שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular
25 במאי 2012
אדם בתאי גזע perivascular (PSCs) הם גזע הרומן הסלולרי בכיתה לשחזור רקמות השלד דומה בתאי גזע mesenchymal (MSCs). PSCs יכול להיות מבודד על ידי FACS (תא הקרינה מיון פעיל) מרקמת השומן רכש במהלך הליכים סטנדרטיים שאיבת שומן, בשילוב מכן עם פיגום osteoinductive להשיג היווצרות העצם In vivo.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את ההשפעות של השתלת תאי גזע פריוסקולריים במודלים של התמיינות עצם חוץ רחמית ואורתוטופית. זה מושג על ידי בידוד תאי גזע מרקמת שומן באמצעות טכנולוגיית פקס. לאחר מכן מיוצרים פיגומים מותאמים אישית כדי לספק משטח להתמיינות תאים בסביבה חוץ רחמית או אורתוטופית.
כדי לבדוק את היווצרות העצם בתיווך PSC נוצרים פגמים בשלד באמצעות מודל כיס שריר עכבר החלקה, מודל קלווריום של עכבר החלקה או מודל פגם סגמנטלי של עכברוש אתימי, והפיגום המושתל מרוצה מהפגם. ניתוח רדיוגרפי, היסטולוגי וביוכימי מגלה כי התמיינות תאי גזע פריוסקולרית מובילה להיווצרות עצם משמעותית in vivo. היתרון העיקרי של שימוש בתאי גזע פרה-וסקולריים על פני מקורות תאי גזע מסורתיים אחרים הוא ש-PSCs או תאי גזע פרה-וסקולריים הם אוכלוסייה הומוגנית יותר, מה שמגביר את טוהר תאי הגזע, משפר את ייצור הגורמים הטרופיים ועלול להגביר את היווצרות העצם.
התחל ביצירת פיגום כמתואר בכתב היד הנלווה. הכן את הפיגום להשתלה על ידי הוספת תרחיף תאים אליו. עבור כיס שריר העכבר או דגמי פגמים בקלוריאלית, השתמש בצפיפות של 250, 000 תאים למאה מיקרוליטר לאחר ההרדמה.
עכברי החלקה בני שישה שבועות עם איזופלורן ובופרנורפין. הכינו תכשיר בטדין סטנדרטי בגפה האחורית. לאחר מכן, בצע חתך דו-צדדי אורכי של שני מילימטר והשתמש בדיסקציה קהה כדי לחתוך כיסים בעומק ארבעה מילימטרים בשרירי שרירי הזרוע.
במקביל לסיבי השריר יש להיתקל בדימום מינימלי בלבד. הכנס את השתל המושתל ב-PSCs. כעת תפר את הפאשיה המכסה את השריר עם דפוס רציף פשוט עם חמישה או ויקריל.
לאחר מכן, סגור את העור עם חמישה או ויקריל בתבנית תת עורית. לאחר הניתוח. טפלו בבעלי החיים בבופרנורפין למשך 48 שעות וב-T-M-P-S-M-X למשך 10 ימים. העכבר צריך ללכת בקלות ביום הראשון שלאחר הניתוח.
לאחר איזוף פלואור, הרדמה של עכבר החלקה בן 12 עד 14 שבועות. הכינו תכשיר בטדין סטנדרטי של אזור הגולגולת. התחל בחתך עור באורך שמונה מילימטר על התפר הסגיטלי האמצעי של קלווריום העכבר.
לאחר מכן, הסירו בעדינות את הפריוסטאום הגולגולתי בעזרת אפליקטור עם קצה כותנה והשתמשו באפליקטור כדי לספוג את הדימום. כעת באמצעות סיבית טרפין מצופה יהלום המחוברת למקדחה דנטלית במהירות גבוהה, צור פגם בעצם פריאטלית של ארבעה מילימטרים. הפוך את הפגם לעובי מלא, כגון כל הדרך דרך העצם, אך היזהר מאוד לא לפגוע בדורה מאטר הבסיסית מכיוון שהדבר יפריע לריפוי.
כעת הנח בעדינות את השתל והושתל עם PSCs באתר הפגם. לבסוף, תפר את העור עם שישה או ויקריל לאחר הניתוח. טפלו בבעלי החיים בבופרנורפין למשך 48 שעות וב-T-M-P-S-M-X למשך 10 ימים.
התחל בקרצוף והכנת עצם הירך של חולדת אמיק בת 12 עד 14 שבועות, שעברה הרדמה עם פלואור איזוף. השתמש בפרוטוקול בטדין הסטנדרטי. בצע חתך אורכי של 27 עד 30 מילימטר מעל ההיבט הצדדי הקדמי של עצם הירך.
לאחר מכן, חשוף את פיר הירך על ידי הפרדת שרירי הירך הצדדיים והזרוע העצומים כדי למנוע דימום מוגזם. היזהר סביב כלי הדם העיקריים. כדי למקסם את העקביות של התחדשות העצם, לחלוטין.
הסר את הפריאוסטאום המכסה את הפגם בעצם הירך, יחד עם קטע הירך שנכרת. הימנע מפגיעה בעצב הירך כדי למנוע נזק נוירולוגי. כעת הניחו צלחת פוליאתילן על המשטח הרוחבי הקדמי של עצם הירך.
שישה חורים שנקדחו מראש בצלחת, מכילים חוטי קירשנר מושחלים בקוטר 0.9 מילימטר. באמצעות הצלחת כתבנית, קדחו שישה חוטי קירשנר מושחלים דרך הצלחת, ושתי קליפות המוח. בעזרת להב מסור מתנודד קטן, צור פגם של שישה מילימטר באמצע דיל.
לאחר מכן השתל את ה-PSC והפיגום המושתל לתוך הפגם. סגור את השריר והפאשיה שמעל עם ארבעה תפרים נספגים של אוי ויקריל. כדי לאבטח את השתל במקומו, תן לחולדה משכך כאבים למשך יומיים לאחר הניתוח ועקוב אחר פירוק הפצע במשך ארבעה שבועות לאחר השתלת כיס השריר.
הייתה עלייה הדרגתית בנפח העצם ובצפיפות המינרלים בעצם כפי שנצפה בהשתלת PSC על ידי ניתוח מיקרו CT ו-XR במהלך שמונה שבועות לאחר הכנסת פגם קלוריאלי, לא נצפה ריפוי עצם ללא פיגום בשל הגודל הקריטי של הפגם עם פיגום אך ללא תאים. היה ריפוי קל המוערך בסביבות 20% כצפוי. עלייה הדרגתית בהתעצמות הפגם נצפתה עם פיגום זרעים.
התעצמות משמעותית התרחשה תוך שבועיים. אוסיפיקציה מלאה התרחשה שמונה שבועות לאחר הכנסת פגם בעצם הירך. עלייה הדרגתית בהתעצמות התרחשה כאשר הפגם טופל ב-BMP פעמיים כבר לאחר שנצפה איחוד של ארבעה שבועות בחלק מבעלי החיים, ועד שמונה שבועות כל בעלי החיים נרפאו.
לעומת זאת, לא נצפה איחוד עצם ללא פיגום או עם פיגום חסר תאים או חלבון רקומביננטי. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לבודד תאי גזע פרה-וסקולריים, כיצד להשתמש בתאי גזע פרה-וסקולריים בשילוב עם פיגומים אוסטאואינדוקטיביים PLGA, ולבסוף, כיצד להשתמש בפיגומים המשולבים הללו ולמכור מוצרים לשלוש שיטות שונות של הנדסת רקמות תוך ניסיון לבצע כל הליך כפי שמוצג כאן, יש כמה דברים שחשוב לזכור. ראשית, עם מודל הפגם הגולגולתי, שימור מדויק של חומר הדורה מבטיח ריפוי נאות.
שנית, עבור מודל הפגם הסגמנטלי של הירך בחולדה, חשוב למזער את הטראומה לעצבים ולכלי הדם שמסביב. ברגע שאדם שולט בטכניקה כירורגית מסוימת כפי שמוצג כאן, אתה יכול לצפות שכל השתלת כיס שריר אורכת כ-20 דקות לביצוע, וכל פגם קלוריאלי ופגם סגמנטלי בעצם הירך עשויים להימשך עד 30 דקות לביצוע כראוי.
סקירה כללית
מחקר זה חוקר את ההשפעות של השתלת תאי גזע פרי-וסקולריים (PSC) על התמיינות עצמות במודלים שונים. PSCs, המבודדים מרקמת השומן, משולבים עם פיגומים מותאמים אישית כדי לקדם היווצרות עצם in vivo.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- הנדסת רקמות
- התחדשות עצמות
רקע
- תאי גזע פרי-וסקולריים אנושיים (PSCs) מייצגים מחלקה חדשה של תאי גזע להתחדשות רקמת השלד.
- PSCs יכולים להיות מבודדים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) מרקמת השומן.
- שילוב של PSCs עם פיגומים אוסטאו-אינדוקטיביים משפר את היווצרות העצם.
- PSCs מספקים אוכלוסייה הומוגנית יותר בהשוואה לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) מסורתיים.
מטרת המחקר
- להעריך את היעילות של PSCs בקידום היווצרות עצם במודלים אקטופיים ואורתוטופיים.
- להשוות את הביצועים של PSCs עם מקורות תאי גזע מסורתיים.
- להעריך את ההשפעה של עיצוב הפיגום על התמיינות תאי גזע וריפוי עצמות.
שיטות בשימוש
- בידוד של PSCs מרקמת השומן באמצעות FACS.
- ייצור של פיגומים מותאמים אישית להתמיינות תאים.
- יישום של מודלים חיות שונים לבדיקה (כיס שרירי עכבר skid, calvarium, ודגם פגם פמורלי סגמנטלי של חולדה athymic).
- ניתוח רדיוגרפי, היסטולוגי וביוכימי לצורך הערכת היווצרות העצם.
תוצאות עיקריות
- היווצרות עצם משמעותית נצפתה עם השתלת PSC in vivo.
- העצמותה מלאה התרחשה תוך שמונה שבועות בפגמים המטופלים.
- ריפוי עצם היה משופר כאשר השתמשו ב-PSCs בשילוב עם פיגומים.
- לא נצפתה ריפוי ללא פיגומים או תאים בפגמים בגודל קריטי.
מסקנות
- PSCs הם חלופה מבטיחה להתחדשות עצם בהשוואה למקורות תאי גזע מסורתיים.
- עיצוב הפיגום משחק תפקיד מכריע בתמיכה בריפוי עצם מתווך PSC.
- מחקרים עתידיים צריכים לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס התמיינות PSC והיווצרות עצם.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Perivascular stem cells (PSCs) offer a purified, homogeneous cell source for skeletal tissue engineering, addressing the need for reliable cell populations in bone regeneration strategies. Their osteogenic potential, demonstrated in ectopic and orthotopic models, supports target validation in preclinical discovery by providing mechanistic de-risking for stem cell-based therapies. This approach enables predictive confidence in assessing regenerative potential before lead identification in musculoskeletal indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of osteogenic differentiation capacity and pro-osteogenic cytokine secretion as functional readouts for target validation.
- Operational Value: Provides a homogeneous, FACS-sorted cell population (CD146+CD34-CD45- and CD146-CD34+CD45-) that reduces variability in preclinical assays.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by demonstrating consistent bone formation across ectopic (muscle pouch) and orthotopic (calvarial, femoral) models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: PSCs seeded on custom scaffolds create standardized, reproducible systems for evaluating osteoinductive compounds or growth factors.
- Quantitative Output: Enables measurement of bone volume and mineral density via microCT and XR, supporting dose-response and efficacy screening.
- Platform Reuse: Scaffold-PSC combinations serve as a reusable preclinical platform for testing various osteoinductive agents across defect models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Critical-size defect models (calvarial, femoral segmental) mimic clinical non-healing bone injuries, enhancing translational validity.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates that PSC-scaffold constructs drive ossification where acellular scaffolds fail, isolating the cellular contribution to healing.
- Preclinical Continuity: Supports progression from ectopic screening to orthotopic validation, aligning with discovery-to-preclinical workflows.
Pipeline & Workflow Integration
PSC isolation and scaffold engraftment fit within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis testing of osteogenic potential prior to lead optimization in bone regeneration programs.
- Discovery Biology: Supports functional validation of stem cell potency through osteogenic differentiation and trophic factor secretion in vivo.
- Screening: Scaffold-based PSC assays provide reproducible, quantitative readouts for comparing osteoinductive conditions.
- Analytics: MicroCT and XR-derived bone volume and density metrics enable objective comparison across treatment groups.
- Translational Research: Critical-size defect models bridge discovery to preclinical by modeling clinically relevant non-union scenarios.
- Enterprise Reuse: The PSC-scaffold platform can be adapted across multiple defect models and therapeutic candidates, supporting scalable preclinical evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in stem cell osteogenicity, reduction of mechanistic ambiguity in regeneration pathways.
- Operational Value: Standardized FACS isolation and scaffold engraftment improve reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by validating regenerative capacity in clinically relevant models, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of stem cell or scaffold-based therapies based on demonstrated bone formation efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence-activated cell sorting (FACS) for PSC isolation from adipose tissue.
- Dependent on access to microCT, XR, and histologic imaging infrastructure for longitudinal bone formation assessment.
- Necessitates standardized surgical procedures for muscle pouch, calvarial, and femoral defect models to ensure model consistency.
- Requires optimization of PSC seeding density (250,000 cells/100 µL) and scaffold compatibility for reproducible engraftment.
- Limited by the need for immunocompromised hosts (SCID mice, athymic rats) to prevent xenograft rejection, affecting scalability and cost.
