הכנת E18 נוירונים עכברוש קליפתיים עבור מידור בתוך המכשיר microfluidic

שלום וברוכים הבאים למעבדה של ד"ר Newly John. בסרטון קודם, הדגמנו כיצד אנו מייצרים את התקן הנוירונלי, פלטפורמה המאפשרת לחוקר להפריד את גופי התאים של הנוירונים משבר אקסונלי טהור. ליטוגרפיה רכה היא הטכניקה המשמשת לייצור ההתקנים, והיא כוללת יציקה והקשחה של PDMS על גבי פרוסת סיליקון המכילה את תכנון ההתקן, שיוצר מבעודם באמצעות פוטוליתוגרפיה.

בסרטון זה, נדגים את הכנת נוירונים קורטיקליים של חולדה בגיל E18, ואת אופן טעינת הנוירונים אל מכשיר הנוירונים. אני רוצה להכיר לכם את קיאנה לי, שתבצע את ההדגמות היום.

לפני התחלת הפעולה, חשוב לוודא שכל המצעים והריאגנטים הדרושים מחוממים ל-37 °C במקלחית. ניתן לראות neuro basal media, 0.25% trypsin ו-DMEM המכיל 10% FBS. חשוב לוודא שכל פריט שמונח במנדף לשימוש לצורך תיקון התאים עומד בסטריליזציה ונקיה באמצעות 70% ethanol.

ראשית, יש לנגב את מנדף תרביות הרקמה ב-70% ethanol. לאחר מכן, יש להתיז ethanol על מתקני הפלסטיק המשמשים להחזקת המבחנות. לבסוף, יש לנקות באמצעות ethanol את כדור הגומי המשמש בתהליך ה-tri striation.

חשוב לבצע זאת בשלב מוקדם כדי שיהיה מספיק זמן לייבוש. לאחר מכן, מנקים את الريאגנטים הדרושים באתנול ומעבירים אותם למנדף. שתי חתיכות של קליפת מוח של עוף עכבר גיל E 18, המייצגות מוח אחד שנוסח בעבר, מונחות בתוך מבחנה של 15 ml המכילה 1 ml של באפר דיסקציה קר (בטמפרטורת קרח), נטול סידן ומגנזיום. למבחנה המכילה את קליפת המוח בבאפר הדיסקציה מוסיפים 1 ml של 0.25% trypsin EDTA, כך שהנפח הסופי הוא 2 ml וריכוז ה-trypsin הסופי הוא 0.125%. את מבחנת ה-15 ml המכילה את קליפת המוח עם ה-trypsin שהוסף מניחים כעת באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך שמונה דקות, בעוד קליפת המוח העוברית עוברת אינקובציה ב-37 °C ב-trypsin.

שלוש פסט-פיפטות (paste pipettes) עוברות ליטוש באש. קצה פיפטת הזכוכית מונח במגע עם הלהבה, קרוב לחלק הכחול שלה, ומסובב לאט עד שרק הפתח הופך לכתום. כאשר הפתח הפך לכתום.

חשוב להמשיך לסובב את פיפטת הזכוכית כדי למנוע את קריסתה. שימו לב שפתחי פיפטות הזכוכית הולכים וקטנים יותר. חשוב לציין גם שאין להקטין את הפתחים יותר מדי, שכן הדבר עלול לגרום לליזיס של התאים לאחר דגירה של הקורטקס במשך שמונה דקות ב-37 °C עם טריפסין. לאחר מכן, מוסיפים 10 mls של DMEM המכיל 10% FBS לקורטקס כדי לסייע בעצירת תגובת הטריפסין.

את המבחנה בנפח 15 ml המכילה את הקורטקס ו-DMEM 10%FBS סובבים בצנטריפוגה במהירות של 2,500 RPM למשך שתי דקות. בתוך תא בטיחות ביולוגית, משתמשים בשאיבה באמצעות פיפטה מזכוכית כדי להסיר את העילוי מהקורטקס, תוך הקפדה לא להפריע למשקע או להזיז אותו.

מוסיפים 1 ml של מצע בסיסי עצבי (neural basal media) המכיל B 27 וגלוטמט למשקע הקורטקס, ושואבים אותו בעדינות למעלה ולמטה באמצעות פיפט. חשוב מאוד להימנע מיצירת בועות אוויר בזמן השאיבה, שכן בועות אוויר עלולות לגרום לנזק לתאים עקב חמצון. לאחר מכן, משתמשים בפיפט אחורי שעבר ליטוש באש עם הפתח הרחב ביותר כדי לבצע טריטורציה (triturating) לקורטקס, על ידי חיבור פחוף גומי סטרילי לקצה הפיפט ושאיבה למעלה ולמטה כחמישה פעמים.

יש להקפיד לא להחדיר בועות אוויר. כעת, התהליך נמשך עם שתי השואבים (pipettes) מזכוכית הנוספים, שכל אחד מהם בעל פתח קטן יותר. כפי שצוין קודם לכן, חשוב להבטיח שלא יוכנסו בועות במהלך תהליך הריסות (tri striation).

יש לשים לב שאינכם רואים יותר גושים נראים לעין. חשוב להמשיך בטריטורציה עד שלא ניתן יהיה לראות יותר אף גוש של קורטקס במדיה. לאחר כך, התאים עוברים שוב סבוב בcentrifuge במהירות של 2,500 RPM למשך שתי דקות.

זהו הגודל המשוער של המשקע שצפוי להתקבל משני חתיכות קורטקס. לאחר סרקיגציה, מסירים שוב את הנוזל העליון מהמשקע התאי. לאחר הסרת הנוזל העליון, מוסיפים לקורטקס 1 ml של מצע neurobasal המכיל B 27 וגלוטמט, ומשמשים אותו להשעיה מחדש של הקורטקס.

שואבים שוב את משקע התאים בעזרת פיפטה למעלה ולמטה בזהירות, כדי למנוע היווצרות בועות ולהבטיח שהמשקע יתפזר ויתפרק באופן אחיד. מוסיפים מיל נוסף של neuro basal media לתמיחת התאים, כך שהנפח הסופי יעמוד על שני מיל. לאחר מכן, מסננים את תמיסת התאים שהוחזרו לסuspended דרך מסננת תאים של 40 מיקרון מבית BD biosciences, לצורך ספירת התאים והערכת החיוניות.

60 µL של מצע בסיסי עצבי (neural basal media) טרי מוכנסים למבחנה סטרילית של מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, מוסיפים 20 µL של תאים ל-60 µL של המצע הבסיסי העצבי, ולבסוף, מוסיפים 20 µL של trypan blue לתאים הנמצאים במצע הבסיסי העצבי. ה-trypan blue יצבע תאים שאינם חיים יותר, לאחר שהתאים נצבעו ב-trypan blue.

אנו מעבירים בפיפט 20 µL אל המוציטומטר (hemo cytometer) ובוחנים אותם תחת המיקרוסקופ. תאים חיוניים נראים שקופים וצלולים, בעוד שתאים שקרומי התאים שלהם ננקבו נצבעים בכחול בשל ה-trian blue. בדרך כלל, אנו מקבלים כ-2.5 מיליון תאים ו-8 מיליון תאים לכל קורטקס.

בדרך כלל אנו משיגים שתי פיסות של קורטקס ממוח אחד, כאשר התאים מושעים מחדש בנפח סופי של 2 ml. לפיכך, ריכוז התאים הסופי הוא בדרך כלל בין 2.5 מיליון תאים ל-ml לבין 8 מיליון תאים ל-ml. בדרך כלל, אנו טוענים כ-20 µL של תאים לכל התקן.

זה מעניק לנו טווח של בין 50,000 תאים ל-160,000 תאים לכל התקן. ניתן לשנות את צפיפות התאים בהתאם ליישום. עם זאת, זריעה של נוירונים ראשוניים בצפיפות נמוכה מדי מובילה בדרך כלל למות התאים. התקנים שהוכנו מראש ומכילים מצע בסיסי עצבי מועברים לקפיסה הביולוגית כדי לשמור על סטריליות.

מגרה עודפת מהבארות מוסרת באמצעות שאיבה (vacuum section). עם זאת, יש להיזהר לא להסיר את כל המגרה. חייבת להישאר כמות מסוימת של מגרה בערוץ הראשי; יש לשאוב מגרה רק מהמאגרים.

רק 20 µL של תאים מוחדרים למאגר השמאלי-עליון של המכשיר. התאים זורמים לתוך המכשיר ונצמדים למשטח שעבר טיפול ב-PLL. כאן ניתן לראות את התאים בעודם זורמים במעלה התעלה הראשית, וניתן להתחיל לראות חלקם נצמדים למשקף.

לאחר הטענה, המכשירים המכילים את התאים מוחזרים לאינקובטור למשך כ-10 דקות כדי לאפשר לתאים להיקשר. לאחר 10 דקות באינקובטור, המכשירים מועברים שוב לקלמת הבטיחות הביולוגית, המאגרים ממולאים במצע, ולאחר מכן המכשירים מוחזרים לאינקובטור. נקודה חשובה לציון: בהתאם לסוג האינקובטור ורמת הלחות הדרושה למצע, ייתכן שיהיה צורך להחליף את המצע במכשירים מדי יומיים עד שלושה ימים.

מומלץ להוסיף מצע טרי לבארות העליונות ולאפשר לחלק מהמצע לזרום דרך המכשיר אל תוך התעלים הראשיים לפני מילוי מלא של כל המכליים. כאן ניתן לראות את הנוירונים בעזרת צבע סידן חודר-תאים הצובע תאים חיים. כאן ניתן לראות את תא המדגם או צד התאים של המכשיר, המכיל את גופי התאים, האקסונים והדנדריטים.

בעודנו סורקים את המכשיר, ניתן לראות את החריצים המיקרוסקופיים שדרכם גדלים האקסונים כדי להגיע לצד השני של המכשיר, צד האקסונים, המכיל פראקציה אקסונית טהורה. לצורכי הדגמה, תאים המסומנים פלואורסצנטית ישמשו להמחשת פרוצעת האקסון (axotomy).

אחת התכונות של התקן הנוירון היא שהיא מאפשרת לחוקר לבצע אקסוטומיה (ex otomy), שהיא חיתוך האקסונים מהחלק האקסונלי הטהור של התקן. זאת כדי לבצע מחקרים כגון חקר רגנרציה אקסונלית. קיאנו ידגים כעת ביצוע אקסוטומיה במכשיר הנוירון; האקסוטומיה מבוצעת באמצעות ואקום.

פיפטת זכוכית סטרילית מונחת בפתח התחתון של הבאר בצד האקסוני, והתווך נשאב החוצה באמצעות ואקום. כל התווך מוסר לחלוטין מהצד האקסוני של המכשיר, כולל התווך בתעלה הראשית. כדי לחזור על התהליך לאחר הסרת התווך, דוחפים 150 µL של תווך אל התעלה הראשית על ידי הנחת קצה הפיפטה בפתח התעלה הראשית ולחיצה חזקה על הפיפטה.

בשלב הבא, מפעילים ואקום בפתח הערוץ הראשי ובבאר העליונה של הצד האקסוני של המכשיר. שנית, נעשה שימוש בוואקום כדי להסיר את כל מצע הגידול מהצד האקסוני, כולל מהערוץ הראשי. פעם נוספת, דוחפים 150 µL של מצע גידול אל תוך הערוץ הראשי על ידי הנחת קצה הפ pipette בפתח הערוץ הראשי ולחיצה חזקה על ה-pipette.

בשלב זה, החוקר יכול לבחון את המכשיר תחת מיקרוסקופ כדי לבדוק את יעילות חיתוך האקסונים. אם האקסונים לא נחתכו באופן מספיק, ניתן לחזור על התהליך שוב לפי הצורך. בסרטון זה, הצגנו כיצד להכין נוירונים קורטיקליים מעוברים של חולדה ביום העסקים 18 (E 18) ולהטעינם אל תוך מכשיר הנוירונים.

היתרון המרכזי של התקנים אלה הוא היכולת להפריד ולבודד את תרביות גופי התאים של הנוירונים בצד אחד של ההתקן, מחלק אקסוני טהור בצדו השני. אנו מקווים שסרטון זה היה עבורכם אינפורמטיבי ומועיל. וזהו כל הסיכום מהמעבדה של ג'ון (John Lab).

תודה לצפייה.