הכנת E18 נוירונים עכברוש קליפתיים עבור מידור בתוך המכשיר microfluidic

שלום וברוכים הבאים למעבדה של ד"ר ניו-ג'ון. בסרטון קודם הדגמנו כיצד אנו מייצרים את מכשיר הנוירונים, פלטפורמה המאפשרת לחוקר להפריד את גופי התאים של הנוירונים משבר אקסונלי טהור. ליתוגרפיה רכה היא הטכניקה המשמשת לייצור המכשירים, המורכבת מיציקה וריפוי PDMS על פרוסת סיליקון המכילה את עיצוב המכשיר שיוצר בעבר באמצעות פוטוליתוגרפיה.

בסרטון זה, נדגים את ההכנה של נוירוני חולדה בקליפת המוח spro dolly E 18, וכיצד להעמיס את הנוירונים למכשיר הנוירונים. אני רוצה להכיר לכם את קיאנה לי. היא תערוך את ההפגנות היום.

לפני שמתחילים, חשוב שכל המדיה והריאגנטים הדרושים יהיו חמים ל-37 מעלות באמבט המים. אתה יכול לראות מדיה נוירו-בזאלית 0.25% טריפסין ו-DMEM המכילים 10% FBS. חשוב לוודא שכל מה שמונח במכסה המנוע שישמש לתיקון התאים יעבור עיקור וניגוב עם 70% אתנול.

ראשית, מכסה המנוע של תרבית הרקמה נמחק עם 70% אתנול. לאחר מכן, מדפי הפלסטיק המשמשים להחזקת צינורות מרוססים באתנול. לאחר מכן, כדור הגומי המשמש בתהליך המשולש מנקה באתנול.

חשוב לעשות זאת מוקדם כדי שיהיה לו מספיק זמן להתייבש. לאחר מכן, הריאגנטים הדרושים נמחקים באתנול ועוברים למכסה המנוע. שתי חתיכות של קליפת המוח של חולדה עוברית E 18 המייצגות מוח אחד שנותח בעבר מונחות בשפופרת של 15 מ"ל המכילה מאגר דיסקציה קר כקרח, ללא סידן, ללא מגנזיום, מ"ל אחד של 0.25% טריפסין EDTA מתווסף לקליפת המוח במאגר הדיסקציה, מה שמביא את הנפח הסופי לשתי טחנות ואת ריכוז הניסיון הסופי ל-0.125%לאחר מכן מניחים את צינור ה-15 מ"ל המכיל את קליפת המוח עם הטריפסין שנוסף כעת באמבט מים של 37 מעלות למשך שמונה דקות, בזמן שקליפת המוח של העובר דוגרת ב-37 מעלות בטריפסין.

שלוש פיפטות הדבק מלוטשות באש. קצה פיפטת הזכוכית ממוקם ממש במגע עם הלהבה ליד החלק הכחול של הלהבה, ומסתובב לאט עד שרק הפתח הופך לכתום. כשהוא הפך לכתום.

חשוב להמשיך לסובב את פיפטת הזכוכית כדי שלא תקרוס. שימו לב שפתחי פיפטות הזכוכית קטנים יותר ברצף. חשוב גם לציין שאינך רוצה להפוך את הפתחים לקטנים מדי מכיוון שהדבר עלול לגרום לליזה של התאים לאחר הדגירה של קליפת המוח במשך שמונה דקות ב-37 מעלות כאשר הטריפסין מתווסף לקליפת המוח 10 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS כדי לעזור לעצור את תגובת הטריפסין.

שפופרת ה-15 מ"ל המכילה את קליפת המוח ו-DMEM 10% FBS היא צנטריפוגה ב-2,500 סל"ד למשך שתי דקות. בארון הבטיחות הביולוגית, יניקת ואקום המחוברת לפיפטה מזכוכית משמשת להסרת הסופרנטנט מקליפת המוח. היזהר לא להפריע או לעקור את הכדור.

מ"ל אחד של מדיה בזאלית עצבית המכילה B 27 וגלוטמט מתווסף לגלולת קליפת המוח ומוריד בעדינות למעלה ולמטה. חשוב מאוד לא ליצור בועות אוויר בזמן פיפטינג למעלה ולמטה מכיוון שבועות האוויר עלולות לפגוע בתאים על ידי חמצון. לאחר מכן, פיפטה אחורית מלוטשת באש עם הפתח הרחב ביותר המשמש לטריקס על ידי הצמדת נורת גומי סטרילית לקצה הפיפטה ופיפטה למעלה ולמטה כחמש פעמים.

היזהר לא להכניס בועות אוויר. בסדר. התהליך נמשך עם שתי פיפטות הזכוכית האחרות, כל אחת עם גודל הפתח הקטן יותר. כפי שצוין קודם לכן, חשוב לוודא שלא יוכנסו בועות במהלך תהליך ה-tri striation.

אתה צריך גם לשים לב שאתה כבר לא רואה גושים גלויים. חשוב לשמור על דירוג משולש עד שלא תוכלו יותר לראות אף אחד מחלקי קליפת המוח בתקשורת. לאחר האצילה, התאים שוב מתמזגים במהירות של 2,500 סל"ד למשך שתי דקות.

זה בערך הגודל המשוער של הגלולה שאפשר לצפות משתי חתיכות של קליפת המוח. לאחר הצנטריפוגה, הסאפ נאטין מוסר שוב מכדורית התא. לאחר הסרת סופר נאטין, מוסיפים לקליפת המוח מ"ל אחד של חומר נוירו-בסיסי המכיל B 27 וגלוטמט ומשתמשים בו כדי להחיות את קליפת המוח.

כדור התא שוב מוזרם למעלה ולמטה בזהירות כדי למנוע הוספת בועות ולהבטיח שכדור התא מפוזר באופן שווה ומפורק. מיל נוסף של מדיה נוירו-בסיסית מתווסף לתרחיף התא ומביא את הנפח הסופי לשני מיל. לאחר מכן, תמיסת התא המרחף מסוננת דרך מסננת תאים BD biosciences 40 מיקרון ליד כדי לספור את התאים ולהעריך את הכדאיות.

60 מיקרוליטר של מדיה בסיסית עצבית טרייה מונחים לתוך צינור מיקרו פוגה סטרילי. לאחר מכן מתווספים 20 מיקרוליטר של תאים ל-60 מיקרוליטר של מדיה נוירו-בסיסית, ולבסוף, 20 מיקרוליטר של טריאן כחול מתווספים לתאים במדיה הנוירו-בסיסית. הכחול הטריאני יכתים תאים שכבר אינם בחיים לאחר שהתאים נצבעו בכחול טריאן.

אנו מזרקים 20 מיקרוליטר על ציטומטר המו וצופים בהם מתחת למיקרוסקופ. תאים ברי קיימא נראים שקופים ושקופים בעוד שתאים שהממברנות שלהם מנוקבות מכתימים כחול בגלל הכחול הטריאני. בדרך כלל, אנו מקבלים כ-2.5 מיליון תאים ו-8 מיליון תאים בכל קליפת המוח.

בדרך כלל אנו מקבלים שני חלקים של קליפת המוח ממוח אחד כאשר התאים תלויים מחדש בנפח סופי של שני מיל. לפיכך, הריכוז הסופי של התאים הוא בדרך כלל בין 2.5 מיליון תאים למיל ל-8 מיליון תאים למיל. בדרך כלל, אנו מעמיסים כ-20 מיקרוליטר תאים לכל מכשיר.

זה נותן לנו טווח של תאים לכל מכשיר בין 50,000 תאים ל-160,000 תאים. צפיפות התאים יכולה להשתנות בהתאם ליישום. עם זאת, זריעת נוירונים ראשוניים בצפיפות נמוכה מדי מובילה בדרך כלל למוות תאי מכשירים שהוכנו בעבר המכילים מדיה בסיסית עצבית מובאים לארון הבטיחות הביולוגית כדי לשמור על סטריליות.

עודפי מדיה מהבארות מוסרים על ידי קטע ואקום. אבל צריך להיזהר שלא להסיר את כל המדיה. חייבת להיות תקשורת כלשהי בערוץ הראשי רק לשאוב מדיה מהמאגרים.

רק 20 מיקרוליטר תאים מוחלים על המאגר השמאלי העליון של המכשיר. התאים זורמים לתוך המכשיר ומתחברים למשטח המטופל ב-PLL. כאן תוכלו לראות את התאים כשהם זורמים מטה דרך הערוץ הראשי, ותתחילו לראות כמה מהם מחוברים למעשה לזכוכית.

לאחר הטעינה, המכשירים המכילים את התאים מוכנסים בחזרה לאינקובטור למשך כ-10 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד. לאחר 10 דקות בחממה, המכשירים מוכנסים שוב לארון הבטיחות הביולוגית, והמאגרים מתמלאים במדיה ואז המכשירים מוחזרים לחממה. כמה דברים חשובים שכדאי לשים לב אליהם, בהתאם לחממה ולרמת הלחות שהמדיה זקוקה לה, עשויים להיות מחוברים להחלפה במכשירים כל יומיים-שלושה.

מומלץ להניח מדיה טרייה בבארות העליונות ולאפשר למדיה טרייה לזרום דרך המכשיר ואל התעלות הראשיות לפני מילוי כל המאגרים. הנוירונים מוצגים כאן עם סידן בצבע קבוע של תא שמכתים תאים חיים. כאן תוכלו לראות את התא או את צד התא של המכשיר המכיל את גופי התאים, האקסונים והדנדריטים.

כאשר אנו מסתובבים על פני המכשיר, אתה יכול לראות את חריצי המיקרו שדרכם האקסונים גדלים כדי להגיע לצד השני של ההתקן, צד האקסון, המכיל שבר אקסונלי טהור. למטרות הדגמה. תאים אלה המסומנים בסימון פלואורסצנטי ישמשו להמחשת הליך אוטומיה גרזן.

אחד המאפיינים של מכשיר הנוירונים הוא שהוא מאפשר לחוקר לבצע אוטומיה אקס כלומר חותך את האקסונים מהחלק האקסונלי הטהור של המכשיר. על מנת לבצע מחקר כגון חקר התחדשות אקסונלית. קיאנו ידגים כעת ביצוע אוטומיה אקס במכשיר הנוירונים, אוטומיה אקס מבוצעת על ידי ואקום.

פיפטת זכוכית סטרילית מונחת בפתח התחתון של הבאר בצד האקסונלי, המדיה נשאבת על ידי ואקום. כל המדיה מוסרת לחלוטין מהצד האקסונלי של ההתקן, כולל המדיה בערוץ הראשי. כדי לחזור על התהליך לאחר הסרת המדיה, 150 מיקרוליטר של מדיה נאלצים לתוך התעלה הראשית על ידי הנחת קצה הפיפטה בפתח התעלה הראשית ולחיצה על הפיפטה בכוח.

לאחר מכן, הוואקום מוחל על פתח התעלה הראשית ועל הבאר העליונה של הצד האקסונלי של המכשיר. ואקום משמש שוב להסרת כל המדיה מהצד האקסונלי, כולל הערוץ הראשי. שוב, 150 מיקרוליטר של מדיה נדחפים לתעלה הראשית על ידי הנחת קצה הפיפטה בפתח התעלה הראשית ולחיצה על הפיפטה בכוח.

בשלב זה, החוקר יכול לצפות במכשיר תחת מיקרוסקופ כדי לבדוק את יעילות חיתוך האקסון. אם האקסונים אינם נחתכים מספיק, ניתן לחזור על התהליך שוב לפי הצורך. בסרטון זה הראינו לכם כיצד להכין נוירונים בקליפת המוח העוברי E 18 ולהעמיס אותם למכשיר הנוירונים.

היתרון העיקרי של מכשירים אלה הוא היכולת להפריד ולמדור את התרבות של גופי תאי העצב בצד אחד של המכשיר משבר אקסונלי טהור בצד השני של המכשיר. אנו מקווים שמצאת את הסרטון הזה אינפורמטיבי ומועיל. אז זהו ממעבדת ג'ון.

תודה שצפית.