מוצק שלב Submonomer סינתזה של פולימרים Peptoid שלהם ואת הרכבה עצמית לתוך מאוד מסודרים Nanosheets

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר שיטה פשוטה ויעילה לסינתזה של פפטידים בשלב מוצק והרכבה עצמית מימית של פפטידים ליריעות ננו מסודרות מאוד. בדומה מבחינה מבנית לפוליפפטידים, פפטידים נמצאים בפולימרים גליצין מוחלפים שבהם שרשראות הצד מחוברות לחנקן ולא לפחמן האלפא. התהליך מתחיל בסינתזה של רצף פפטידים ספציפי בשיטת תת-מונומר אחרת.

שיטת תת-מונומר מורכבת משני שלבים כימיים פשוטים המכניסים כל מונומר לשרשרת ברצף. ראשית, אמין המחובר לתמיכה מוצקה עובר אצטילציה ברומו. שנית, הברומיד נעקר עם אמין ראשוני.

שלבים אלה חוזרים על עצמם עד להשגת אורך השרשרת הרצוי לאחר התארכות השרשרת, הפפטיד נחתך מהתמיכה המוצקה ושמן הפפטיד הגולמי שנוצר מטוהר על ידי HPLC ומאופיין ליזום הרכבה עצמית של פפטידים ליריעות ננו. תמיסת חיץ מימית מדוללת של הפפטיד מוכנה בבקבוקון זכוכית ומערבבת בעדינות. כצעד אחרון.

יריעות הננו נבדקות תחת המיקרוסקופ. התוצאות מדגימות כי מחזור איטרטיבי של שני שלבים כימיים פשוטים יכול להניב פולימר ספציפי לרצף שמתאסף באופן ספונטני ליריעות ננו. פפטידים הם סוג חדש של פולימר בהשראת ביו עם תכונות בין אלה של חלבונים ופולימרים מסורתיים.

הם חזקים ורב-תכליתיים מבחינה סינתטית כמו פולימרים מסורתיים, אך הם גם ניתנים לכוונון וספציפיים לרצף כמו חלבונים ופפטידים של DNA מתגלים כחומר מתקדם לטיפול בבעיות מפתח בביו-רפואה ובמדעי החומרים, כגון זיהוי תרופות ביו-אקטיביות או תכנון חלבונים מלאכותיים. היתרונות העיקריים של פפטידים כוללים בקרת רצף מדויקת, זמינות של אבני בניין מגוונות להפליא, סינתזה יעילה ויציבות פרוטאזות. מתוארת שיטת הסינתזה הידנית הכללית של פפטידים הכוללת ציוד בסיסי וריאגנטים זמינים מסחרית, המאפשרת לסנתז פפטידים בקלות ברוב המעבדות.

הדגמה חזותית של השלבים הסינתטיים היא קריטית ומשמשת כהתייחסות רבת ערך לאנשים הנכנסים לתחום סינתזת הפאזה המוצקה. לראשונה כאן, הטיהור והאפיון של פפטיד אמפיפילי 36 mers מתוארים כמו גם ההרכבה העצמית שלו ליריעות ננו מסודרות מאוד. התחל פרוטוקול זה בהגדרת מנגנון הניסוי כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

השלבים הבאים יבוצעו בכלי תגובת זכוכית במקום במחסנית פוליפרופילן חד פעמית לבהירות. לאחר ההתקנה ב-100 מיליגרם של שרף R אמיד לכלי תגובה מעוצב, נפח את השרף על ידי הוספת שני מיליליטר של אמיד בצורת דימתיל או DMF מעורר על ידי בעבוע במשך 10 דקות. לאחר מכן מסננים את התמיסה בוואקום כדי לבודד את השרף הנפוח.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של 20% מתיל פירידין מלא ב-DMF כדי להגן על קבוצת FM O. מערבבים שתי דקות ומסננים. חזור על תהליך זה למשך 12 דקות, ולאחר מכן שטוף את השרף על ידי הוספת שני מיליליטר DMF המערבל למשך 15 שניות וניקוז.

התחל לגדל את שרשרת הפפטידים עם מחזור תת-מונומר ראשון, הכולל אצטילציה של ברומו ושלב תזוזה. לאצטילציה של ברומו, הוסף מיליליטר אחד של 0.6 חומצה אצטית ברומו מולרית ב-DMF ו-86 מיקרוליטר של קרדית איזופרופיל קרבו. לאחר תסיסה של 30 דקות, מסננים ושוטפים עם שני מיליליטר DMF.

לאחר מכן, בצע תזוזה על ידי הוספת מיליליטר אחד של אמין מולארי אחד עד שניים בסוף הדגירה של מתיל פיירו גנון, למשך 30 עד 120 דקות לאחר הדגירה, מסננים ושוטפים עם שני מיליליטר DMF. שוב, המשך להגדיל את שרשרת הפפטידים על ידי חזרה על מחזור תת-המונומר. לאחר סיום העקירה הסופית, יש לשטוף עם שני מיליליטר DMF.

עקוב אחר זה עם מכסה כביסה של דיורה מתאן ואחסן את כלי התגובה עד למחשוף. כדי להתחיל במחשוף, העבירו את כל השרף המיובש לבקבוקון זכוכית נצנוץ של 20 מיליליטר העובד בתוך מכסה המנוע והשתמש בציוד מגן אישי מתאים, הוסף ארבעה מיליליטר של חומצה אצטית טרי פלואורו, או קוקטייל מחשוף TFA לבקבוקון הזכוכית והכובע המנצנצים. מערבבים היטב במשך 10 דקות עד שעתיים בטמפרטורת החדר.

לחלופין, השתמש בשייקר סיבובי כדי לערבב את התמיסה. אסוף את תמיסת המחשוף TFA על ידי סינון השרף דרך מחסנית פוליפרופילן חד פעמית לתוך בקבוקון זכוכית מנצנץ חדש של 20 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של קוקטייל מחשוף טרי כדי לשטוף את השרף ולאסוף כל שאריות פפטיד.

חזור על כך, שטוף פעמיים. אידוי ה-TFA על ידי ניפוח זרם עדין של חנקן או על ידי שימוש במטען ביוטי. מאייד V 10 אדום ממיס את הנפט הגולמי בשישה מיליליטר של אחד לאחד אצטו ניטריל ומים.

לאחר מכן מקפיאים ומפילים את הדגימה. יש לחזור על תהליך זה פעם נוספת לאחר הליופיליזציה השנייה. רשום את משקל מאגר המוצרים הגולמיים כאבקה יבשה במינוס 20 מעלות צלזיוס באמצעות שילוב של HPLC אנליטי עובש ו/או LCMS ריסוס אלקטרו.

ניתן לקבוע את טוהר המוצר הגולמי והאם קיים המשקל המולקולרי הרצוי על ידי ביצוע ההליכים המתוארים בטקסט. לאחר מכן ניתן לטהר את תערובת הפפטידים הגולמית באמצעות HPLC הכנה בשלב הפוך על פי הנוהל הכתוב. סעיף זה מתאר את הפרוטוקול ליצירת גיליונות מפפטיד אמפיפילי ספציפי של 36 me ברצף שרשרת יחיד.

לאחר סינתזה, טיהור וליופיליזציה של גדיל הפפטיד, האבקה הלבנה המתקבלת מומסת ב-DMSO ליצירת תמיסת מלאי של שני מילי-מולרים. לאחר מכן, השג קובץ Dr.Glass אחד להכנת תמיסת פפטיד של 20 מיקרומולרים. ראשית, הוסף 445 מיקרוליטר של מים מילי Q ו-50 מיקרוליטר של מאגר היווצרות יריעות 10x.

מערבולת את הבקבוקון לערבב. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של תמיסת מלאי פפטיד של שני מילי-מולרית והתנפחו בעדינות. יריעות התמיסה המתקבלות נוצרות על ידי תסיסה עדינה של תמיסת הפפטיד המימית המדוללת.

הטיה איטית של בקבוקון הזכוכית המכוסה ממצב אופקי למצב זקוף. התוצאה היא ניעור עדין של יריעות, מניב גם יריעות. עם זאת, הסדינים נוטים להיות קטנים יותר ועם פחות קצוות ישרים עבור גיליונות רבים באיכות גבוהה.

סובב את בקבוקוני הזכוכית סביב הציר האופקי לאט למשך יום אחד באמצעות מסובב צינור או נדנדה מותאמת אישית לצביעה פלואורסצנטית של יריעות ננו, הוסף מיקרוליטר אחד של 100 מיקרומולרי נילוס אדום ל-100 מיקרוליטר של תמיסת יריעות הננו כדי לקבל ריכוז סופי של נילוס מיקרומולרי אחד. אדום הוא צבע רגיש לסביבה שעוצמת הקרינה שלו עולה כאשר הוא ממוקם בסביבות הידרופוביות. לאחר מכן, הכינו תמיסה של 1% במים חמים ושפכו לצלחת פטרי מפלסטיק.

ודא שתמיסת הארוס בעובי של כשמינית סנטימטר ואפשר לתמיסה להתקרר ללא הפרעה על משטח ישר. לאחר שהארוס מתייצב, השתמש במרית כדי לחתוך סנטימטר אחד על סנטימטר אחד. לאחר מכן העבירו את הריבועים החתוכים על שקופית זכוכית כדי לאסוף את הסדינים באותו מישור, הבחינו במיקרוליטר אחד של תמיסת גיליון על פיסת הארוס.

לאחר שתי דקות, הארוס אמור לספוג את המאגר ולהשאיר את הסדינים על פני השטח. דמיין את הגיליון תוך 15 דקות. לחלופין, להדמיה של גיליונות וטעינת תמיסה של 15 מיקרוליטר בתוך אטם בקוטר 20 מילימטר של 0.12 מילימטר על מגלשת זכוכית.

כסו את המדגם עם תלוש כיסוי ותמונה תוך מספר ימים כדי לבצע SEM של יריעות ננו. ראשית פלזמה חורטת שבבי סיליקון כדי לסייע בספיגת יריעות הננו. לאחר מכן זרוק 20 מיקרוליטר של תמיסת יריעת פפטיד על מצע סיליקון שטופל בפלזמה ואפשר לתמיסה לשבת לאחר שלוש דקות, הסר את התמיסה העודפת עם קצה פיפטה של קים ניגוב 20 מיקרוליטר מים על פני השטח ושוב נדף את התמיסה העודפת כדי להסיר חיץ ומלחים.

לחלופין, תמיסות יריעות הפפטיד עוברות דיאליזה כנגד מים כדי להסיר חיץ ומלח. במקרה זה, ניתן להפיל 20 מיקרוליטר של תמיסת היריעות הדיאליזה על מצעי הסיליקון שטופלו בפלזמה ולאפשר להם להתייבש באוויר. לאחר שתמיסת הגיליון התייבשה על מצעי הסיליקון שטופלו בפלזמה, ניתן לצלם את היריעה עם SEM באמצעות גלאי עדשה באנרגיות אלומה בין קילו-וולט אחד לחמישה קילו-וולט.

אפיון סינתזה וטיהור של פפטיד מטען בלוק 36 me ספציפי לרצף המתקפל ליריעת ננו דו-ממדית מסודרת מאוד. האמינים המשתמשים בסינתזה של פפטיד מטען בלוק 36 me יביאו אתילן דיאמין לפנתיל, אמין ובוטיל בטא אלנין. לאחר הסינתזה, הפפטיד הגולמי נחתך מהשרף עם TFA מימי של 95%.

לאחר שתמיסת TFA נאספה והתאדתה. פפטיד מטען הבלוק הגולמי 36 me טוהר עם HPLC בשלב הפוך. המסה של פפטיד מטען הבלוק המטוהר אושרה לאחר מכן על ידי עובש.

המסה הנצפית 4981.2 תואמת מאוד למסה המחושבת של 4981.74. האבקה הליופילית הומסת ב-DMSO ליצירת תמיסת מלאי של שני מילי-מולרים ואוחסנה בארבע מעלות צלזיוס. הגיליונות הוכנו על ידי הפרוטוקול והתמונה הנ"ל עם מיקרוסקופיה אופטית פלואורסצנטית.

נצפים מגוון צורות עם גדלי תכונות הנעים עד 300 מיקרון, וקצוות ישרים בולטים במיוחד. SEM שימש גם להדמיית היריעות שחשפו באופן דומה קצוות ישרים בולטים. סרטון זה מתאר פרוטוקול פשוט ויעיל לסינתזה של פנים מוצקות של פפטידים והרכבה עצמית מימית של פפטידים ליריעות ננו.

מכיוון שמאות אבני בניין זמינות וניתן להשתמש בהן בפרוטוקול זה, מרחב התכנון הנגיש עם פוליפפטידים הוא כמעט בלתי מוגבל. פפטידים הם חומרים מבטיחים למחקר ביו-רפואה וננו-מדע בגלל הגמישות הסינתטית, החוסן והסדר שלהם. ברמה האטומית בפרט, יריעות הננו משמשות כפלטפורמה פוטנציאלית לפיגומי תצוגה דו מימדיים, חיקוי ממברנה, חיישנים ביולוגיים, חיקוי חלבונים וייצור מכשירים.

עבודה עם ריאגנטים קורוזיביים כגון טריור, חומצה אצטית וחומצה אצטית ברומו מסוכנת ביותר למניעת פציעות, ביצוע כל התגובות במכסה אדים וללבוש ציוד מגן אישי מתאים.