מוצק שלב Submonomer סינתזה של פולימרים Peptoid שלהם ואת הרכבה עצמית לתוך מאוד מסודרים Nanosheets

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לתאר שיטה פשוטה ויעילה עבור סינתזת פפטידים במוצק (solid phase peptide synthesis) והרכבה עצמית של פפטידים בתמיסה מימית לננו-גיליונות מסודרים מאוד. פפטידים, הדומים מבנית לפוליפפטידים, הם פולימרים של גליצין מותמר שבהם שרשראות הצד מחוברות לחנקן במקום לפחמן האלפא. התהליך מתחיל בסינתזה של רצף פפטידי ספציפי באמצעות שיטת סב-מונומר אחרת.

שיטת הסב-מונומר מורכבת משני שלבים כימיים פשוטים המכניסים כל מונומר לשרשרת באופן רצפי. ראשית, מתבצע ברומואצטילציה שלומין המחובר לתומך מוצק. שנית, הברומיד מוחלף על ידי אמין ראשוני.

שלבים אלו חוזרים על עצמם עד להשגת אורך השלשלת הרצוי. לאחר הארכת השלשלת, הפפטיד מנותק מהתמיכה המוצקה ושמן הפפטיד הגולמי המתקבל מטוהר באמצעות HPLC ומאופיין כדי להתחיל את ההרכבה העצמית של הפפטידים לננו-גיליונות. תמיסת בופר מימית מדוללת של הפפטיד מוכנת במבחנה מזכוכית ומעורבבת בעדינות. כשלב סופי.

הננו-גיליונות נבחנו תחת מיקרוסקופ. התוצאות מדגימות כי מחזור איטרטיבי של שני שלבים כימיים פשוטים יכול להניב פולימר ספציפי לרצף המרכיב באופן ספונטני ננו-גיליונות. פפטידים הם מחלקה חדשנית של פולימרים בהשראת ביולוגית, בעלי תכונות הנמצאות בין אלו של חלבונים לבין אלו של פולימרים מסורתיים.

פפטידים הם חומרים עמידים ורב-גוניים מבחינה סינתטית בדומה לפולימרים מסורתיים, אך הם גם ניתנים לכוונון גבוה ומספיציפיים לרצף בדומה לחלבונים ו-DNA. פפטידים הופכים לחומר מתקדם לטיפול בבעיות מפתח בביו-רפואה ובמדע החומרים, כגון זיהוי של תרופות ביו-אקטיביות או תכנון של חלבונים מלאכותיים. היתרונות המרכזיים של פפטידים כוללים בקרת רצף מדויקת, זמינות של אבני בניין מגוונות להפליא, סינתזה יעילה ויציבות בפני פרוטאזות. שיטת הסינתזה הידנית הכללית של פפטידים, הכוללת ציוד בסיסי וריאגנטים זמינים מסחרית, מפורטת כאן ומאפשרת סינתזה קלה של פפטידים ברוב המעבדות.

הדגמה חזותית של שלבי הסינתזה היא קריטית ומשמשת כנקודת ייחוס בעלת ערך עבור אנשים הנכנסים לתחום הסינתזה במוצק (solid phase synthesis). כאן, לראשונה, מתוארים תהליכי הטיהור והאפיון של פפטיד אמפיפילי בן 36 מרומרים (36 mers), כמו גם ההרכבה העצמית שלו לננו-גיליונות בעלי סדר גבוה. התחילו פרוטוקול זה בהכנת המערך הניסיוני כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

השלבים הבאים יבוצעו בכלי תגובה מזכוכית במקום במחסנית פוליפרופילן חד-פעמית עם פילטר, וזאת למען הבהירות. לאחר הגדרה של 100 milligrams של שרף R amide בכלי תגובה עם פילטר, נפח את השרף על ידי הוספת two milliliters של dimethyl form amide או DMF; ערבב באמצעות בועות למשך 10 דקות. לאחר מכן, נקה את התמיסה באמצעות ואקום כדי לבודד את השרף הנפוח.

בשלב הבא, הוסף 1 mL של 20% full methyl pyridine ב-DMF כדי להסיר את הגנת קבוצת ה-FM O. ערבב במשך שתי דקות ורוקן. חזור על תהליך זה במשך 12 דקות, ולאחר מכן שטוף את הסורבן על ידי הוספת 2 mL של DMF, ערבוב למשך 15 שניות וריקון.

התחל בגידול שרשרת הפפטיד עם מחזור הסב-מונומר הראשון, הכולל שלב ברומו-אצטילציה ושלב דחיקה. עבור הברומו-אצטילציה, הוסף 1 mL של ברומו-חומצה אצטית 0.6 M ב-DMF ו-86 µL של di isopropyl carbo mite. לאחר ערבוב למשך 30 דקות, רוקן ושטוף עם 2 mL של DMF.

בשלב הבא, בצע דחיקה על ידי הוספת 1 mL של אמין בריכוז 1-2 M בתוך N-methylpyrrolidone (NMP). דגירה למשך 30 עד 120 דקות; לאחר הדגירה, רוקן ושטוף עם 2 mL של DMF. המשך להאריך את שרשרת הפפטיד על ידי חזרה על מחזור הסוב-מונומר. לאחר ביצוע הדחיקה הסופית, שטוף עם 2 mL של DMF.

לאחר מכן, סגור את כלי התגובה באמצעות פקק שטיפת מתאן של diora ואחסן אותו עד לשלב הניתוק. כדי להתחיל את תהליך הניתוק, העבר את כל שרף הניקוי למבחנת זכוכית לסנצילציה בנפח 20 milliliter בעבודה בתוך מסיריח ובשימוש בציוד מגן אישי מתאים. הוסף ארבעה milliliters של חומצה טריפלורואצטית, או תערובת ניתוק TFA, למבחנת הזכוכית לסנצילציה וסגור את הפקק. ערבב בעוצמה למשך 10 דקות עד שעתיים בטמפרטורת החדר.

לחלופין, השתמשו במנער סיבובי (rotary shaker) כדי לערבב את התמיסה. אספו את תמיסת הפירוק ב-TFA על ידי סינון השרף דרך מחסנית פוליפרופילן חד-פעמית עם פילטר (fritted cartridge) אל תוך בקבוק זכוכית לסצינטילציה בנפח 20 milliliter חדש שנשקל מראש. לאחר מכן, הוסיפו one milliliter של תערובת פירוק (cleavage cocktail) טרייה כדי לשטוף את השרף ולאסוף שאריות פפטיד.

חזור על פעולה זו ושטוף פעמיים. אידה את ה-TFA על ידי נשיפת זרם עדין של חנקן או באמצעות biot charge. V 10 evaporator red המס את השמן הגולמי בשישה מיליליטרים של תמיסת אצטוניטריל ומים ביחס של one to one.

לאחר מכן הקפיאו ועבדו את הדגימה בליופיליזציה. יש לחזור על תהליך זה פעם נוספת לאחר הליופיליזציה השנייה. רשמו את משקל המוצר הגולמי ואחסנו אותו כאבקה יבשה בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius, תוך שימוש בשילוב של HPLC אנליטי ו/או LCMS בריסוס אלקטרוסטטי.

ניתן לקבוע את טוהר המוצר הגולמי ואת נוכחות המשקל המולקולרי הרצוי על ידי ביצוע הפרוטוקולים המפורטים בטקסט. ניתן לאחר מכן לטהר את תערובת הפפטידים הגולמית באמצעות prep HPLC בפאזה הפוכה בהתאם לנוהל הכתוב. סעיף זה מתאר את הפרוטוקול ליצירת דפים מרצף שרשרת בודדת של פפטיד אמפיפילי ספציפי באורך 36 me.

לאחר סינתזה, טיהור וליופיליזציה של שרשרת הפפטיד, ממיסים את האבקה הלבנה שנוצרה ב-DMSO להכנת תמיסת מלאי בריכוז של 2 millimolar. לאחר מכן, השתמש במבחנה מסוג Dr.Glass כדי להכין תמיסת פפטיד בריכוז של 20 micromolar. ראשית, הוסף 445 microliters של מי milli Q ו-50 microliters של תמיסת בופר להיווצרות שכבות (sheet formation buffer) בריכוז 10 x.

נער את המבחנה במיקסר (Vortex) כדי לערבב. לאחר מכן, הוסף 5 µL של תמיסת מלאי פפטיד בריכוז 2 mM וערבב בעדינות. דפי התמיסה המתקבלים נוצרים על ידי ניעור עדין של תמיסת הפפטיד המדוללת במים.

הטיה איטית של בקבוקון הזכוכית הסגור ממצב אופקי למצב אנכי. פעולה זו מביאה ליצירת דפים; ניעור עדין מניב אף הוא דפים. עם זאת, הדפים נוטים להיות קטנים יותר ובעלי פחות קצוות ישרים עבור דפים איכותיים רבים.

סובב את מבחנות הזכוכית סביב הציר האופקי באיטיות למשך יום אחד באמצעות מסובב מבחנות או נדנדה מותאמת לצביעה פלואורסצנטית של ננו-גיליונות, הוסף 1 µL של Nile red בריכוז 100 µM ל-100 µL של תמיסת הננו-גיליונות כדי להגיע לריכוז סופי של 1 µM. Nile red הוא צבע רגיש לסביבה שעוצמת הפלואורסצנציה שלו עולה כאשר הוא ממוקם בסביבות הידרופוביות. לאחר מכן, הכן תמיסת aros בריכוז 1% במים חמים ושפוך אותה לתוך צלחת פטרי מפלסטיק.

יש לוודא ששכבת תמיסת ה-aros בעובי של כשמינית אינץ', ולאפשר לתמיסה להתקרר ללא הפרעה על משטח שטוח. לאחר התקשות ה-aros, השתמשו בשפכטול כדי לחתוך ריבועים של סנטימטר אחד על סנטימטר אחד. לאחר מכן, העבירו את הריבועים החתוכים על גבי תבנית זכוכית כדי לרכז את הדפים באותו מישור, וטפטפו מיקרוליטר אחד של תמיסת דפים על פיסת ה-aros.

לאחר שתי דקות, ה-aros אמור לספוג את הבופר ולהשאיר את הדפים על פני השטח. יש לצלם את הדף תוך 15 דקות. לחלופין, כדי לצלם דפים ותמיסה, טענו 15 µL לתוך גסקט בקוטר 20 mm ובעובי 0.12 mm על גבי למסחית זכוכית.

כסו את הדגימה בכיסוי זכוכית (cover slip) ובצעו הדמיה תוך מספר ימים לצורך ביצוע SEM של ננו-גיליונות. ראשית, בצעו תסריט פלזמה (plasma etch) לשבבי סיליקון כדי לסייע בספיגת הננו-גיליונות. לאחר מכן, טפטפו 20 µL של תמיסת גיליונות פפטיד על מצע סיליקון שעבר טיפול בפלזמה והמתינו שלוש דקות; הסירו את עודפי התמיסה בעזרת קצה של Kim wipe, טפטפו 20 µL של מים על פני השטח ושוב ספחו את עודפי התמיסה כדי להסיר את הבאפר והמלחים.

לחלופין, תמיסות גילי דפפטידים עוברות דיאליזה מול מים כדי להסיר את הבאפר והמלח. במקרה זה, ניתן להטיל 20 µL מתמיסת הגילי שעברה דיאליזה על מצעי סיליקון שעברו טיפול בפלזמה ולהמתין לייבוש באוויר. לאחר שתמיסת הגילי התייבשה על מצעי הסיליקון שעברו טיפול בפלזמה, ניתן לדמות את הגילי באמצעות SEM תוך שימוש בגלאי in lens באנרגיות קרן שבין 1 kV ל-5 kV.

בוצעו סינתזה, אפיון וטיהור של פפטיד block charge בעל רצף ספציפי של 36 me, המתקפל לננו-גיליות דו-ממדיות מסודרות מאוד. האמינים ששימשו לסינתזה של פפטיד ה-36 me block charge היו ethylene diamine ל-phenethyl amine ו-t butyl beta alanine. לאחר הסינתזה, הפפטיד הגולמי נגזם מהשרף באמצעות 95% aqueous TFA.

לאחר איסוף תמיסת ה-TFA ואידויה, טוהרה פפטיד ה-block charge הגולמי בעל 36 חומצות אמינו באמצעות HPLC בפאזה הפוכה. לאחר מכן, אוששה המסה של פפטיד ה-block charge המטוהר באמצעות MALDI.

המסה שנצפתה, 4981.2, תואמת באופן הדוק למסה המחושבת של 4981.74. האבקה הליופיליזית הומסה ב-DMSO להכנת תמיסת מלאי בריכוז של שני מילימולר ואוחסנה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. דפי הרקמה הוכנו על פי הפרוטוקול שהוזכר לעיל ודוגמו באמצעות מיקרוסקופיה אופטית פלואורסצנטית.

נצפו מגוון צורות עם גדלי מאפיינים המגיעים עד 300 מיקרון, ובמיוחד קצוות ישרים בולטים. SEM שימש גם לדגמיקה של הגיליונות, וחשף באופן דומה קצוות ישרים בולטים. סרטון זה מתאר פרוטוקול פשוט ויעיל לסינתזה של פפטידים על פני שטח מוצק ולהרכבה עצמית של פפטידים במימי למבני ננו-גיליונות.

מכיוון שמאות של אבני בניין של חומצות אמינו זמינות בקלות ויש להשתמש בהן בפרוטוקול זה, מרחב התכנון הנגיש באמצעות פוליפפטידים הוא כמעט בלתי מוגבל. פפטידים הם חומרים מבטיחים למחקר בביו-רפואה ובננו-מדע בשל הגמישות הסינתטית, העמידות והסדר שלהם. ברמה האטומית בפרט, ננו-הגיליונות משמשים כפלטפורמה פוטנציאלית לפיגומים לתצוגה דו-ממדית, ממטיקי ממברנה, חיישנים ביולוגיים, ממטיקי חלבון וייצור מכשירים.

עבודה עם ריאגנטים קורוזיביים כגון trior, חומצה אצטית וחומצה ברומו-אצטית היא מסוכנת ביותר; כדי למנוע פציעות, בצע את כל התגובות במנדף עבדה והשתמש בציוד מיגון אישי מתאים.