הדמיה תוך חיונית של לימפוציטים תוך-אפיתליאליים של גמא דלתא

לימפוציטים תוך-אפיתליים של גמא דלתא, γδ IELs, הם תאי T נודדים מיוחדים המבטאים קולטני תאי T גמא דלתא. תאים אלה נמצאים בעיקר בתוך אפיתל המעי ומפטרלים באפיתל כדי להגביל את העברת הפתוגן על פני המעי.

כדי לדמיין γδ IELs בתוך אורגניזם חי, התחל עם עכבר טרנסגני מורדם עם מעי דק חשוף חלקית. העכבר הטרנסגני עובר שינוי גנטי כדי לבטא חלבונים מדווחים - חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים משופרים - אך ורק ב-γδ IELs, מה שמאפשר מעקב אחריהם.

בעזרת צריבה חשמלית, צור קו ניקוב מעל המעי הדק החשוף לאורך פני השטח הזמניים, ומונע דימום מוגזם.

בצע חתך אורכי מעל קו הניקוב כדי לחשוף את רירית המעי, ומראה בליטות מרובות דמויות אצבע - villi. כל וילוס מכיל תאי אפיתל עם γδ IELs שוכנים הבולטים לתוך לומן המעי.

מקם את העכבר עם משטח הרירית החשוף במגע ישיר עם הצבע הפלואורסצנטי, והעניק פלואורסצנטיות אדומה ללומן.

דמיין את העכבר תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. אתר וילוס ותמונה במישורי מוקד שונים לאורך ציר ה-z, החל מאפיתל קצה הווילוס. שלב את המקטעים האופטיים הללו כדי להפיק תמונה תלת-ממדית.

הדמיה תוך-חיונית מראה את התנועה הדינמית של IELs פלואורסצנטיים ירוקים γδ לאורך קרום הבסיס של תא האפיתל ליד הלומן האדום.

הנח שני זוגות מלקחיים משני צידי המזנטריה הבסיסית בין כלי הדם, שפשף בעדינות את קצות המלקחיים יחד כדי ליצור חור בקרום. בעזרת מלקחיים זוויתיים ומחט מעוקלת ומחודדת המחוברת לתפר של 5 סנטימטרים, חודרים צד אחד של הצפק דרך החור בקרום ומעלה דרך הצד השני של רירית הצפק, מניחים תפר אחד בחלק העליון ואחר ליד החלק התחתון של החתך כדי לסגור את החתך תוך שמירה על לולאת המעי מוחצנת.

כדי להגדיל את הסיכוי להצלחה, אין לקשור או לקרוע כלי דם בזמן הנחת מבנה הבטן, ולהגביל כל טיפול זר במעי.

לאחר מכן, סגור את העור מתחת ללולאת המעי באותו אופן, והניח תפר אחד באמצע החתך בין התפרים הקודמים בצפק הבסיסי. בעזרת צריבה חשמלית, צרו קו ניקוב לאורך הגבול האנטי-מזנטרי, ומרחו מיד כמה טיפות מים על פני המעי כדי למנוע נזק נוסף לרקמות הנגרמות מחום.

כתם עם Kimwipe כדי להסיר שאריות מים. השתמש במספריים של Vannas כדי לחתוך חריץ אופקי של כ-1.5 סנטימטר בקצה הדיסטלי של הרקמה הצרובה, לאורך הקו הצרוב לכיוון הקצה הפרוקסימלי של קטע הרקמה המוחצן. כאשר משטח הרירית חשוף, כסו את הבטן ב-Kimwipe לח כדי לשמור על לחות הרקמה.

להדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב, העבירו את העכבר למיקרוסקופ בכלי מכוסה. הפעל את תוכנת ההדמיה, והטה את ראש המיקרוסקופ לאחור, והוסף 150 מיקרוליטר של צי מיקרוטולר אחד של צבע AlexaFluor בתמיסת המלח המבודדת של האנק על החלק התחתון של מכסה הזכוכית. מקם את העכבר כך שהמשטח הרירי הפתוח ייגע ישירות בכיסוי.

הנח את העכבר והצלחת על שלב ההדמיה באינקובטור מחומם מראש. הגדר את עוצמת העירור וזמן החשיפה עבור כל לייזר ללא יותר מ-10 עד 15 מילי-וואט, ו-120 עד 150 מילישניות בהתאמה, והתאם את ממוצע המסגרת ל-"2".

הפעל את פונקציית הרווח מכפיל האלקטרונים כדי להפחית את רעשי הרקע, ובחר את כיול האובייקט פי 63 כדי להבטיח מדידה נכונה של גודל הפיקסלים. באמצעות לייזר 405 ננומטר ומטרת האוויר פי 20, דמיין ידנית את הגרעינים כדי לאתר שדה של villi חסר תנועה או סחיפה מורגשת, תוך הימנעות מאזורים של תנועה מלאכותית עקב נשימה, פריסטלטיקה או פעימות לב.

באמצעות סריקת ה-XY, רשום את קואורדינטת ה-xy של שדה העניין, ועבור ליעד טבילת הגליצרול 63X. קבל תמונה חיה בערוץ של 405 ננומטר למשך עד דקה אחת כדי לאשר שהווילי בשדה הנבחר יציבים, תוך התאמת המיקוד כדי למצוא את המישור האורתוגונלי ממש מתחת לקצה הווילוס.

לאחר מכן, רכשו ערימות Z החל ממש מתחת לאפיתל קצה הווילוס, כ-15 עד 20 מיקרומטר, עד לווילוס, עד שקשה לפתור את הגרעינים בצעדים של 1.5 מיקרומטר. 3 עד 5 דקות לאחר תחילת הרכישה, אשר את יציבות התמונה, ואת תנועתיות התא התוך-אפיתל של גמא-דלתא, והמשך לצבור תמונות במשך 30 עד 60 דקות עבור כל שדה של villi.