כימות פעילות אגוניסט ב G-חלבון יחד רצפטורים
26 בדצמבר 2011
שיטה להערכת הזיקה המתמדת של אגוניסט למדינה פעיל ( K) של קולטני G-חלבון בשילוב מתואר. הניתוח מספק אמצעים מוחלט או יחסי של K תלוי אם הפעלת קולטן המכונן הוא מדיד. השיטה שלנו חל במורד התגובות השונות של הפעלת הקולטן.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את קבוע הזיקה היחסי KB של אגוניסט למצב הפעיל של רצפטור, באמצעות ניתוח של עקומת התגובה לריכוזו. הדבר משיג תחילה על ידי מדידת עקומות התגובה לריכוז של קבוצת אגוניסטים המעוררים תגובה ברצפטור המצומד לחלבון G. השלב הבא של הפרוצדורה הוא הערכת ערכי ה-eemax וה-EC 50 של האגוניסטים באמצעות ניתוח רגרסיה לא-ליניארית.
ערכים אלה משמשים לאחר מכן לחישוב הערכות פרמטרים ראשוניות עבור ניתוח רגרסיה לא-ליניארית עוקב המערב את המודל האופרציונלי. כשלב סופי, השגות יחסיות של קבועי זיקה (affinity constants) של אגוניסטים למצב הפעיל של הרצפטור מתקבלות באמצעות ניתוח רגרסיה לא-ליניארית גלובלי של עקומות התגובה לריכוז שלהם. לבסוף, באמצעות שימוש בצורה משונה של המודל האופרציונלי, ניתן להעריך את קבוע הזיקה של אגוניסט למצב הפעיל של רצפטור ביחס לזה של אגוניסט אחר, וזאת באמצעות ניתוח רגרסיה לא-ליניארית גלובלי של עקומות התגובה לריכוז שלהם.
שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום גילוי התרופות, כגון האם לאגוניסט יש סלקטיביות למסלול איתות ספציפי? באופן כללי, אנשים שאינם בקיים בשיטה זו יתקשרו בשל פרטי הניתוח המתמטי. לצורך הערכת ערכי KB יחסיים של אגוניסט, נדרשת סדרה של לפחות שתי עקומות תגובה לריכוז אגוניסט.
דיון בשיקולים לניסויים אלו ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב. לאחר קבלת עקומות התגובה, הפחיתו מהתגובה שנמדדה בנוכחות כל ריכוז של אגוניסט את התגובה הבסיסית, והתחילו להזין את הנתונים מניסויי התגובה לריכוז לתוך טבלת נתונים. בתוכנת Prism, כל ריכוזי הלוג של האגוניסט מוזנים תחת העמודה המסומנת X. מדידות התגובה עבור האגוניסט שנראה כי הוא בעל התגובה המקסימלית הגדולה ביותר או ערך eax הגבוה ביותר מוזנות לעמודה A, ואלו של אגוניסטים אחרים מוזנות לעמודות סמוכות המסומנות באותיות.
הזינו מדידות חוזרות של עקומות תגובת ריכוז לתתי-עמודות של עמודה מסומנת באות נתונה. בחרו את גיליון הגרף שבו מופיעים הנתונים ובחרו ב-analyze כדי לנתח את הנתונים באמצעות אנליזה של רגרסיה לא-ליניארית תוך שימוש במשוואת שיפוע משתנה, הגבילו את הפרמטר bottom לאפס ובצעו את אנליזת הרגרסיה. רשמו את הפרמטרים top ו-log EC 50 לצורך חישוב הערכות הפרמטרים הראשוניות.
כדי לחשב את הערכות הפרמטרים הראשוניות, השאיע את ערך ה-log tau K הנצפה לערך ה-negative log EC 50 של האגוניסט הסטנדרטי. לאחר מכן, חשב את ערך ה-log RAI של כל אגוניסט נבדק כלוגריתם של הכמות המורכבת ממכפלת ערך ה-eemax של האגוניסט הנבדק ב-EC 50 של האגוניסט הסטנדרטי, חלקי מכפלת ערך ה-emax של האגוניסט הסטנדרטי ב-EEC 50 של האגוניסט הנבדק. במשוואה זו, הפרמטרים של האגוניסט הסטנדרטי מסומנים בגרש.
לאחר מכן, הגדירו את קבוע זיפות הלוגריתמי של האגוניסט הנבדק כערך הלוגריתם השלילי של ערכי ה-EC המתאימים להם. לאחר הזנת הנתונים ל-Prism, ודאו שהנתונים עבור האגוניסט בעל ערך ה-EMAX הגבוה ביותר הוזנו בעמודה A. אגוניסט זה יוגדר כעת כסטנדרט, בעוד ששאר האגוניסטים יוגדרו כאגוניסטים נבדקים. לאחר מכן, הזינו ל-Prism משוואה מוגדרת-משתמש log, RAI על פני מספר שורות.
במקרה זה, המשוואה שהוגדרה על ידי המשתמש כוללת סך הכל חמישה אגוניסטים. הזן את הערכות הפרמטרים הראשוניות של lock R ואת קבועי הזיקה של האגוניסטים הנבדקים. ל-M sis מוקצה ערך ה-EMAX של האגוניסט הסטנדרטי, ול-M מוקצה ערך של אחת.
כעת הזינו את הערכות הפרמטרים הראשוניות של ערכי ה-log RAI עבור האגוניסטים שנבדקו. החילו מגבלות פרמטרים על ידי הגבלת log K one לאפס, ועל ידי קביעת ערך משותף ל-log GR, m, sis ו-M עבור כל מערכי הנתונים. לאחר מכן, התניעו את ניתוח הרגרסיה הבלתי-ליניארית.
התוצאות מניבות את ערכי log K הנצפים וערכי log RAI של האגוניסטים שנבדקו; כדי להערכת ערכי KB של אגוניסטים ביחידות מולריות הפוכות מוחלטות, נעשה שימוש במערכי בדיקה in vitro מבוססי תאים המציגים פעילות רספטורית קונסטיטוטיבית. בחרו אגוניסטים ותכננו את הניסוי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. חשבו את הפעילות הרספטורית הקונסטיטוטיבית ואת התגובה לכל ריכוז של אגוניסט כתגובה הנמדדת פחות התגובה הבסיסית בתאים שאינם טרנספקטומים עם הרספטור המוצג כאן; תגובות לאגוניסטים שונים שחושבו באופן זה עבור נתיב סיגנלינג המציג פעילות קונסטיטוטיבית נמוכה מאוד עבור ניתוח ראשוני.
ראשית, הזן את הנתונים ל-prism כפי שמתואר עבור פעילות שאינה קונסטיטיוטיבית. אשר. הזן בנוסף את התגובה שנגרמה על ידי פעילות קונסטיטיוטיבית של הרספטור בעמודות המסומנות באותיות המתאימות, בשורה המתאידה לריכוז אגוניסט לוגריתמי של 20- . כאן מוזן לוגריתם שלילי גדול כדי לקרב את ריכוז האגוניסט לאפס.
נתחו את הנתונים כפי שנעשה קודם לכן, למעט עבור פעילות קונסטיטוטיבית (constitutive activity), שבה יש להגביל את הפרמטר bottom כך שיהיה משותף לכל מערכי הנתונים. רשמו את הפרמטר המשותף וכן את הפרמטרים top ו-log EC עבור כל אגוניסט. לאחר קביעת קבוע זיקת ה-log של האגוניסט הסטנדרטי בניסויים נפרדים, חשבו את ההערכה הראשונית של ערך ה-log K observed עבור כל אגוניסט ניסיוני חלקי, כלוגריתם של הביטוי המורכב מההפרש בין ערך ה-emax של האגוניסט הסטנדרטי לאגוניסט הניסיוני, חלקי המכפלה של ה-EC 50 וההפרש בין ערך ה-eemax של האגוניסט הסטנדרטי לתגובה הקונסטיטוטית.
חשבו את ההערכה הראשונית של log KB עבור כל אגוניסט ואת ההערכה הראשונית של log T cis כדי להעריך את ערכי ה-KB של האגוניסטים. הזינו את הנתונים ל-Prism ולאחר מכן הזינו משוואה מוגדרת-משתמש. הזינו את ה-Log KB ל-Prism במספר שורות כפי שמוצג כאן עבור תנאי של שני אגוניסטים.
בשלב הבא, הזינו את הערכות הפרמטרים הראשוניות על ידי הזנת עמידת האפיניות (affinity stance) של כל אגוניסט. עבור הערכת log T sis, הערכת M sis והערכת M, להערכת M sis ייקבע ערך EMAX של האגוניסט הסטנדרטי, ול-M ייקבע ערך של 1. לבסוף, הזינו את ההערכות הראשוניות של log kb.
החיל את מגבלות הפרמטרים על ידי הגבלת log K one לערכו שנקבע קודם לכן, ועל ידי קביעת ערך משותף עבור log T sis, m sis ו-M לכל מערכי הנתונים. התחל בניתוח רגרסיה לא-ליניארית. התוצאות יספקקו את ה-log KB של האגוניסט הסטנדרטי, את ה-log K שנצפה, ואת ערכי ה-log KB של אגוניסטים חלקיים.
התגובה המקסימלית של המערכת, ערך ה-log T cys עבור קומפלקס הרצפטור החופשי, וגורם שיפוע המתמר במודל האופרציונלי המוצג כאן הם הידרוליזה של פוספואינוזיטיד המושרית על ידי אגוניסטים מוסקריניים בתאי שחלה של המסטר חולדה סינית, המבטאים באופן יציב את הרצפטור המוסקריני M3. עקומות התגובה לריכוז של אגוניסטים מוסקריניים נבחרים נמדדו בסבב בדיקה זה, והנתונים נותחו כפי שמתואר כאן כדי להעריך את ערך ה-KB של כל אגוניסט המבוטא ביחס לזה של Oxotremorine M. העקומות התאורטיות מייצגות את התאמת הריבועים הפחותים של משוואת הרגרסיה לנתונים. הערכות ה-log RAI מוצגות עבור kabale, arecoline, pilocarpine ו-McN-P.
A 3, 4 3. נקבעו ההערכות המתאימות לתגובה המקסימלית של המערכת ולמקדם שיפוע הממיר. כמו כן, נמצאו ערכי ה-log K שנצפו עבור כל אחד מהאגוניסטים המוצגים.
להלן תוצאות של ניסויים על הידרוליזה של פוספואינוזיטוד המופעלת על ידי אגוניסט מוסקריני בתאי HC 2 93. ביטוי יציב של G alpha 15 וביטוי זמני של הקולטן המוסקריני M three גרמו לעלייה בהידרוליזה בסיסית של פוספואינוזיטוד, אשר ייחסה לפעילות קולטן קונסטיטוטיבית. הנתונים נותחו כדי להעריך את ערכי ה-log KB של Oxo Tremaine M ו-MacNeil, A 3 43.
העקומות התאורטיות מייצגות את התאמת הריבועים הפחותים של משוואת הרגרסיה לנתונים. אומדני log KB מוצגים עבור Oxo Tremoring M ו-McNeil, A 3 43. כמו כן, נקבע הערך המוערך של K observed עבור McNeil A 3 43.
ברגע ששולטים בטכניקה זו של ניתוח נתונים, ניתן לבצעה תוך דקות ספורות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להעריך ערכי KB יחסיים ואבסולוטיים מעקומות תגובה לריכוז של אגוניסטים המעוררים תגובה במורד מסלול השליח של קולטן המצומד לחלבון G.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להערכת קבוע זיקה (Kb) של אגוניסט למצב הפעיל של קולטן המצומד לחלבון G. הגישה כוללת ניתוח של עקומות תגובה לרכז כדי להפיק מדדים של Kb.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פרמקולוגיה
- ביוכימיה
רקע
- קולטנים המצומדים לחלבון G ממלאים תפקיד מכריע בשליחון תאי.
- הבנת האינטראקציות בין אגוניסטים לרצפטורים היא חיונית לפיתוח תרופות.
- קבועי זיקה מספקים תובנות לגבי מנגנוני הפעלת קולטנים.
- עקומות תגובה לריכוז הן חיוניות להערכת קבועים אלו.
מטרת המחקר
- להערכת קבוע זיקה יחסי Kb של אגוניסטים למצב הפעיל של רצפטורים.
- לניתוח עקומות תגובה לריכוז עבור אגוניסטים שונים.
- לספק שיטה הניתנת ליישום עבור תגובות רצפטור שונות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מדידה של עקומות תגובה לריכוז עבור קבוצה של אגוניסטים.
- הערכת ערכי Eemax ו-EC50 באמצעות ניתוח רגרסיה לא-לינארית.
- חישוב הערכות פרמטרים ראשוניות עבור ניתוח מודל תפעולי.
- ניתוח רגרסיה לא-לינארית גלובלי לקבלת הערכות יחסיות של קבועי זיקה.
תוצאות עיקריות
- הערכה מוצלחת של Kb עבור אגוניסטים שונים.
- הדגמת הישימות של השיטה עבור סוגי רצפטורים שונים.
- אספקת מסגרת לניתוח של הפעלת רצפטורים.
- השגת תובנות לגבי אינטראקציות בין אגוניסטים לרצפטורים.
מסקנות
- השיטה מעריכה ביעילות את קבועי הזיקה של אגוניסטים.
- היא משפרת את ההבנה של דינמיקת הפעלת הקולטנים.
- גישה זו יכולה לסייע בגילוי ופיתוח תרופות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות זיקת האגוניסט למצב הפעיל של GPCRs מאפשר תיקוף מדויק של המטרה והפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות. שיטה זו תומכת בביטחון חיזוי בזיהוי מובילים (leads) על ידי הבחנה בין יעילות האגוניסט לסלקטיביות שלו לאורך מסלולי איתות שונים. היא מסייעת בסינון תיקי פיתוח באמצעות אספקת נתונים כמותיים ברמת הקולטן, המפחיתים את העמימות בהיפותזות מכניסטיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות הערכת זיקת האגוניסט למצב הפעיל של הרצפטור (Kb).
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות השוואה כמותית של אינטראקציות בין אגוניסט לרצפטור.
- ערך חיזוי: מספק הערכות Kb יחסיות ומוחלטות המסייעות בהערכת הביטחון במטרה ובפרופיל הסלקטיביות של המסלול.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מדידות כמותיות של תגובה במורד המערכת (downstream), המאפשרות סטנדרטיזציה של הבדיקה ויכולת שחזור.
- ערך תפעולי: מסייע בהכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות להערכה אמינה של תרכובות על פני פאנלים של אגוניסטים.
- ערך סקילביליות: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה באמצעות רגרסיה לא-ליניארית גלובלית של נתוני תגובה לריכוז.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך תרגומי: תומך בניתוח מערכות רלוונטי למחלה על ידי קישור פעילות אגוניסטית לתפוקות איתות ספציפיות לחלבון G.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר הטיות באיתות והעדפה של מסלולים, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- ערך רצף: מגשר בין זרימות עבודה של גילוי ושלב פרה-קליני באמצעות פרופיל אגוניסטי עקבי וכמותי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד לאפיון פרה-קליני, ובמיוחד עבור תוכניות המכוונות ל-GPCR.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות כימות יעילות האגוניסט ואפיניות למצב הפעיל.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של הבדיקה ויצירת פלט כמותי להשוואת עוצמה ויעילות של אגוניסטים.
- אנליטיקה: מספקת הערכות של Kobs, τ, ו-Kb המאפשרות לצוויות להשוות תנאי אגוניסטים על בסיס פרמטרים מכניסטיים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי אפשור פרופילינג של אגוניסטים סלקטיביים לחלבון G במודלים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת אנליטית לשימוש חוזר לאפיון אגוניסטים במגוון מטרות ופרויקטים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי, תיקוף מטרה, וצמצום עמימות מכנית באינטראקציות בין אגוניסט לרצפטור.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של תהליכי אפיון אגוניסטים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות "המשך/עצור" (go/no-go) משופרת, יעילות הון, וצמצום סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים באמצעות תובנות מוקדמות על יעילות וסלקטיביות.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעוד פריוריטיזציה וקבלת החלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על אפיון אגוניסטי כמותי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח נתונים פרמקולוגיים ובמידול רגרסיה לא ליניארית.
- תלוי במכשור ובתוכנה המסוגלים לבצע רגרסיה לא ליניארית גלובלית (למשל, Prism עם משוואות המוגדרות על ידי המשתמש).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת אגוניסטים, חיסור תגובה בסיסית ופורמטים של הזנת נתונים.
- כולל שיקולי התאמה לרמות משתנות של פעילות קונסטיטוטיבית במערכות קולטנים שונות.
- מוגבל למערכות שבהן ניתן לכמת את התגובה הבאה במגש ולמדוד את הפעילות הבסיסית.
