תהודה מגנטית elastography מתודולוגיה להערכת של רקמות מהונדסות צמיחה Construct

בחינת מבני רקמה מהונדסים אינה מאפשרת שימוש בבדיקות מכניות מסורתיות, שכן אלו גורמות לעיתים קרובות להרס הדגימה. שיטה זו משתמשת באלסטוגרפיה של תהודה מגנטית מיקרוסקופית, או micro MRE, כטכניקה לא פולשנית למדידת התכונות המכניות של רקמות רכות קטנות. ראשית, תאים מושבצים על פיגום של חומר ביולוגי כדי ליצור רקמה.

הרקמה תלויה בג'ל aros, וקצהו של מפעיל (actuator) ממוקם בתוך הג'ל. לאחר מכן, כדי לאפיין את התנועה, היא מועברת למדגם ומזוהה באמצעות לייזר Doppler viter.

הדגימה והמפעיל מועברים למגנט ולתהודה מגנטית. תמונות אלסטוגרפיה נרכשות. ניתוח של התמונות שהתקבלו מראה את השינוי בנוקשות הגזירה הן עבור המבנים האוסטאוגניים והן עבור המבנים האדיפוגניים.

ראשית, הגיתינו את הרעיון לטכניקה זו לאחר שצפינו בצילום תהודה מגנטית (MRI) לשימוש באבחון מחלות, והבנו כי ניתן להרחיב את השימוש בה להנדסת רקמות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות אחרות, כגון בדיקות מכניות, הוא שהיא מחילה את הטכנולוגיה הבלתי פולשנית של MRI על תכונות מכניות מרכזיות של רקמות. היישומים של טכניקה זו רלוונטיים להנדסת רקמות, כיוון שהבנת התכונות המכניות תבטיח כי הרקמה מתאימה לשימושים המיועדים לה בהנדסת עצם וסחוס.

למרות ששיטות אלו מספקות תובנות בעלות ערך עבור הנדסת רקמות, ניתן להשתמש בהן גם לאבחון מחלות באיברים שונים, כגון פיברוזיס של הכבד, פגיעה מוחית טראומטית או סרטן המוח, למשל. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כיוון שהיא כוללת שלבים שקשים ללמידה, ומצריכה מודעות מוקדמת להנדסת רקמות ולדימות קצב גודל. תהליך הכנת מבנה הרקמה מורכב משלושה שלבים עיקריים: הרחבה של אוכלוסיית התאים, זריעה של תאים על פיגום ביו-חומרי ודיפרנציאציה באמצעות שימוש במולקולות איתות כימיות.

לאחר תרבית והרחבה של שורת התאים, זרע את התאי הגזע המזנכימליים האנושיים או ה-HMCs על ספוג ג'לטין בצפיפות של 1×10⁶ תאים למילליליטר ליצירת עצם. כעבור כ שלושה ימים, התאים אמורים להיראות קונפלואנטיים על הפיגום כדי להשרות דיפרנציאציה. הסר את המדיום והחלף אותו במדיום להשראת רקמת שומן.

לאחר שלושה ימים, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. החליפו את המצע במצע תחזוקה, המורכב ממצע הרחבה המכיל 10 µg/mL של human recombinant insulin. לאחר דגירה של 24 שעות, החליפו את מצע התחזוקה במצע השראה.

חזרו על מחזור זה שלוש פעמים. לאחר מכן, החליפו את מצע התחזוקה מדי יומיים למשך ארבעה שבועות כדי להשרות אוסטאוגנזה. החליפו למצע אוסטאוגני רענן מדי יומיים למשך כל תקופת המחקר.

במחקר זה משך הבדיקה הוא ארבעה שבועות ו-MRE מבוצעת בכל שבוע. אלסטוגרפיה של תהודה מגנטית (Magnetic resonance elastography) מסתמכת על התפשטות של גלי גזירה מכניים להערכת ערכים מקומיים של תכונות מכניות. לכן, יש להפיק ואפיין ויברציות מכניות אלו בתוך הרקמה הנבדקת באמצעות אקטואטור פ piezoelectric. כדי להכין את הדגימה, העבירו את תרבית הרקמה לשפרורה בקוטר 10 מילימטר המכילה בסיס מוצק ושכבה של 0.5%AGROS gel.

לאחר מכן, הוסיפו 0.5 אגרו-ג'ל (acro gel) חם כדי לסגור את המבנה. המתינו חמש דקות עד שהאגרו-ג'ל יתמצק.

בטמפרטורת החדר, הכניסו את קצה מנוע הכפיפה הפסוא-אלקטרי (piso electric bending motor) אל תוך פני השטח של הג'ל. לאחר מכן, חברו את המבחנה המכילה את הדגימה ואת המפעיל למסבך קשיח. כווןו את קרן מד הלחץ הלייזר-דופלר (laser doppler barometer) לעבר קצה המפעיל המכני.

כווננו את מיקום המערכת כדי למקסם את עוצמת האות המוחזר, המוצגת בברומטר. כדי להשיג רפלקציה מקסימלית, השתמשו בסרט רפלקטיבי במידת הצורך כדי להגדיר את האקטואטור כך שייצור גלי גזירה בלתי מזיקים עם אמפליטודות משמעותיות של כ-250 microns. הגדירו את מחולל הפונקציות לסרוק את טווח התדרים הרצוי באמצעות מתח עבודה של 20 volts peak to peak עם אות רעש לבן.

עבור ניסוי זה, טווח התדרים הרצוי הוא 20 עד 2000 hertz. כדי לצפות בספקטרום שאופיין בתוכנת Polytech Rsof, יש לבחור בתצוגת velocity ו-FFT. התחל בלכידת האותה וזהה את תדר התהודה של המערכת בהתבסס על שיאי הספקטרום.

בשלב הבא, כדי למדוד את הסטייה של המפעיל (actuator), הגדירו את המפעיל לספק גל סינוס רציף בתדר התהודה שאופיין. באמצעות מתח הפעלה של 200 volts peak to peak, הגדירו את תוכנת fiber soft להצגת ה-FFT כאשר העתקה (displacement) המועברת על ידי המפעיל אל פני השטח של הג'ל מופיעה בציר ה-Y. לאחר אפיון המפעיל, הכניסו את מבחנה הדגימה והמפעיל לתוך חריץ בסליל RF של 10 מ"מ, והניחו את הדגימה והמפעיל במרכזו של סורק ה-MRI.

רכשו תמונת סקר (scout image) לצורך זיהוי מיקומו של המבנה. לאחר איתור מבנה הרקמה, הגדירו את פרמטרי הרכישה. לסריקה סגיטלית טיפוסית in vitro יהיה זמן חזרה של 1000 milliseconds.

זמן הד (Echo time) של 20 עד 40 milliseconds, עובי חתך של 0.5 עד 1 millimeter ושדה ראייה (field of view) של 12 על 10 millimeter squared, עם גודל מטריצה של 128 על 128 pixels. עבור פרמטרי האלאסטוגרפיה, הגדירו את תדר המפעיל (actuator frequency) לערך שנקבע על ידי אפיון ה-laser doppler viter. עבור דגימה זו, נדרש זוג one bi עם אמפליטוד גרדיאנט של 50 gauss per centimeter והשהיית MRE המוגדרת כ-0.

העבירו את מחולל הפונקציות למצב burst והתאימו את פרמטרי מחולל הפונקציות לאלו שמוגדרים בפרמטרי הרכישה של האלאסטוגרפיה, כולל התדר ומספר המחזורים. הגדירו בנוסף את מחולל הפונקציות להפעלה באמצעות טריגר חיצוני. כדי לקבל תמונה סגיטלית, הגדירו את רגישות התנועה (motion sensitization) לכיוון הפרוסה החיובי והתחילו את הסריקה לאחר הרכישה.

בדוק את התמונה כדי להעריך את איכות האות במבנה הרקמה. אם התמונה נראית כהה מדי, התאם את פרמטרי ה-MR ובצע סריקה נוספת. לאחר מכן, שנה את הרגישות לכיוון הפרוסה השלילי.

העבירו את הקבצים מסורק ה-MRI למחשב אחר המצויד ב-MATLAB והריצו את תוכנית ה-MATLAB שתבצע חילוק מורכב ליצירת תמונה המתארת התפשטות של גלי גזירה. בחנו בתמונה את נוכחותם של גלי הגזירה וארטיפקטים אפשריים; ניתן להוציא גרפים של פרופילי קווי עטפת פאזה (phase wrapping) כדי להעריך טוב יותר את האיכות ואת אמפליטודת הגל. אם התרחשה עטפת פאזה, הפחיתו את אמפליטודת הגרדיאנט ובצעו סריקה נוספת.

במידה ואין צורך בביצוע התאמות לתמונה, יש להתאים את גודל מערך הפרמטרים לשמונה ערכים במרווחים שווים, החל מאפס שניות ועד למחזור מלא של תדר התהודה שאופיין. לאחר רכישת התמונות, יש לבצע סריקה בשני כיווני החיתוך, החיובי והשלילי.

השתמשו בתוכנת MATLAB שנועדה להפיק את נתוני גלי הגזירה ואת הסרט התואם של הגל המתפשט בדגימה. קובץ זה הוא הדרוש להערכת התכונות המכניות. השלב הסופי של MRE הוא חישוב קשיחות הגזירה מתוך תמונות גלי הגזירה.

התחילו בהזנת הנתונים לתוכנת MATLAB שתנתח את מערך הנתונים התלת-ממדי, הגדירו את פרמטרי ההדמיה, כולל שדה ראייה (field of view), גרדיאנט, אמפליטודה ומספר זוגות ביפולריים, והריצו את הקוד. האלגוריתם מאפשר בחירה של אזורי עניין (regions of interest) עבורם יחושבו הממוצע וסטיית התקן של כל פרמטר. שרטטו את קווי המתאר של מבנה הרקמה כדי לבחור את אזור העניין.

המוצע וסטיית התקן של הקשיחות, מודול האגירה ומודול ההפסד בתוך אזור העניין שנבחר מוצגים. התוכנה מספקת גם תוצאות ביניים, כולל הגל לאחר סינון, הגל לאחר סינון כיווני ופרופילי קו המסייעים בהערכת נאמנות השחזור. להערכה מדויקת, הגל המסונן צריך להיות חלק.

סטיית התקן של פרמטר באזור עניין ספציפי מהווה גם היא מדד לאיכות החישוב; במידת הצורך, יש להתאים פרמטרים אחרים כדי לקבל ערכים מדויקים של תכונות מכניות, במטרה לצפות בשינויים בתכונות המכניות של מבנים הנדסיים במהלך התפתחותם. בדיקות MRE בוצעו לאורך תקופה של ארבעה שבועות. מפת פיתוח מבנים זו מציגה מבנים אדיפוגניים (מסומנים באות A) ומבנים אוסטאוגניים (מסומנים באות O), יחד עם תמונות עוצמה (magnitude), תמונות גלי גזירה, ELAs וקשיחות גזירה ממוצעת תואמות.

מפת הצבעים עבור ה-ELAs תואמת לסרגל הצבעים. התרשים וסטיות התקן מייצגים את סטיית התקן בתוך אזור העניין של כל אחד מהמבנים. עם הזמן, המבנים האדיפוגניים הפכו לפחות קשיחים, מה שמעיד על תכונות הדומות לרקמה שומנית.

באופן דומה, המבנים האוסטאוגניים הפכו לקשיחים יותר במהלך תקופת ארבעת השבועות, מה שמעיד עלהתמיינות דמוית עצם. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בכשעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לאפיין במלואו את המפעיל (actuator) לאחר סיום הפרוצדורה. ניתן להשתמש בשיטות כגון אנליזה ביוכימית והיסטולוגיה כדי לענות על שאלות כגון אישור של שקיעת מינרלים.

יש לזכור כי בעת עבודה עם חומר תאי אנושי ו-MRI, הדבר עלול להיות מסוכן ביותר, ויש לנקוט במשנה זהירות ולהיות מודעים לדרישות הבטיחות של רמת בטיחות ביולוגית 2 (BL2) ובטיחות MRI בעת ביצוע הליכים אלו.