JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 5:45 דק' • July 8th, 2025
תאי T רגולטוריים, או Tregs, הם תת-אוכלוסייה מיוחדת של תאי T המפעילה השפעות מדכאות חיסון כדי לתווך הומאוסטזיס של מערכת החיסון. Tregs מבטאים את סמני פני התא CD4, CD25 ו-Neuropilin 1, Nrp1, ואת גורמי השעתוק הגרעיני תיבת מזלג P3, Foxp3 ו-Helios.
כדי לבודד Tregs מבלוטות לימפה מנקזות לבלב של עכבר, או PDLNs, הנח רשת מתכת מעל צינור חרוטי. הנח את ה-PDLN על הרשת וטחן את הרקמה כדי לנתק אותה מכנית. הוסף מדיום מתאים מעל הרשת, ושטוף את התאים לתוך הצינור.
צנטריפוגה, הסרת תאים מתים ופסולת תאית. השעו מחדש את התאים הקיימים בתקשורת. העבירו את התאים דרך מכסה מסננת תאים המותאם לצינור תחתון עגול כדי לקבל תרחיף תא יחיד הומוגני, תוך ביטול כל גושי התאים שנותרו.
הוסף נוגדנים מצומדים נגד CD4, אנטי-CD25 ואנטי-Nrp1 מצומדים לפלואורוכרום. הנוגדנים נגד CD4 ואנטי-CD25 נקשרים לאנטיגנים שלהם על פני התא ב-Tregs. במקביל, אנטי-Nrp1 נקשר לקולטני Nrp1.
טפל בתאים עם מאגר קיבוע חדירה מתאים, קיבוע התאים וחדירה לממברנות התא והגרעין. הוסף נוגדנים מצומדים פלואורוכרום המכוונים ל-Foxp3 ו-Helios.
הממברנות החדירות מאפשרות לנוגדנים להיכנס לתאים ולהיקשר למטרות התוך-גרעיניות שלהם. נתח את התאים באמצעות ציטומטריית זרימה.
Tregs מאופיינים בביטוי חיובי על פני התא של CD4, CD25 ו-Nrp1, יחד עם גורמי השעתוק הגרעיני Foxp3 ו-Helios.
ראשית, הניחו צינור חרוטי של 15 מיליליטר למתלה. הניחו רשת מתכת סטרילית של 250 מיקרומטר מעל הצינור. שוטפים את הרשת עם 1 מיליליטר RPMI. לאחר מכן, העבירו את בלוטות הלימפה לרשת המתכת, והשתמשו בזוג פינצטה כדי לטחון אותן דרך הרשת. מרחו 1 מיליליטר של RPMI על הרשת כדי לשטוף את התאים לתוך הצינור. חזור על תהליך זה של העברה וטחינה של בלוטות הלימפה שלוש פעמים עבור כל דגימה, ולאחר מכן, הסר את הרשת.
צנטריפוגה את הצינורות בחום של 433 x גרם וב -4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בכ-5 מיליליטר של RPMI, ואז מלאו את הצינורות ב-RPMI. חזור על תהליך זה מצנטריפוגה של הדגימות ועד למילוי הצינור ב- RPMI פעם אחת.
צנטריפוגה את הצינורות שוב ב -433 x גרם וב -4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את כדור התא ב-2 מיליליטר של RPMI. העבירו 2 מיליליטר ממתלה התא לצינורות תחתונים עגולים של 5 מיליליטר עם מכסי מסננת תאים.
ראשית, צנטריפוגה של תרחיף התאים מדגימות ה-PDLN ב-433 x g וב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט. צבעו את התאים בנוגדנים על פני השטח, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, ודגרו את הצינורות על קרח למשך 40 דקות.
לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל צינור. צנטריפוגה ב-433 x גרם וב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, והשליכו את הסופרנטנט. חזרו על התהליך הזה – הוסיפו את המאגר, צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט פעם אחת. השעו מחדש את כדור התא ב-500 מיקרוליטר של מאגר קיבוע חדירות כדי לתקן ולחדור את התאים.
מעבירים את הצינורות למקרר בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, צנטריפוגה של תרחיף התאים מדגימות ה-PDLN ב-433 x g וב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-500 מיקרוליטר של מאגר כביסה חדירה. צנטריפוגה של התאים שוב ב-433 x g וב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, והשליכו את הסופרנטנט.
צבעו את התאים בנוגדנים תוך-תאיים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. דגרו את הצינורות על קרח למשך שעה. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה חדירה לכל צינור. צנטריפוגה ב-433 x גרם וב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר כביסה של פרמיביליזציה.
צנטריפוגה פעם נוספת ב-433 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-300 מיקרוליטר של מאגר FACS. לאחר מכן, נתח את התאים על ציטומטר זרימה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.