זיהוי של Aspergillosis ריאתי פולשני בחולים ממאירות Haematological באמצעות זרימת לרוחב, טכנולוגיה

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים את השימוש במכשיר זרימה צדית (lateral flow device) לזיהוי מהיר של אנטיגן אבחנתי של aspergillus בסרום אנושי ובנוזלי BAL. הדבר משיג תחילה על ידי הנחת דגימת הסרום או ה-BAL בפתח השחרור של מכשיר הזרימה הצדית. השלב השני הוא להמתין עד שהתמיסה תנדוד לאורך הממברנה.

השלב הבא הוא לקבוע האם הבדיקה תקינה על ידי בחינת קו הבקרה הפנימי. השלב הסופי הוא לפרש את תוצאת הבדיקה על ידי בחינת קו הבדיקה. בסופו של דבר, מכשיר הזרימה הצדי משמש לזיהוי נוכחות של אנטיגן אבחנתי של aspergillus בסרום או בנוזלי BAL.

ניתן להשתמש ב-LFD של aspergillus כבדיקה משלימה לאבחון של aspergillosis ריאתי פולשני. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון aspergillus, galacto, Manan enzyme immunoassay, panf, fundal, beta glucan assay ובדיקת aspergillus PCR, הוא שזוהי בדיקת אבחון מהירה בנקודת הטיפול (point of care) הדורשת מינימום של מתקני מעבדה והכשרה. למרות שה-LFD פותח לזיהוי של מיני aspergillus, ניתן ליישם טכנולוגיית זרימה צדית (lateral flow) גם לזיהוי פתוגנים זיהומיים אחרים כגון מיני cetosporium, fusarium ו-riser.

על ידי שילוב נוגדנים מונוקלונליים ספציפיים לאורגניזמים אלה, הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. מאחר שפירוש תוצאות LFD דורש היכרות עם פורמט הבדיקה, כדי לאסוף סרום מדגימות דם לא מטופלות, יש להניח לדם להיקרש בטמפרטורה של 4°C. יש לאחסן סרום ונוזלי שטיפה ברונכואלוולארית, או BAL, כסדרת מנות (aliquots) בטמפרטורה של 20°C- לפני השימוש; אחסון כמנות מגביל את הפוטנציאל לפירוק של האנטיגן המטרה כתוצאה מהקפאה והפשרה חוזרת של דגימות במהלך בדיקות חוזרות. כדי להכין דגימות סרום ו-BAL לבדיקה, הפשירו את הדגימות בטמפרטורה של החדר, ולאחר מכן שמרו אותן על קרח. ערבבו היטב באמצעות וורטקס ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-14,000 RPM. עבור בדיקה שגרתית של דגימות אנוש, דללו את הסרום ביחס של 1:1 עם מצע לתרבית רקמות, או לחלופין, כדי להפריד את האנטיגן המטרה מקומפלקסים חיסוניים של הסרום, דללו את הסרום ביחס של 1:2 עם PBS המכיל 4% EDTA, חממו למשך שלוש דקות במסבך מים רותחים וסבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-14,000 RPM.

נוזלי BAL אנושיים אינם דורשים טיפולים מקדימים. דגימת BAL שהופשרה, עברה ערבוב ב-vortex וסבוב בצנטריפוגה היא דגימה נקייה שניתן להחיל ישירות על מכשיר הזרימה הצדית. לצורך הבדיקה, מכשירי הזרימה הצדית (LFD) מאוחסנים בטמפרטורת החדר או ב-23 °C, שבהם הם יציבים למשך 12 חודשים.

כדי להתחיל את הבדיקה, הוצא את המכשירים מהנרתיקים שלהם והנח אותם על משטח ישר. באמצעות טיפ פפיטה סטרילי, טפטף 100 µL של סרום שעבר טיפול מקדים אל נתיב השחרור של המכשיר בתוך שניות ספורות. הנוזל אמור לנדוד באמצעות פעולת נימיות לאורך ממברנת הניטרוסלולוז בחלון התצפית.

באופן דומה, יש להעביר 100 µL של דגימת BAL טהורה לפתח השחרור של המכשיר. יש להמתין 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן יש לתעד את תוצאות הבדיקה. אין להמתין יותר מ-15 דקות לפני תיעוד התוצאות.

מכיוון שדבר זה עלול להטות את פרשנות התוצאות, תגובה חלשה לא תתחזק על ידי הארכת תקופת האינקובציה. ה-LFD מורכב מקו בקרה פנימי המסומן באות C על גבי מעטפת הפלסטיק וקו בדיקה המסומן באות T. קו הבקרה חייב להופיע תמיד ללא קשר לנוכחות של אנטיגן aspergillus בדגימת הסרום או ה-BAL. דבר זה מעיד על כך שהבדיקה בוצעה כהלכה אם אנטיגן aspergillus קיים בדגימת הסרום או ה-BAL.

קו הבדיקה יופיע גם הוא בתוך 15 דקות מהחלת הדגימה. עוצמות התגובות של בדיקת ה-Lyme פרופורציונליות לריכוזי האנטיגן המטרה בדגימות הסרום וה-VAL. ההיבט המאתגר ביותר של פרוצדורה זו הוא פרשנות תוצאות הבדיקה.

יש לקרוא את תוצאות ה-LFD לאחר 15 דקות ולהשוות את תוצאת הבדיקה לדוגמה המייצגת המוצגת כאן. באיור זה מוצגות דוגמאות מייצגות של תוצאות LFD חיוביות חלשות, חיוביות בינוניות וחיוביות חזקות במדגמי BAL ונסיוב. כל קו בדיקה חיובי במדגם הנסיוב, ללא קשר לעוצמתו, יעיד על אספרגילוזיס פולשני או מחלת IPA עקב נוכחות של אנטיגן aspergillus במחזור הדם. תגובות BAL חיוביות, ללא קשר לעוצמתן, יעידו על נביטה של נבגים והתפתחות של hyphy פתוגניות פוטנציאליות בריאות.

בהיעדר אנטיגן של aspergillus, לא יופיע קו בדיקה והתוצאה תירשם כשלילית. טבלה זו מציגה את תוצאות בדיקות LFD באמצעות נוזלי BAL ממטופלים עם לוקמיה מילואידית חריפה או AML שואבחו על פי קריטריוני האבחנה של קבוצת המחקר של הארגון האירופי למחקר וטיפול בסרטן והמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. בטבלה זו כלולים הנתונים הקליניים והפסיכולוגיים התואמים, כמו גם תוצאות של בדיקת PCR ספציפית ל-ASPERIA עבור כל מטופל.

תחת הנחיות ה-E-O-R-T-C-M-S-G משנת 2002, מטופלים 12, 13 ו-16 אובחנו עם IPA אפשרית על בסיס גורמי מאכסן וקריטריונים קליניים או חיוביות ל-GM. על פי הנחיות ה-E-O-R-T-C-M-S-G המעודכנות משנת 2008, גורמי מאכסן וחיוביות ל-GM לבדן, או גורמי מאכסן וקריטריונים קליניים לבדם, לא יעידו על זיהום פטרייתי פולשני אפשרי אלא אם כן הם מלווים בראיות תומכות מנתונים קליניים וממיקולוגיה, בהתאמה. מטופל שש אובחן עם IPA סבירה תחת שתי הנחיות, אלו של 2002 ואלו של 2008, בשל גורמי מאכסן, מאפיינים קליניים עיקריים ומשניים וחיוביות ל-GM.

לבסוף, שימו לב כי למרות ששני הבדיקות, LFD וה-PCR, אינן נכללות כעת בהנחיות ה-E-O-R-T-C-M-S-G בדגימות BAL של מטופלים 6 ו-12, קיימת התאמה חזקה בין שתי הבדיקות לבין בדיקת הגלקטומנאן המסחרית, המעידה על נוכחות של אנטיגן וחומצת גרעין של aspergillus לאחר ביצוע הליך זה. ניתן לבצע במקביל שיטות אחרות כגון בדיקת האנזים פלא-גלקטומנאן, בדיקת פנ-פטריית בטא-גלוקאן או בדיקות PCR ל-aspergillus כדי לאשר מחלה פטרייתית פולשנית. זכרו כי עבודה עם סרום דם אנושי ונוזלי BAL עלולה להיות מסוכנת ביותר, ומפעילי המכשור חייבים להיות מחוסנים תמיד למחלות כגון הפטיטיס B ושחפת.