכית והמכשיר, שכאשר הם מונחים יחד יוצרים קשר קבוע. הפלזמה גם הופכת את פני השטח להידרופיליים, מה שעוזר להקל על הוספת נוזלים. מנקה הפלזמה גם מעקר את המכשירים.

לאחר טיפול בפלזמה במשך שתי דקות, החשמל בוואקום נכבה והאוויר מובל לתוך החדר. השירותים המטופלים בפלזמה של הזכוכית והמכשיר המיקרופלואידי מורכבים במגע זה עם זה בספסל נקי. לאחר מכן מניחים את המכשירים בכלים סטריליים של 60 מילימטר.

משטחי הזכוכית והמכשיר המטופלים בפלזמה יוצרים קשר הדוק ובלתי הפיך. תוך 10 דקות מהדבקת פלזמה, המכשיר נמצא לזכוכית פוליאול ליזין מתווסף למכשיר. לאחר 10 דקות, ההידרופיליות של המכשיר תפחת.

מה שמקשה על כניסת ה-PLL למכשיר. חשוב לבדוק אם יש בועות אוויר במכשיר לאחר הוספת PLL. שיטה קלה להסרת בועות אוויר קיימות היא להשתמש בפיפטה P 200 מלאה ב -100 מיקרוליטר נוזל.

במקרה זה, PLL הנח את הקצה ישירות בפתח התעלה הראשית, ולאחר מכן לחץ על ה-P 200 בכוח. ייתכן שיהיה צורך לחזור על זה מספר פעמים, אך בסופו של דבר הכוח מהפיפטה יגרש את הבועות החוצה. המכשירים המכילים PLL מורשים לדגור בן לילה ואינקובטור תרבית רקמה סטנדרטי ב-37 מעלות עם 5% CO2.

לאחר 24 שעות של דגירה עם PLL, המכשירים נשטפים פעמיים במהירות במים דה-יונים חיטוי. במהלך תהליך זה, נוזל לעולם אינו מוסר לחלוטין מהתעלות הראשיות, אלא רק מהמאגרים. הוצאת נוזלים מהתעלות הראשיות תכניס בועות.

לאחר שתי שטיפות מהירות, המכשירים מתמלאים שוב במים נטולי יונים ומכניסים אותם בחזרה לחממה למשך שלוש שעות לפחות או למשך הלילה. למחרת, לאחר שהמכשירים הודגרו במים למשך הלילה או למשך שלוש שעות לפחות, הם מוכנסים שוב לארון הבטיחות הביולוגית ונשטפים פעמיים במים נטולי יונים. לאחר מכן מתווספת למכשירים מדיה בסיסית עצבית המכילה את התוספים הדרושים, B 27 וגלוטמט לטיפוח נוירונים ראשוניים של חולדות.

לאחר מכן המכשירים מוחזרים לחממה לשימוש עתידי. המכשירים מוכנים כעת להושבת נוירונים. בסרטון זה, הדגמנו את הטכניקה של ליתוגרפיה רכה, שבה אנו משתמשים כדי לייצר את מכשירי הנוירונים שלנו.

מכשירים אלה יכולים לשמש לתרבית נוירונים וסוגי תאים אחרים מעניינים. היתרון העיקרי של מכשירים אלה הוא היכולת להפריד ולמדור את התרבות של גופי תאי העצב בצד אחד של המכשיר משבר אקסונלי טהור בצד השני של המכשיר. בסרטון הבא נראה לכם כיצד אנו מכינים נוירונים בקליפת המוח העוברי E 18 וכיצד אנו מעמיסים את התאים למכשיר.

אז זהו ממעבדת ג'ון. תודה שצפית.