Name: כימות פעילות אגוניסט ב G-חלבון יחד רצפטורים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: למדו כיצד לכמת את קבוע האפיניות היחסי Kb של אגוניסטים למצב הפעיל של רצפטורים מזווגי G-חלבון באמצעות ניתוח עקומי תגובת ריכוז. שיטה זו מסייעת בפיתוח תרופות ובהבנת מנגנוני הפעלת רצפטורים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים גרנט GM 69829.

<ol><li>Stephenson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+receptor+theory%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A modification of receptor theory.</a> British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).</li>
<li>Furchgott, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+b-haloalkylamines+in+the+differentiation+of+receptors+and+in+the+determination+of+dissociation+constants+of+receptor-agonist+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Drug+Research%22%5BJournal%5D)">The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes.</a> Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).</li>
<li>Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+agonism+and+inverse+agonism+in+functional+assays+with+constitutive+activity%3A+Estimation+of+orthosteric+ligand+affinity+constants+for+active+and+inactive+receptor+states%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).</li>
<li>Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+Agonist+Activity+at+G+Protein-Coupled+Receptors%3A+Analysis+of+M2+Muscarinic+Receptor+Signaling+through+Gi%2Fo%2CGs%2C+and+G15%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).</li>
<li>Black, J. W., Leff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operational+models+of+pharmacological+agonism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+LondonSeries+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Operational models of pharmacological agonism.</a> Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).</li>
<li>Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+relative+microscopic+affinity+constants+of+agonists+for+the+active+state+of+the+receptor+in+functional+studies+on+M2+and+M3+muscarinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors.</a> Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).</li>
<li>Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+adenosine+3%27%3A5%27-cyclic+monophosphate+in+clonal+glial+cells%3A+labeling+of+intracellular+adenine+nucleotides+with+radioactive+adenine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accumulation of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).</li>
<li>Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+amplifies+agonist-dependent+phosphatidylinositol+responses+in+brain+and+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands.</a> Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).</li>
<li>Kendall, D. A., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKendall%2C+DA+%22Methods+in+Neurotransmitter+Receptor+Analysis%22">Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis</a>. , Raven Press. Yamamura, H.I. 68-87 (1990).</li>
<li>Pulido-Rios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitro+Isolated+Tissue+Functional+Muscarinic+Receptor+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays.</a> Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).</li>
<li>Kenakin, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKenakin%2C+T+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22">Current Protocols in Pharmacology</a>. Enna, S. J. , John Wiley & Sons. (2001).</li>
<li>Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((simple+method+for+estimation+of+agonist+activity+at+receptor+subtypes%3A+comparison+of+native+and+cloned+M3+muscarinic+receptors+in+guinea+pig+ileum+and+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).</li>
<li>Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+of+muscarinic+receptor+subtypes+constitutively+activated+by+G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins.</a> Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בגלל השיטה שלנו להערכת RA אני (יחסית לערך K ב) רק דורש מדידת ריכוז בתגובה עקומות אגוניסט, הניתוח שלנו ניתן לעשות זאת בכל עת עקומות אלה נמדדים. אם יום יומית וריאציה בתגובה של הכנת הניסוי (למשל, תאים או רקמות) הוא גדול, מדידות התגובה של עקומת ריכוז כל תשובה יכולה להיות מנורמל יחסית להעריך &quot;למעלה&quot; של אגוניסט הסטנדרט עבור כל יום של הניסוי. הערכה לראש והיכנס EC <su...

כימות פעילות אגוניסט ב g-חלבון יחד רצפטורים

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

כאשר אגוניסט מפעיל אוכלוסייה של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), זה מעורר מסלול איתות זה מגיע לשיאו בתגובה של התא או הרקמה. תהליך זה יכול להיות מנותח ברמה של קולטן יחיד, אוכלוסייה של קולטנים, או תגובה במורד הזרם. כאן אנו מתארים כיצד לנתח את התגובה במורד הזרם כדי לקבל אומדן של הזיקה אגוניסט מתמדת המדינה הפעילה של קולטנים יחיד. רצפטורים להתנהג כמו מתגים quantal כי חלופי בין מדינות פעיל פעיל (איור 1). המצב הפעיל אינטראקציה עם חלבונים ספציפיים G או שותפים איתות אחרים. בהעדר ligands, המדינה לא פעיל השולט. הכריכה של אגוניסט מעלה את ההסתברות כי קולטן יעבור למצב פעיל בגלל זיקה מתמדת למדינת פעיל (K ב) שלו הוא גדול בהרבה מזה של מדינת פעיל (K). סיכום שליציאות אקראיות של כל הקולטנים באוכלוסייה התשואות על רמה קבועה של הפעלת קולטן בזמן. הגומלין של ריכוז של אגוניסט לעורר חצי מקסימלי הפעלת קולטן שווה מתמיד את הזיקה שנצפו (K obs), וכן את החלק היחסי של אגוניסט קולטן מתחמי במצב פעיל מוגדר יעילות (ε) (איור 2). שיטות לניתוח התגובות במורד הזרם של GPCRs פותחו המאפשרים הערכה של K obs ואת היעילות היחסית של 1,2 אגוניסט. בדו&quot;ח זה, אנו מראים כיצד לשנות את הניתוח הזה כדי להעריך את ערך K אגוניסט b ביחס לזה של אגוניסט אחר. עבור מבחני כי התערוכה פעילות המכונן, אנו מראים כיצד להעריך K b ביחידות המוחלט של M -1. השיטה שלנו לניתוח ריכוז בתגובה אגוניסט עקומות 3,4 מורכברגרסיה ליניארית הגלובלית באמצעות מודל מבצעי 5. אנו מתארים הליך באמצעות יישום תוכנה, פריזמה (GraphPad תוכנה, Inc, סן דייגו, קליפורניה). ניתוח התשואות אומדן של המכפלה של K ו obs פרמטר יחסי היעילות (τ). אומדן τK obs של אגוניסט אחד, מחולק כי אחרת, היא מדד יחסי של K b (ע&quot;ר i) 6. במשך כל קולטן מפגין פעילות מכוננת, אפשר להעריך פרמטר יחסי היעילות של קומפלקס הקולטן חינם (τ sys). במקרה זה, הערך של K b אגוניסט שווה τK obs / τ sys 3. השיטה שלנו הוא שימושי לקביעת הסלקטיביות של אגוניסט עבור תת קולטן לכימות אגוניסט קולטן חלבוני איתות דרך שונה G.

שיטה להערכת הזיקה המתמדת של אגוניסט למדינה פעיל (<em&gt; K<subB&gt;</sub</em&gt;) של קולטני G-חלבון בשילוב מתואר. הניתוח מספק אמצעים מוחלט או יחסי של<em&gt; K<subB&gt;</sub</em&gt; תלוי אם הפעלת קולטן המכונן הוא מדיד. השיטה שלנו חל במורד התגובות השונות של הפעלת הקולטן.

כימות פעילות אגוניסט ב G-חלבון יחד רצפטורים

כאשר אגוניסט מפעיל אוכלוסייה של קולטנים המצומדים לחלבון G (GPCRs), הוא מעורר מסלול איתות המגיע לשיאו בתגובת התא...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את קבוע הזיקה היחסי KB של אגוניסט למצב הפעיל של רצפטור, באמצעות ניתוח של עקומת התגובה לריכוזו. הדבר משיג תחילה על ידי מדידת עקומות התגובה לריכוז של קבוצת אגוניסטים המעוררים תגובה ברצפטור המצומד לחלבון G. השלב הבא של הפרוצדורה הוא הערכת ערכי ה-eemax וה-EC 50 של האגוניסטים באמצעות ניתוח רגרסיה לא-ליניארית.ערכים אלה משמשים לאחר מכן לחישוב הערכות פרמטרים ראשוניות עבור ניתוח רגרסיה לא-ליניארית עוקב המערב את המודל האופרציונלי. כשלב סופי, השגות יחסיות של קבועי זיקה (affinity constants) של אגוניסטים למצב הפעיל של הרצפטור מתקבלות באמצעות ניתוח רגרסיה לא-ליניארית גלובלי של עקומות התגובה לריכוז שלהם. לבסוף, באמצעות שימוש בצורה משונה של המודל האופרציונלי, ניתן להעריך את קבוע הזיקה של אגוניסט למצב הפעיל של רצפטור ביחס לזה של אגוניסט אחר, וזאת באמצעות ניתוח רגרסיה לא-ליניארית גלובלי של עקומות התגובה לריכוז שלהם.שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום גילוי התרופות, כגון האם לאגוניסט יש סלקטיביות למסלול איתות ספציפי? באופן כללי, אנשים שאינם בקיים בשיטה זו יתקשרו בשל פרטי הניתוח המתמטי. לצורך הערכת ערכי KB יחסיים של אגוניסט, נדרשת סדרה של לפחות שתי עקומות תגובה לריכוז אגוניסט.דיון בשיקולים לניסויים אלו ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב. לאחר קבלת עקומות התגובה, הפחיתו מהתגובה שנמדדה בנוכחות כל ריכוז של אגוניסט את התגובה הבסיסית, והתחילו להזין את הנתונים מניסויי התגובה לריכוז לתוך טבלת נתונים. בתוכנת Prism, כל ריכוזי הלוג של האגוניסט מוזנים תחת העמודה המסומנת X. מדידות התגובה עבור האגוניסט שנראה כי הוא בעל התגובה המקסימלית הגדולה ביותר או ערך eax הגבוה ביותר מוזנות לעמודה A, ואלו של אגוניסטים אחרים מוזנות לעמודות סמוכות המסומנות באותיות.הזינו מדידות חוזרות של עקומות תגובת ריכוז לתתי-עמודות של עמודה מסומנת באות נתונה. בחרו את גיליון הגרף שבו מופיעים הנתונים ובחרו ב-analyze כדי לנתח את הנתונים באמצעות אנליזה של רגרסיה לא-ליניארית תוך שימוש במשוואת שיפוע משתנה, הגבילו את הפרמטר bottom לאפס ובצעו את אנליזת הרגרסיה. רשמו את הפרמטרים top ו-log EC 50 לצורך חישוב הערכות הפרמטרים הראשוניות.כדי לחשב את הערכות הפרמטרים הראשוניות, השאיע את ערך ה-log tau K הנצפה לערך ה-negative log EC 50 של האגוניסט הסטנדרטי. לאחר מכן, חשב את ערך ה-log RAI של כל אגוניסט נבדק כלוגריתם של הכמות המורכבת ממכפלת ערך ה-eemax של האגוניסט הנבדק ב-EC 50 של האגוניסט הסטנדרטי, חלקי מכפלת ערך ה-emax של האגוניסט הסטנדרטי ב-EEC 50 של האגוניסט הנבדק. במשוואה זו, הפרמטרים של האגוניסט הסטנדרטי מסומנים בגרש.לאחר מכן, הגדירו את קבוע זיפות הלוגריתמי של האגוניסט הנבדק כערך הלוגריתם השלילי של ערכי ה-EC המתאימים להם. לאחר הזנת הנתונים ל-Prism, ודאו שהנתונים עבור האגוניסט בעל ערך ה-EMAX הגבוה ביותר הוזנו בעמודה A. אגוניסט זה יוגדר כעת כסטנדרט, בעוד ששאר האגוניסטים יוגדרו כאגוניסטים נבדקים. לאחר מכן, הזינו ל-Prism משוואה מוגדרת-משתמש log, RAI על פני מספר שורות.במקרה זה, המשוואה שהוגדרה על ידי המשתמש כוללת סך הכל חמישה אגוניסטים. הזן את הערכות הפרמטרים הראשוניות של lock R ואת קבועי הזיקה של האגוניסטים הנבדקים. ל-M sis מוקצה ערך ה-EMAX של האגוניסט הסטנדרטי, ול-M מוקצה ערך של אחת.כעת הזינו את הערכות הפרמטרים הראשוניות של ערכי ה-log RAI עבור האגוניסטים שנבדקו. החילו מגבלות פרמטרים על ידי הגבלת log K one לאפס, ועל ידי קביעת ערך משותף ל-log GR, m, sis ו-M עבור כל מערכי הנתונים. לאחר מכן, התניעו את ניתוח הרגרסיה הבלתי-ליניארית.התוצאות מניבות את ערכי log K הנצפים וערכי log RAI של האגוניסטים שנבדקו; כדי להערכת ערכי KB של אגוניסטים ביחידות מולריות הפוכות מוחלטות, נעשה שימוש במערכי בדיקה in vitro מבוססי תאים המציגים פעילות רספטורית קונסטיטוטיבית. בחרו אגוניסטים ותכננו את הניסוי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. חשבו את הפעילות הרספטורית הקונסטיטוטיבית ואת התגובה לכל ריכוז של אגוניסט כתגובה הנמדדת פחות התגובה הבסיסית בתאים שאינם טרנספקטומים עם הרספטור המוצג כאן; תגובות לאגוניסטים שונים שחושבו באופן זה עבור נתיב סיגנלינג המציג פעילות קונסטיטוטיבית נמוכה מאוד עבור ניתוח ראשוני.ראשית, הזן את הנתונים ל-prism כפי שמתואר עבור פעילות שאינה קונסטיטיוטיבית. אשר. הזן בנוסף את התגובה שנגרמה על ידי פעילות קונסטיטיוטיבית של הרספטור בעמודות המסומנות באותיות המתאימות, בשורה המתאידה לריכוז אגוניסט לוגריתמי של 20- . כאן מוזן לוגריתם שלילי גדול כדי לקרב את ריכוז האגוניסט לאפס.נתחו את הנתונים כפי שנעשה קודם לכן, למעט עבור פעילות קונסטיטוטיבית (constitutive activity), שבה יש להגביל את הפרמטר bottom כך שיהיה משותף לכל מערכי הנתונים. רשמו את הפרמטר המשותף וכן את הפרמטרים top ו-log EC עבור כל אגוניסט. לאחר קביעת קבוע זיקת ה-log של האגוניסט הסטנדרטי בניסויים נפרדים, חשבו את ההערכה הראשונית של ערך ה-log K observed עבור כל אגוניסט ניסיוני חלקי, כלוגריתם של הביטוי המורכב מההפרש בין ערך ה-emax של האגוניסט הסטנדרטי לאגוניסט הניסיוני, חלקי המכפלה של ה-EC 50 וההפרש בין ערך ה-eemax של האגוניסט הסטנדרטי לתגובה הקונסטיטוטית.חשבו את ההערכה הראשונית של log KB עבור כל אגוניסט ואת ההערכה הראשונית של log T cis כדי להעריך את ערכי ה-KB של האגוניסטים. הזינו את הנתונים ל-Prism ולאחר מכן הזינו משוואה מוגדרת-משתמש. הזינו את ה-Log KB ל-Prism במספר שורות כפי שמוצג כאן עבור תנאי של שני אגוניסטים.בשלב הבא, הזינו את הערכות הפרמטרים הראשוניות על ידי הזנת עמידת האפיניות (affinity stance) של כל אגוניסט. עבור הערכת log T sis, הערכת M sis והערכת M, להערכת M sis ייקבע ערך EMAX של האגוניסט הסטנדרטי, ול-M ייקבע ערך של 1. לבסוף, הזינו את ההערכות הראשוניות של log kb.החיל את מגבלות הפרמטרים על ידי הגבלת log K one לערכו שנקבע קודם לכן, ועל ידי קביעת ערך משותף עבור log T sis, m sis ו-M לכל מערכי הנתונים. התחל בניתוח רגרסיה לא-ליניארית. התוצאות יספקקו את ה-log KB של האגוניסט הסטנדרטי, את ה-log K שנצפה, ואת ערכי ה-log KB של אגוניסטים חלקיים.התגובה המקסימלית של המערכת, ערך ה-log T cys עבור קומפלקס הרצפטור החופשי, וגורם שיפוע המתמר במודל האופרציונלי המוצג כאן הם הידרוליזה של פוספואינוזיטיד המושרית על ידי אגוניסטים מוסקריניים בתאי שחלה של המסטר חולדה סינית, המבטאים באופן יציב את הרצפטור המוסקריני M3. עקומות התגובה לריכוז של אגוניסטים מוסקריניים נבחרים נמדדו בסבב בדיקה זה, והנתונים נותחו כפי שמתואר כאן כדי להעריך את ערך ה-KB של כל אגוניסט המבוטא ביחס לזה של Oxotremorine M. העקומות התאורטיות מייצגות את התאמת הריבועים הפחותים של משוואת הרגרסיה לנתונים. הערכות ה-log RAI מוצגות עבור kabale, arecoline, pilocarpine ו-McN-P. A 3, 4 3. נקבעו ההערכות המתאימות לתגובה המקסימלית של המערכת ולמקדם שיפוע הממיר. כמו כן, נמצאו ערכי ה-log K שנצפו עבור כל אחד מהאגוניסטים המוצגים.להלן תוצאות של ניסויים על הידרוליזה של פוספואינוזיטוד המופעלת על ידי אגוניסט מוסקריני בתאי HC 2 93. ביטוי יציב של G alpha 15 וביטוי זמני של הקולטן המוסקריני M three גרמו לעלייה בהידרוליזה בסיסית של פוספואינוזיטוד, אשר ייחסה לפעילות קולטן קונסטיטוטיבית. הנתונים נותחו כדי להעריך את ערכי ה-log KB של Oxo Tremaine M ו-MacNeil, A 3 43.העקומות התאורטיות מייצגות את התאמת הריבועים הפחותים של משוואת הרגרסיה לנתונים. אומדני log KB מוצגים עבור Oxo Tremoring M ו-McNeil, A 3 43. כמו כן, נקבע הערך המוערך של K observed עבור McNeil A 3 43.ברגע ששולטים בטכניקה זו של ניתוח נתונים, ניתן לבצעה תוך דקות ספורות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להעריך ערכי KB יחסיים ואבסולוטיים מעקומות תגובה לריכוז של אגוניסטים המעוררים תגובה במורד מסלול השליח של קולטן המצומד לחלבון G.

quantifying-agonist-activity-at-g-protein-coupled-receptors

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הפעלה מתמדת של תוצאות מעכבות G-חלבון בשילוב קולטנים ברגישות של איתות cyclase adenylyl. כדי לזהות את המסלולים מולקולריים החיוניים, גישות nonbiased נחוצות, עם זאת, אסטרטגיה זו מחייבת הפיתוח של assay רגישות cAMP מבוסס תאים ניתן להרחבה. בזאת, אנו מתארים assay רגישות למולקולה קטנה והקרנת siRNA.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

Guanosine triphosphate (GTP) מחייב הוא אחד האירועים המוקדמים G-Protein-Coupled קולטן (GPCR) ההפעלה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לאפיין באופן פרמקולוגי אינטראקציות ספציפיות GPCR-ligand על ידי ניטור מחייב של אנלוגי GTP, שכותרתו רדיו, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), in תגובה ליגנד של עניין.

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

וזמינותו הסלולר המתוארת נועד לצורך זיהוי הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4)-סוכנים שמעצבת לעכב או לגרות, תחרותי או allosterically, תאיים Ca2 + שחרור שיזם CXCR4 הפעלה.

קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגלות תרכובות פעיל קולטני GABAA , מן הכריכה פיזיולוגיה, פרמקולוגיה.

שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

פרוטוקול זה מדגים הקלטה בזמן אמת של יחסים מינון-תגובה מלאה עבור agonist-המושרה GPCR הפעלה משכבת תא אחת גדל על מיקרואלקטרודה אחת באמצעות תווית ללא מדידות עכבה. ערכת המינון החדשה מגדילה באופן משמעותי את התפוקה ללא הפסד ברזולוציית הזמן.

פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם

בהינתן כי GPCRs הם מטרות druggable אטרקטיבי, gpcr ליגנד הקרנה היא הכרחית ובכך לזיהוי תרכובות עופרת ולמחקרים de aniטיזציה. לקראת מאמצים אלה, אנו מתארים את פרסטו-טנגו, פלטפורמת משאב מקור פתוח המשמש ליצירת פרופיל סימולטני של גיוס β-arrestin2 ארעי ב כ 300 GPCRs באמצעות שיטת העיתונאי מבוסס TEV.

חקירה מקבילה של גיוס β-Arrestin2 עבור ליגיון הקרנה בקנה מידה מוקטן של הסרט באמצעות שיטת הטנגו-פרסטו

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

פותח פרוטוקול משופר לבדיקת ניוד סידן עם תאי אנדותל, המשמש לזיהוי ליגנדות של קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז (PARs). הפרוטוקול החדש מקצר את זמן הבדיקה הכולל ב-90-120 דקות ומניב עקומות ריכוז-תגובה הניתנות לשחזור.

אפיון אפנן קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז עם בדיקת ניוד סידן באמצעות קורא צלחות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בחיישנים ביולוגיים מבוססי BRET למדידה בזמן אמת של הפעלת חלבון G בתאי HEK293 חיים על גירוי ליגנד קולטן מצומד לחלבון G. כאן, קולטן β2-אדרנרגי וקולטן קנבינואיד מסוג 1 משמשים כדוגמאות להדגמת היעילות של חיישנים עבור מספר תת-סוגים של חלבון G ועל פני GPCRs שונים.

חיישנים ביולוגיים של חלבון G מבוססי BRET למדידת פעילות קולטן מצמד חלבון G בתאים חיים

למדו כיצד לכמת את קבוע האפיניות היחסי Kb של אגוניסטים למצב הפעיל של רצפטורים מזווגי G-חלבון באמצעות ניתוח עקומי תגובת ריכוז. שיטה זו מסייעת בפיתוח תרופות ובהבנת מנגנוני הפעלת רצפטורים.

כימות פעילות אגוניסט ב G-חלבון יחד רצפטורים

גלה סרטונים נוספים