Biomolecular איתור העסקת ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS)

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לכמת את הקישור של נוגדנים לאנטיגנים מקובעים על פני השטח באמצעות פלטפורמת חישוש רגישה וללא סימון הנקראת Iris. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת מערך של גששים לבדיקה ולבקרה על פני שטח אחידים של סיליקה (סיליקון די-אוקסיד) המופעלים כימית, כדי ללכוד חלבונים מטרתיים מתמיסה. הגששים המקובעים יכולים להיות נוגדנים או אנטיגנים, DNA או RNA או כל סוג אחר של מקרו-מולקולה התואמת לכימיה של פני השטח המופעלים, הפולימריים או הנקיים.

את המערך המוכנה מדגירים לאחר מכן עם דגימה המכילה את החלבונים המבוקשים, מה שמאפשר להתרחש קישור תחת תנאים שנקבעו על ידי החוקר. לאחר מכן, מצלמים את כל מערך החיישנים באורכי גל שונים של אור. במערכת IRIS, עוצמות ההחזר עבור כל פיקסל מעובדות באמצעות אלגוריתמים שנכתבו במיוחד.

על מנת לכמת את כמות הביו-חומר הקשור לכל תנאי ניסוי או ביקורת, מתקבלים תוצאות לאחר דגירה המראות זיהוי יעיל וכמימות מוחלטת של נוגדנים בתערובת מורכבת, בהתבסס על מדידות ללא סימון (label-free) אינטרפרומטריות של מערכת זו. בהתבסס על למעלה מעשור של מחקר ופיתוח בתחומי ההתערבות האופטית והתקני חללי שרף, פיתחנו שיטה חדשה זו שעשויה להתגבר על רבים מהגורמים המבלבלים שנתקלנו בהם במערכות הביו-סנסור ללא סימון קודמות שלנו. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי איסוף הנתונים דורשים נורמליזציה נכונה ומעקב אחר נהלי בקרת איכות, כדי להבטיח רכישת נתונים מדויקת וניתנת לשחזור.

כדי לצפות את תשבתי הסיליקה (silicon dioxide) בשכבת DMMA NAS סופחת, הכין תחילה את תמיסת הפולימר על ידי הוספת 100 milligrams של הפולימר לחמישה milliliters של מים דה-יוניים. לאחר מכן, הוסף חמישה milliliters של ammonium sulfate בריכוז של 40% לקבלת ריכוז סופי של ammonium sulfate של 0.92 molar. לאחר האינקובציה, טבול את השבבים בתמיסת הפולימר למשך 30 דקות על שייקר.

שטפו את השבבים ביסודיות במים דה-יוניים, ייבשו את השבבים בגז ארגון או חנקן, ולאחר מכן אפו אותם בטמפרטורה של 80 °C למשך 15 דקות. אחסנו את השבבים בעלי ציפוי הפולימר בסביבה יבשה, כגון דסיקטור בוואקום, למשך עד חודשיים עד שלושה חודשים עד לביצוע הליך הנקודת של הגששים כדי לדלל כל גשש. ראשית, קבעו את הנפח הנכון של תמיסת המקור של הגשש והבופר כדי להגיע לריכוז הסופי הרצוי.

בניסוי טיפוסי משתמשים באנטיגן או ב-IgG בריכוז של 0.5 milligrams per milliliter בתוך phosphate buffered saline; מוסיפים את הכמות המחושבת מכל תמיסת מקור של גשש (probe) לשפרויות eend orph קטנות המכילות את הכמות הרצויה של PBS buffer, ומערבבים את התמיסות. לאחר מכן, מעבירים בפיפט את תמיסות הגששים לצלחת 96 בארות בעלת קישור חלבוני נמוך (low protein binding plate), שתשמש כצלחת המקור עבור ה-spotter. בשלב הבא, מגדירים את פרמטרי ההדפסה עבור המערך המודפס על ידי קביעת מספר החזרות של כל תנאי לכל רשת.

הסריג קובע את מספר סריגי החזרות ואת מיקום הנקודות הרצוי על השבב. הנח את התשתית ואת פלטת המקור במכשיר ה-spotter ולאחר מכן בדוק את בקבוקי הפסולת והאספקה. התחל את תהליך ההדפסה.

לאחר סיום הנקודות, הנח את התשתית בסביבה בעלת לחות גבוהה למשך הלילה כדי לאפשר לתהליך האימוביליזציה והדה-אקטיבציה להסתיים לאחר הדגירה. שטוף את התשתיות תוך כדי ערבוב על ידי הנחת השבב ב-PBS עם 0.1%tween למשך שלוש דקות, שלוש פעמים נפרדות. לאחר מכן, בצע שלוש דגירות של שלוש דקות ב-PBS ולאחר מכן במים דאיוניים.

אם מבצעים מדידה יבשה, ייבשו את השבב היטב באמצעות גז ארגון. נטרלו את קבוצות ה-NHS שנותרו על פני השטח של הפולימר בשילוב על ידי טבילת השבבים בתמיסה של 50 millimolar של ethanol amine, כאשר ה-pH מותאם ל-7.4, למשך 30 דקות על פלטת הרעידה. שטפו היטב את ה-ethanol amine באמצעות PBS ולאחר מכן במים דאיונליים לפני תחילת הליך האינקובציה.

הכינו תמיסה בריכוז המתאים של חלבון המטרה ב-PBS לצורך הדגמה זו. נעשה שימוש ב-500 nanograms per milliliter של anti-human serum albumin; כלול נפח שווה של בופר ללא חלבון המטרה עבור דגירת ביקורת השלילה. מערכת האיריס מורכבת ממספר אלמנטים בסיסיים, כגון מקור תאורה, רכיבים אופטיים להארת מערך חיישני הבדיקה בצורה נכונה, מצלמה להקלטת עוצמות האור המוחזר, ובמה שבה מונח הדגימה למדידות.

התחילו בסריקת מראת סיליקון של שבב סיליקון נקי ללא ציפוי, כדי לנרמל את כל הנתונים שייאספו בהמשך לפני ביצוע הסריקה. הכינו את מערכת הצמצם על ידי התאמת הפרמטרים עבור הניסוי. שלב זה כולל מדידה של ההיסטוגרמה של עוצמות האור שנרשמות על ידי המצלמה, וקביעת זמן החשיפה להשגת עוצמות אופטימליות.

לאחר סריקת הנורמליזציה, טען את מערך הגששים שהוכן למערכת ה-iris ובצע את ההגדרה כפי שנעשה קודם לכן, וכוון את המיקוד כדי לדמות נכונה את פני השטח של התשתית. ודא שבמת המדגם מאוזנת על ידי בדיקת ההיסטוגרמות המוקלטות של עוצמות האור המוחזר. לבסוף, בחר שם קובץ לשמירת הנתונים.

הפעילו את התוכנה לסריקת המערך, הפעולה המאירה את הפני השטח באורכי גל שונים מספר פעמים ומבצעת ממוצע לתמונות שנאספו. נקודת הייחוס האופטית הראשונית נקבעת, ובכך מאפשרת ניתוח תקין של שינויים במסה על פני השטח לאחר הדגירה. לאחר הסריקה הראשונית, טבלו את השבב בתמיסת הדגירה שהוכנה למשך שעה אחת על פלטת ניעור. זמן הדגירה עשוי להשתנות באופן משמעותי בהתאם לרמת הצמיחה, ריכוז המטרה המזוהה וזיקות הצמד של המטרה והגשוש.

לאחר הדגירה, חזור על הליך השטיפה כפי שבוצע קודם לכן. סרוק את אותו ה-pro array באמצעות מערכת ה-iris כדי לקבל תמונות לאחר הדגירה לצורך השוואה לתמונות שלפני הדגירה. ניתן לחזור על תהליך זה עבור שלבי הדגירה שונים במידת הצורך.

לדוגמה, בפורמט של בדיקת סנדוויץ' שבו נעשה שימוש בנוגדן שני, התאימו את התמונות שנאספו עבור כל סריקת איריס באמצעות תוכנה מסחרית כדי להפיק תמונה של הפרובה המכילה התהוות של עובי אופטי. ניתן לבצע ניתוח איכותי מהיר של הקישור על ידי חיסור תמונות לאחר ומלפני דגירה. הקישור יופיע כשינוי בעוצמה בנקודות שבהן נצפו שינויים במסה.

עבור ניתוח כמותי, קבעו את צפיפות המסה של כל נקודה בהשוואה לרקע על ידי חישוב ממוצע של מידע על העובי האופטי עבור כל פיקסל בתוך הנקודה ועבור טבעת מחוץ לנקודה. לאחר מכן, בצעו השוואה ישירה בין שני האזורים המוצגים כאן. כדוגמה, סכימה של תשתית צמצם מסיליקון וסיליקון די-אוקסיד שכבתית, עליה הונחה מערך נוגדנים מייצג.

כל מאסף נוגדנים מוטבע בחזרות עם ספציפיות לאפיטופ שונה, המכוון לחלבון שונה. שני וירוסים שלמים שונים וחלבון וירוס מוצגים כדוגמאות למטרות. נוגדני ביקורת שלילית תלויים בסבב הבדיקה ויכולים להיות לא ספציפיים ו/או ספציפיים לווירוס.

כאן מוצגת דוגמה לתוצאות איכותניות של קישור של נוגדנים ספציפיים לאלבומין של סרום אנושי למערך של נקודות HSA מנוקדות ונקודות בקרת rabbit IgG, כפי שניתן לראות כאן. לאחר התאמה וקביעה של העובי האופטי עבור התמונות לפני ואחרי האינקובציה, ניתן ליצור תמונת הפרש עבור מערך הקישור כדי להעריך את הקישור במהירות. ניתוח כמותי יותר מגלה כי נצפתה השהיה ממוצעת בגובה האופטי של 2.05 ו-0.13 ננומטר עבור נקודות ה-HSA וה-rabbit IgG בהתאמה, עבור ריכוז אינקובציה של anti HSA של 500 nanograms per milliliter.

תרשים עמודות זה מייצג דוגמה לנתונים הכמותיים שניתן לקבל ממדידות iris. בדוגמה זו, מוצגת התלות של קישור חלבון fur בריכוז החלבון ובאורך הליגנד בעל הגדיל הכפול. תרשים עמודות זה מציג את מדידות הגובה האופטי המוחלט עבור גובהי רכיבי הליגנד המקובעים בתחילת התהליך ואחרי הדגירה לצורך קישור.

העלאת ריכוזי חלבון fur ל-5, 100 ו-200 nanomolar הובילה להגברת הקישור לגששי DNA. כאן מוצגת קישוריות הדימר של חלבון fur שחושבה עבור כל מקטע DNA דו-גדילי. קישוריות הדימר עלתה באופן משמעותי בריכוז של 200 nanomolar של חלבון fur, מה שמרמז על רמה גבוהה של אינטראקציות לא ספציפיות לאורך כל המקטע או על מנגנון קישור שונה של חלבון fur, כגון אגרגציה של מספר דימרים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להתחיל עם מצעים אחידים ונקיים בעלי עובי תחמוצת מתאים, ולשמור על ניקיון הדגימות על ידי טיפול זהיר בהן באמצעות פינצטה. כמו כן, קריטי להשתמש בריאגנטים שאוחסנו כראוי וידוע שהם תקינים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד למדוד פעולות ביומולקולריות בפורמט ללא סימון (label free) באמצעות הכנת מערכי גששים (prob arrays) פונקציונליים על פני שטח של סיליקון דו-חמצני, וכן כיצד לבצע רכישת נתונים וניתוח באמצעות חיישן דימות השתקפותה אינטרפרומטרי או iris.