Name: לטווח ארוך של תרבות האדם סרטן השד דוגמאות וניתוח שלהם באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: למד שיטה לתרבית ארוכת טווח של דגימות סרטן שד אנושי וניתוחן באמצעות טומוגרפיית הקרנה אופטית. השיטה מאפשרת כימות תבניות גדילה תלת-ממדיות והערכת תגובה לתרופות בדגימות גידול יחידניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לורנה רנשו (יחידת השד אדינבורו) לקבלת סיוע שלא יסולא בפז לה בהשגת דגימות קליניות. שימוש בחומר הגידול אושרה על ידי מחקר Lothian ועדת האתיקה (08/S1101/41) וקיבלנו בחסות Experimental Medicine סרטן מרכז התוכנית (אדינבורו). עבודה זו נתמכת על ידי המועצה הסקוטית מימון. הליגה נגד השמצה היא מרגרט מיס באטרס Reekie בחור בנאמנות קלינית.

1. מחלץ קולגן מ זנבות עכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום קפוא זנבות עכברוש טרי אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deglove והעור שמעליה עם גידים חשיפת אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצועת הגידים מן הזנב מקום אתנול 70% לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הגידים נאספים להעביר חומצה אצטית (גיד 1g ל 250 מ"ל חומצה אצטית 0.5m). מערבבים עבור 48hr ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תמהיל חומצה גיד / אצטית ב g 10,000 עבור 30 דקות וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של 10% (w / v) NaCl כדי supernatant ולאפשר לתערובת לעמוד לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את שכבת קולגן עשיר, תחתית מסיס ו centrifugate במשך 30 דקות נוספות על 10,000 g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend קולגן עשיר החומר חומצה אצטית 0.25M ב 4 ° C ו dialyse נגד חומצה אצטית 1:1000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים, שינוי חיץ דיאליזה פעמיים ביום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לעקר את הפתרון קולגן על ידי צנטריפוגה (20,000 g עבור 2hr) ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל קולגן כנדרש עם תוספת של חומצה אצטית סטרילי 1:1000 ריכוז מלאי של 1mg/ml. </li></ol> 2. 3D יצירה Assay Assay 3D מבוסס על assay קו התא, שפורסמו בעבר 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביופסיות מרובות ליבה נקצרים מן הסכמה חולים בזמן כריתה כירורגית מרפא עבור סרטן שד פולשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפי העין, לחלק את ליבות באמצעות אזמל לתוך 1mm 3 שברים. חתוך וזורקים שומן ברורים macroscopically. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את שברי בתקשורת השלם MEGM. הרקמה ניתן לאחסן במצב זה עד 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור את ג'ל קולגן, על תמהיל קולגן קרח 1mg/ml זנב חולדה, 1:1000 חומצה אצטית מסונן, DMEM/F12 10x ו 0.22M NaOH ביחס של 3:5:1:1 ליצירת קולגן הריכוז הסופי של 0.3 מ"ג / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 1.2ml של תערובת קולגן לתוך בארות בודדים של צלחת 24 היטב לתוך מקום באינקובטור ב 37 מעלות 10min ליזום gelling. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10min, הסר את צלחת גם 24 מתוך החממה. מניחים את חתיכות הגידול על הקולגן gelling בעדינות לדחוף אותם אל מרכז ג'ל באמצעות קצה 10μl פיפטה. מחזירים את הצלחת היטב 24 את החממה עבור 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ER + גידולים, תוספת התקשורת השלם MEGM עם β-oestradiol ריכוז של 3.2x10 -10 מ ' לאחר מבחני ג'ל יש בג'ל עבור 1 שעות, בזהירות להציג 1.2ml של התקשורת השלים לבאר כל אחד. הריכוז הסופי β-oestradiol בתוך assay יהיה equilibriate ל -10 1.6x10 M לשחזר את רמות האסטרוגן פיזיולוגיים למצוא רקמת השד 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל טיפ פיפטה 10μl מסביב לקצה הפנימי של כל טוב, שחרור כל ג'ל circumferentially, ובכך מאפשר ג'ל כל לצוף בחופשיות בתוך התקשורת. מחזירים את הצלחת היטב 24 אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שערי בתוספת התקשורת פעמיים בשבוע עד תום הניסוי. לסיים את הניסוי על ידי הסרת התקשורת והוספת מקבע פורמלין. </li></ol> 3. נוגדן מכתים של Assay לקראת הקרנת טומוגרפיה אופטית אימצנו שיטה שפורסמו בעבר עבור כל דגימה 4 מכתים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קבוע דגימות בפורמלין עבור 30 דקות ב-PBS. מייבשים את הג'לים בשלבים של מתאנול מדולל PBS המכיל 0.05% Tween 20 (0.05% PBST): 33%, 66% ו 100% ≥ 15min בכל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמות MeOH מוכן טרי: DMSO: 30% H 2 O 2 ביחס של 02:01:03 (15% v / v H 2 O 2) בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות כדי לכבות את autofluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות פעמיים בתוך 30 דקות מתנול. להקפיא את דגימות -80 ° C חמש פעמים לפחות 1 שעות בכל פעם בחזרה לטמפרטורת החדר (RT) על מנת להבטיח כי אנטיגנים בחלקים עמוקים יותר של רקמת ניתנים נגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם רקמת חזרה PBST 0.05% עם מתנול כפי diluent (33%, 66% ו -100% עבור 15min בכל שלב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הרקמה חוסמים פתרון (10% בסרום PBST 0.05%) עבור 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמה עם נוגדן ראשוני לזהות את התוכן אפיתל, באמצעות ארנבת אנטי cytokeratin בריכוז של 1:500 מדולל 1.5ml של פתרון חסימת המכילה DMSO 5% 48hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות ארבע פעמים עם PBST 0.05% עבור כל 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמה עם נוגדן פלואורסצנטי משני (1:100 עיזים נגד ארנב Alexa555), בדילול מלא בתמיסה המכילה DMSO חסימת 1.5ml 5% 48hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את דגימות שוב עם 0.05% ארבע פעמים PBST עבור 30 דקות כל אחד. </li></ol> 4. הקרנה אופטי טומוגרפיה טומוגרפיה הקרנה אופטית היא טכניקה מיקרוסקופיה שפותחה בעבר כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה 3D של דגימות ביולוגיות ניאון עם עובי של עד 15 מ"מ 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר יםג'ל מזרקת ב 1% נקודת התכה נמוכה agarose ו מייבשים מתנול ב 100% עבור 24 שעות. נקה את הדגימה ב באב פתרון (01:02 בנזיל אלכוהול, בנזיל בנזואט) עבור 48hr ולסרוק בעזרת סורק הכבושים 3001M (Bioptonics). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני היעד autofluorescence נלכדים באמצעות מערכת Cy3 המסנן (exciter 545nm/30 ננומטר, פולט 610/75 ננומטר) GFP1 להגדיר מסנן (exciter 425nm/40 ננומטר, LP475 ננומטר פולט) בהתאמה. </li></ol> 5. שחזור וכימות 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט התחזיות זוויתיים נרכשה על ידי הכבושים ניתן לשחזר באמצעות תוכנה NRecon (SkyScan) כדי ליצור סדרה של פרוסות חתך דרך assay את הפלישה. תוכנה זו זמינה להורדה בחינם ב <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הנתונים מחדש באמצעות תוכנת Volocity (PerkinElmer). תוכנות הדגמה חינם זמין להורדה ב <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לכמת נפח אפיתל על ידי מכתים cytokeratin, להגדיר voxel מינימום עוצמת סף להפחית מהפרעות הקרינה רקע בערוץ היעד. הגדרנו את זה באופן אמפירי על סף 9000 au באמצעות רשימה של פרמטרים זמינים יישום המדידה, אנו לכמת את עוצמת הקול של אפיתל ברצף עם ליבת המקורי (התחום בערוץ autofluorescent). זו אפשרה לנו לכמת כרכים של תולדה אפיתל בין שונים הגידול דגימות. </li></ol> 6. נציג תוצאות: במהלך הפיתוח של assay, סך של סרטן השד 52 דגימות ביופסיה עם מגוון רחב של histopathology כבר בשימוש. מבין אלה &lt;10% (5 / 52) לא הצליחו לספק לפחות אחד assay הפלישה קיימא. הכישלון נבע Assay או חיידקי העל זיהום או מספיק חומר ביופסיה הגידול. לכן הבקשה של assay אינו מוגבל תת סוג מסוים של סרטן השד. מבחני טיפוסית (איור 1) לאחר 20 ימים קבוע בתרבות קולגן מוכתם לאחר מכן עבור cytokeratin. תוכנה Volocity הוא מסוגל לזהות גם את עיקר אפיתל רציפה עם ליבת המקורי קבוצות מנותקים פולשים לתאים ולכמת כל כרך בנפרד. <img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הפלישה מבחני הבאים קיבעון וכימות. Assay תומכת דגימות שהתקבלו תת סרטן השד מרובות: א) ER + b) HER2 + ג) ER-.

<ol><li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+precursors+revisited%3A+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li>
<li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li>
<li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+on+the+HER2+amplicon%2C+C35%2C+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
</ol>

לתפור JF מועסקים על ידי MRC טכנולוגיה, המהווה מסחור Bioptonics סורקים הכבושים. מחברים אחרים מצהירים שום ניגוד עניינים.

קולגן מבוססי מבחני ללמוד את ההתנהגות של שורות תאים סרטניים נמצאים כעת בשימוש נרחב 6,7,8. עם זאת, מבחני אלה לא בא לידי ביטוי במורכבות מלאה של הגידול וסביבתו. במחקר זה, אנו מראים כי חומרים סרטן השד אנושי יכול לשמש באופן דומה, לשעבר vivo. יתר על כן, הפלסטינים הכבושים הוא כלי שימושי כדי לאפיין את התפשטות 3D של סרטן השד. מצאנו כי המגבלה העיקרית של הטכניקה הזו הוא הזמינות של חומרים הגידול (יחיד הליבה ביופסיה מספיק עבור מבחני 4-6). גורם נוסף המגביל הוא כי הפלישה מבניים מתרחשת רק כ -40% של מבחני. כדי להתגבר על זה, אנחנו באופן קבוע להוסיף כל טיפול הרצוי סביב יום 7 לכל מבחני עם צמיחה גלוי. השימוש של השטחים הכבושים ניתן יהיה להרחיב בעתיד גם לזהות שינויים בתפזורת, vivo לשעבר, הנובע טיפול תרופתי. זה בתורו יכול להקל בטיפול בסרטן פרטנית יותר, עצמאיים של מודלים של בעלי חיים. כרגע אנחנו בוחנים את התגובה של ER + גידולים vivo לשעבר טמוקסיפן.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> השלם MEGM </td><td> Lonza </td><td> CC-3150 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D8900 10X1L </td></tr><tr><td> β-oestradiol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E8875-טבליות של 250 </td></tr><tr><td> הארנב נגד cytokeratin </td><td> Dako </td><td> Z0622 </td></tr><tr><td> עיזים נגד ארנב Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr></tbody></table> ריאגנטים כל תקן אחרים התקבלו סיגמא אולדריץ.

לטווח ארוך של תרבות האדם סרטן השד דוגמאות וניתוח שלהם באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

סרטן השד הוא הגורם המוביל לתמותה בעולם המערבי. היא מבוססת היטב כי התפשטות של סרטן השד, תחילה מקומית ולאחר מכן distally, היא גורם מרכזי פרוגנוזה המטופל. מערכות ניסיוני של סרטן השד מסתמכים על שורות תאים שמקורם בדרך כלל גידולים ראשוניים או השתפכויות פלאורלי. שני המכשולים העיקריים המעכבים את המחקר הזה: (i) ידוע כמה תתי סוגים של סרטן השד (בעיקר העניים luminal הפרוגנוזה גידולים B) אינם מיוצגים בתוך אוספים הקו הנוכחי (ii) את ההשפעה של microenvironment הגידול לא נלקח כלל בחשבון. אנו להפגין טכניקה ראשונית תרבות סרטן השד דגימות של כל סוגי המשנה. זו מושגת על ידי שימוש תלת ממדי (3D) מערכת התרבות שבה חתיכות קטנות של גידולים המוטבעים קולגן עכברוש רך אני כריות. בתוך 2-3 שבועות, בתאי הגידול התפשט לתוך קולגן ויוצרים מבנים שונים הדומים לאלו שנצפו tumours1 האדם. Adipocytes קיימא, תאים אפיתל fibroblasts בתוך הליבה המקורית ניכרו על היסטולוגיה. תאים אפיתל ממאירים עם מורפולוגיה squamoid היו הפגינו הפולש לתוך קולגן שמסביב. Pleomorphism גרעיני ניכרה בתוך תאים אלה, יחד עם דמויות mitotic גופים אפופטוטיים. יש לנו תחזית המועסקים טומוגרפיה אופטית (הכבושים), טכנולוגיית הדמיה 3D, על מנת לכמת את מידת התפשטות הגידול בתרבות. השתמשנו הכבושים כדי למדוד את נפח עיקר הגידול תרבות, פרמטר נמדד באופן שגרתי במהלך טיפול ניאו אדג&#39;ובנטי של חולות סרטן השד על מנת להעריך תגובה לטיפול תרופתי. כאן, אנו מציגים הזדמנות גידולים התרבות האנושית השד ללא משוא פנים תת סוג ולכמת את התפשטות vivo אלה לשעבר. שיטה זו יכולה לשמש בעתיד כדי לכמת את רגישות התרופה בגידול המקורי. זו עשויה לספק מודל החיזוי יותר שורות תאים המשמשים כיום.

פיתחנו מבוססי קולגן<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay המקדמת התפשטות ופלישה דגימות של כל תת סרטן השד. טומוגרפיה הקרנה אופטית, טכניקה three מיקרוסקופיה ממדי נוצל כדי לחזות ולכמת התפשטות הגידול. Assay זה עשוי לשמש לכמת תגובה התרופה של דגימות גידולים בודדים.

סרטן השאירה הוא סיבה מרכזית לתחלואה בעולם המערבי. ידוע כי התפשטות של סרטן השאירה, תחילה באופן מקומי ומאוחר יותר...

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור תרבית ארוכת טווח של רקמת סרטן שד ראשונית, ולכמת את דפוס הצמיחה התלת-ממדי. דבר זה מושג תחילה על ידי מיצוי קולגן מסוג 1 מזנבות של חולדות. לאחר מכן, דגימת הביופסיה הסרטנית מוכנה ומוטמעת בתוך מטריצת הקולגן.לאחר 20 ימים בתרבית, רקמת סרטן השד נצבעת בשיטת אימונופלואורסצנציה ונסרקת באמצעות טומוגרפיה של השלכה אופטית (optical projection tomography), ולאחר מכן הנתונים משוחזרים ונמדדים כמותית. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את דפוס הפלישה של הגידול של הפרט, אשר ניתן למדוד כמותית באופן נוסף באמצעות ניתוח תלת-ממדי. היתרון המרכזי של תרביות ex vivo הוא השימוש בחומרי סרטן אמיתיים בהקשר פיזיולוגי.בניגוד לתרביות של שורות תאים, הדגמה ויזואלית של טכניקה זו היא חשובה, מכיוון שקשה להשיג רקמת סרטן ראשונית. הטכניקה הנכונה תמקסם את הסיכויים לתוצאה ניסיונית מוצלחת. את הטכניקה זו אדגים אני ו-Joanne Farrell מ-MRC Technology, כדי להתחיל במיצוי קולגן מסוג 1.הניחו זנבות חולדה קפואים ב-70% ethanol עד להפשרה. בעזרת סקלפל, הסירו את העור העוטף כדי לחשוף את הגידים, הפרידו את הגידים מהזנב והניחו אותם ב-70% ethanol לסטריליזציה. שקלו את הגידים שנאספו והעבירו אותם לחומצה אצטית.ערבבו למשך 48 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סבבו במערך צנטריפוגה את תערובת הגיד וחומצה האצטית ב-10,000 ×g למשך 30 דקות והשליכו את המשקע.הוסיפו נפח שווה של 10% sodium chloride למשקע ה-S והניחו לתערובת לעמוד למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. שאבו והשליכו את השכבה העליונה. לאחר מכן, אספו את השכבה התחתונה הבל-ממיסה העשירה בקולגן וסובבו בצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-10,000 ×g.לאחר מכן, השהה את החומר העשיר בקולגן בסינון בכבידה, השהה אותו מחדש בתוך חומצה אצטית 0.25 molar בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס והעבר אותו באמצעות פיפט לשקית דיאליזה. בצע דיאליזה אל מול חומצה אצטית 1:1000 בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים.החלפת תמיסת הדיאליזה פעמיים ביום. ניתן לעקר את הקולגן עוד יותר באמצעות שלב צנטריפוגה נוסף וסספנסיון מחדש בחומצה אצטית עבור בדיסה זו. התחל עם מספר ביופסיות ליבה שנלקחו ממטופלים שהסכימו לכך בזמן כריתה כירורגית ריפואית לסרטן שד פולשני, באופן ויזואלי ובאמצעות סקלפל.חלק את הרקמה למקטעים של מילימטר מעוקב אחד, גזום והסר כל שומן הנראה באופן מקרוסקופי. הצמדת הדגימה ללהב סכין מנתחים מאפשרת ויזואליזציה טובה יותר בתוך המנדף והופכת את הדיסקציה למדויקת ובטוחה יותר. טבול את המקטעים במצע MEGM מלא.ניתן לאחסן את הרקמה במצב זה למשך עד שעה כדי להכין תערובת ג'ל קולגן בריכוז 0.3 milligrams per milliliter על קרח, הכוללת one milligram per milliliter של קולגן מזנב חולדה, acetic acid מסונן בריכוז 1:1000, DMEM/F-12 מדולל פי 10 ו-sodium hydroxide בריכוז 0.22 molar. העבירו באמצעות פיפט 1.2 milliliters של תערובת הקולגן לבארים בודדות בלוח 24 בארות והכניסו לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 10 דקות. כדי להתחיל את תהליך הג'לציה, הוציאו את הלוח מהאינקובטור.הניחו את חתיכות הגידול על הקולגן המתגבש והשתמשו בקצה פ pipette של 10 µL כדי לדחוף אותן בעדינות למרכז הג'ל. החזירו את הפלטה לאנקובטור למשך שעה אחת. המסיפו למצע A-M-E-G-M מלא beta estradiol עד לריכוז סופי של 3.2 × 10⁻¹⁰ M.לאחר שדגימות הג'ל עברו אינקובציה במשך שעה אחת, הכניסו בזהירות 1.2 milliliters של המצע המועשר לכל באר. ריכוז ה-beta estradiol הסופי יתאזן ל-1.6 times 10 to the minus 10 molar כדי לשחזר רמות אסטרוגן פיזיולוגיות הנמצאות ברקמת שד. העבירו קצה של פיפט של 10 microliter מסביב לקצה הפנימי של כל באר כדי לשחרר כל ג'ל היקפית, ובכך לאפשר לכל ג'ל לצוף בחופשיות בתוך המצע.החזירו את פלטת 24 הבארים למדגרה והחליפו את המצע המועשר פעמיים בשבוע עד לסיום הניסוי. ניתן לצפות בצמיחה פולשנית בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. סרטון בעל עומק מיקוד מורחב בצילום עם השהיית זמן מדגים פלישה של אפיתל מקצה הגידול אל הקולגן שסביבו לאורך 60 שעות, מהיום השביעי עד התשיעי.סיימו את הניסוי על ידי הסרת המצע והוסיפו פורמלין למשך 48 שעות לקיבוע דגימות המערך התלת-ממדי לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית עבור טומוגרפיה של הקרנה אופטית. ראשית, העבירו את הדגימות המקובעות בפורמלין מהבארים לא vial.לאחר מכן, שטפו אותם למשך 30 דקות. ב-PBS בצעו דהידרציה מדורגת של הג'לים באמצעות מתנול מהול ב-PBS המכיל 0.05% Tween 20, דגרו את הרקמה במתנול, DMSO ומי חמצן 30% שהוכנו טריים ביחס של שתיים לאחת לשלוש בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות כדי להשקיט את האוטופלואורסצנציה. לאחר מכן, שטפו את הדגימות פעמיים למשך 30 דקות.במתנול, בצעו הפשרה והקפאה למדגמים ממינוס 80 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר חמש פעמים, למשך שעה אחת לפחות בכל פעם, כדי להבטיח שהאנטיגנים בחלקים העמוקים של הרקמה יהיו נגישים. לאחר מכן, בצעו רהידרטציה לרקמה חזרה ל-PBS עם 0.05%T בין 20 תוך שימוש במתנול כמדלל, הדגרו את הרקמה בתמיסת חסימה למשך 24 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי לזהות תוכן אפיתליאלי, והדגרו את המדגמים עם נוגדנים ראשוניים מסוג rabbit anti cytokeratin המדוללים ב-1.5 milliliters של תמיסת חסימה עם 5%DMSO למשך 48 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שטפו את המדגמים ב-PBS עם 0.05%T בין 24 פעמים למשך 30 דקות בכל פעם.דגרו את הרקמה בנוגדנים שניוניים פלואורסצנטיים, המדוללים ב-1.5 milliliters של תמיסת חסימה המכילה 5%DMSO, למשך 48 שעות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. שטפו את הדגימות שוב ב-PBS עם 0.05% כ-24 פעמים, למשך 30 דקות בכל פעם. להכנת הדגימות עבור טומוגרפיית הקרנה אופטית, רכבו את ג'ל הצביעה ב-1%low melting point aase ובצעו דהידרציה ב-100%methanol למשך 24 שעות.לאחר מכן, בצעו שקיפות של הדגימה בתוך תמיסת BABB למשך 48 שעות. סרקו את הדגימות באמצעות סורק OPT 3001 M. הן היעד והן הפלואורסצנציה העצמית נלכדים באמצעות מערכות המסננים SI three ו-GFP one בהתאמה.הדגימה נתמכת בצילינדר שקוף של aero gel ומסובבת בצעדים זוויתיים של 0.9 מעלות. תמונה דיגיטלית של הדגימה הסטטית נלקחת בכל אחת מ-400 התנוחות המסובבות. השתמש בתוכנת n recon כדי לשחזר את קבוצת ההקרנות הזוויתיות שנרכשו ב-OPT על ידי יצירת סדרה של חתכי רוחב דרך בדיקת הפלישה.נתחו את הנתונים השחזורים באמצעות תוכנת velocity כדי לכמת את נפח האפיתל לפי צביעת cytokeratin. הגדירו סף מינימלי לעוצמת הווקסל כדי להפחית הפרעות מפלואורסצנציית רקע בערוץ היעד. סף זה מוגדר באופן אמפירי ב-9,000 arbitrary units.לבסוף, השתמש ברשימת הפרמטרים הזמינים באפליקציית המדידה ובנתונים מערוץ האוטופלואורסצנציה (Autofluorescent), המגדירים את האפיתל הרציף לליבה המקורית, כדי לכמת את נפח האפיתל בצמיחת גידול. כאן מוצג בדיקה טיפית שקובעה לאחר 20 ימים בתרבית קולגן ונצבעה לאחר מכן לציטוקרטין. תוכנת Velocity מסוגלת לזהות הן את מסת האפיתל הרציפה לליבה המקורית והן קבוצות מנותקות של תאים פולשים, ולכמת כל נפח בנפרד.הביופסיות המקוריות שהושגו הגיעו ממגוון גידולים לאחר תרבויות ex Vivi. ניתן להשתמש גם בטכניקות אחרות, כגון אימונוהיסטוכימיה או אימונופלואורסצנציה, כדי לקבוע שיעורי פרוליפרציה או אפופטוזה או כל מדד דומה. פיתוח טכניקה זו אפשר לחוקרים בתחום מחקר סרטן השד התרגומי לבחון שיטות לזיהוי עמידות לתרופות בקרב חולי סרטן השד.

long-term-culture-human-breast-cancer-specimens-their-analysis-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: }Huang, Y. et. al.,, ניטור מורפולוגי ופיזיולוגי אורכי של ספרואידים תלת-ממדיים של גידול באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. J. Exp. (2019)}{{}}} סרטון זה מדגים את השימוש בקוהרנטיות אופטית טומוגרפיה (OCT) לניטור ספרואידים של גידול בצלחת מרובת בארות על ידי לכידת תמונות חתך ברזולוציה גבוהה. על ידי ניתוח השתקפויות אור ממבנים תאיים, OCT בונה מודלים תלת מימדיים כדי להעריך תכונות מורפולוגיות כמו גודל וצורה תוך הבחנה בין תאים ברי קיימא לתאים שאינם ברי קיימא על סמך שינויים בפיזור האור לאורך זמן.

ניטור מורפולוגי ופיזיולוגי של ספרואידים גידוליים באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית 

המוני רקמות מורכבים, מאיברים לגידולים, מורכבים מאלמנטים הסלולר שונים. אנו הובהר התרומה של פנוטיפים הסלולר בתוך רקמת ניצול עכברים הטרנסגניים ניאון רב שכותרתו בשילוב עם מכתים immunofluorescent multiparameter אחרי unmixing רפאים לפענח מוצא תא, כמו גם מאפייני תא המבוססים על ביטוי חלבון.

כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

ניתוח Ex vivo של נגעים עורקיים ממודלים של בעלי חיים של מחלות לב וכלי דם מסתמך באופן קלאסי על טכניקות היסטולוגיות ואימונוהיסטוכימיות. אלה מספקים מדידות דו-ממדיות בנגעים תלת מימדיים. כתב יד זה מתאר יצירת נגעים עורקיים לניתוח כמותי בתלת מימד באמצעות טומוגרפיה של הקרנה אופטית.

דור וQuantitation 3 ממדים של עורקי פצעים בעכברים באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית

שלוש תרבות ממדית של תאי אפיתל החלב בקרום במרתף מחדש היא שיטה שימושית לשחזר את ארכיטקטורת vivo של השד השפיר, וכדי לבדל את הפנוטיפ הממאיר מפנוטיפ שפיר בשד. חשוב מכך, מערכת זו יכולה להיות מיושמת ללמוד קרצינומות פולשני ברקמות אחרות.

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

פרוטוקולים מתוארים ללימוד הגירה של תאי סרטן השד, התפשטות והתנחלות במערכת מודל explant רקמת עצם אנושית.

שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר), טכנולוגיה הדמיה תלת-ממדית, שימש כדי לפקח, לאפיין את קינטיקה גידול של הגידול multicellular spheroids. כימות הנפחי מדויק של גידול spheroids באמצעות voxel של סופרים ושל הרקמה המתה ללא תווית זיהוי spheroids מבוסס על ניגוד מהותי הנחתה אופטי, היו הדגים.

האורך פיזיולוגיים מורפולוגיים ניטור של Spheroids תלת מימדי הגידול באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

תרבויות תלת ממדיות של החולה BMPC דגימות ו xenografts של סרטן הערמונית גרורתי העצם לשמור על טרוגניות תפקודית של גידולים המקורי שלהם וכתוצאה מכך ציסטות, spheroids ו מורכבים, גידול כמו אורגנואידים. כתב יד זה מספק אסטרטגיה מיטוב ופרוטוקול לתרבות תלת-ממדית של מטופלים הטרוגנית דגימות נגזרות והניתוח שלהם באמצעות IFC.

הקמה וניתוח של תלת מימדי (3D) אורגנואידים נגזר החולה סרטן הערמונית העצם גרורות דגימות ושתלי Xenografts להם

אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) הם כלי רב עוצמה בחקר הסרטן התרגומי, המשקף הן את ההטרוגניות הגנטית והן את ההטרוגניות הפנוטיפית של המחלה ואת התגובה לטיפולים אנטי-סרטניים מותאמים אישית. כאן מפורט פרוטוקול מאוחד ליצירת PDOs ראשוניים של סרטן שלפוחית השתן האנושית כהכנה להערכת ניתוחים פנוטיפיים ותגובות לתרופות.

תרבית של אורגנואידים של סרטן שלפוחית השתן ככלי רפואה מדויקת

אנו מתארים פרוטוקול לייצור, תרבות והדמיה של סוגי סרטן אנושיים, אשר שלחו גרורות למשטחי הצפק. דגימות גידול שנכרתו נחתכות באמצעות ויברטומה ומתורבתות על תוספות חדירות להגברת החמצון והכדאיות, ולאחר מכן הדמיה וניתוח במורד הזרם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי וציטומטריית זרימה.

תרבית והדמיה של פרוסות גידול Pseudomyxoma peritonei אורגנוטיפיות Ex vivo מדגימות גידול אנושי מנותחות

פרוטוקול מפורט מסופק כאן לקביעת אורגנואידי שד אנושיים מכריתות גידולי שד שמקורם במטופל או מרקמת שד רגילה. הפרוטוקול מספק הוראות מקיפות שלב אחר שלב לגידול, הקפאה והפשרה של אורגנואידי שד אנושיים שמקורם במטופלות.

הקמה ותרבות של אורגנואידי שד שמקורם במטופל

פרוטוקול זה מציע מסגרת שיטתית להקמת אורגנואידים של סרטן השחלות משלבי מחלה שונים ונותן מענה לאתגרים של שונות ספציפית למטופלת כדי להגדיל את התשואה ולאפשר התרחבות חזקה לטווח ארוך ליישומים הבאים. הוא כולל שלבים מפורטים לעיבוד רקמות, זריעה, התאמת דרישות מדיה וצביעה אימונופלואורסצנטית.

אסטרטגיה לביו-בנקאות של אורגנואידים של סרטן השחלות: טיפול בהטרוגניות הבין-אשפוזית על פני תת-סוגים היסטולוגיים ושלבי מחלה

למד שיטה לתרבית ארוכת טווח של דגימות סרטן שד אנושי וניתוחן באמצעות טומוגרפיית הקרנה אופטית. השיטה מאפשרת כימות תבניות גדילה תלת-ממדיות והערכת תגובה לתרופות בדגימות גידול יחידניות.

לטווח ארוך של תרבות האדם סרטן השד דוגמאות וניתוח שלהם באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית

גלה סרטונים נוספים