שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשלב דגימה מבוססת סרט דבק של תוצרת טרייה עם זיהוי מולקולרי של תאים שלמים של מיני סלמונלה באמצעות פלואורסצנטיות מהירה בהכלאה של C two, הידועה גם בשם דגים. זה מושג על ידי מריחת סרט דביק תחילה על החומר הרצוי וחילוץ תאים קשורים פני השטח. ניתן לנתח קלטות מטען תאים ישירות או להעשרת פאזה מוצקה או נוזלית.

השלב השני של ההליך הוא על קלטת, קיבוע עצמי והתייבשות בסדרת אתנול לתאים הנרמזים או מועשרים במרק. השלב השני כולל קיבוע תאים בתרחיף, ואחריו השעיית Resus של תאים במאגר אחסון. השלב השלישי של ההליך הוא ביצוע שלב הכלאה מהיר באמצעות קוקטייל בדיקה אוליגונוקלאוטיד ספציפי לסלמונלה, ואחריו הסרת בדיקה עודפת עם שטיפת מאגר כביסה לדגימות שנותחו באמצעות פקס, שלב הדג מתבצע בתרחיף, וניתן להסיר בדיקה עודפת באמצעות שלב דילול פשוט לפני הניתוח.

השלב האחרון של ההליך הוא לצבוע את התאים הקשורים בסרט ההיברידי עם DPI ולבחון אותם באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. עבור ניתוחים מבוססי עובדות, אין צורך בכתם נגד. בסופו של דבר, שיטה זו מספקת אמצעי לזיהוי חזותי או ציטומטרי של מיני סלמונלה שעשויים להימצא בתוצרת טרייה שנדגמה.

הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כשקראתי על קבוצה איטלקית שהשתמשה בגישה דומה לבחינת קהילות חיידקים על שרידי אבן אווירית רומית. אבל r ואני הובלנו דיון על העבודה הזו בכיתה שלימדתי על שיטות מהירות במיקרוביולוגיה של מזון. כמה שבועות לאחר מכן, התפרצות סלמונלה שמקורה בתוצרת טרייה החלה בסופו של דבר לחלות כמעט 1500 אנשים ב-43 מדינות שונות.

בעוד שהגישה הניסיונית שלנו מציעה דרך מעשית ועדכנית לזיהוי סוגי החיידקים הספציפיים על תוצרת טרייה, היא גם ניידת מספיק כדי לאפשר בדיקה בשטח או בסביבת ייצור מזון. התחל בבחירת סרט לשימוש לדגימה. חלק מהאפשרויות כוללות את סרט הפטריות הזמין מסחרית או מגע שהם סטריליים וגם ארוזים לנוחות השימוש.

בעזרת טוש קבוע, צייר ריבועים של סנטימטר אחד בצד הלא חולה של פיסת סרט דבק בגודל 10 סנטימטר באמצעות תבנית אלומיניום סטרילית. זה ישמש כמדריך ויזואלי לציון איזה חלק של הסרט שימש לדגימת המזון או משטח הסביבה ליצירת לולאת סרט בצורת CS כאשר הצד הדביק פונה למשטח שיש לדגום. לשם כך, החזק את הקצוות הדביקים עם האגודל והאצבע האמצעית ומקם את האצבע המורה כנגד הריבוע המצויר בגב הקלטת.

הנח את הסרט על המשטח המיועד לדגימה ולחץ בעדינות את האזור המסומן על פני השטח מבלי לשחרר את שולי הסרט. השתמש באצבע המורה כדי להבטיח שהצד הדביק של הסרט בא במגע מלא עם משטח הדגימה. הימנעות מבועות בתנועה אחידה.

משוך לאט את הסרט הרחק מהדגימה. חילוץ פיזי של חיידקים הקשורים לפני השטח מהדק את מטען התא. הדביקו את הצד הדביק כלפי מעלה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית באמצעות סרט משרדי שקוף גנרי, הקפידו על מתח ומתיחה נאותים של הסרט כך שייווצר משטח שטוח שאינו מקומט.

זה יעזור למזער בעיות עם עיוות או סלסול של הקלטת. במהלך החימום שלאחר מכן. במהלך ההכלאה, הנח את הסרט עם הפנים כלפי מטה על קסילוז חיתוך שלישוני ארבע או XLT ארבע לוחות אגרי כך שהתאים שנדגמו יהיו במגע ישיר עם משטח החקלאות כדי להקל על הסרה קלה של הסרט מהמשטח החקלאי.

לאחר ההעשרה, חלק מגע הדגימה של הסרט ממוקם בסמוך למשטח החקלאי, וקצה אחד של הסרט נצמד באופן רופף. הדופן של צלחות צלחת הפטרי הפוכה כדי למנוע עיבוי ומודגרת ב-35 מעלות צלזיוס. כדי לאפשר צמיחה מספקת של מיני סלמונלה, אורך תקופת הדגירה הדרושה להעשרת התאים לרמה הניתנת לזיהוי יהיה תלוי ברמות הזיהום הראשוניות של הסלמונלה.

לאחר תקופת ההעשרה הרצויה, פתח את צלחת האגר, הקלטת תשמור על הדביקות שלה במהלך הדגירה. לחץ בעדינות את הסרט על האגר באמצעות האצבע המורה כדי להבטיח התאוששות מקסימלית של מיקרו מושבות שנוצרו בממשק הסרט אגר, אחוז בסרט מהקצה המחובר לדופן צלחת הפטרי והסר אותו בתנועה איטית ואחידה. בעזרת סרט משרדי שקוף גנרי הרכיבו את סרט הטעינה של התא עם הצד הדביק כלפי מעלה על שקופית מיקרוסקופ כך שנוצר משטח שטוח ולא מקומט.

בצע קיבוע על תאי סרט למשך 30 דקות ב-25 מעלות צלזיוס על ידי כיסוי אזור המגע של הדגימה ב-500 מיקרוליטר של פורמין ניטרלי 10%. השליכו את הקיבוע למיכל הניתן לאיטום מתחת למכסה המנוע הכימי כדי למזער את החשיפה לאדים מגרים או רעילים, שטפו את הסרט פעם אחת בתמיסת מלח פוספט או PBS על ידי הצפה עדינה של משטח הסרט ב-PBS לייבש את הדגימה. באמצעות סדרת אתנול מתקדמת, הכינו מאגרי הכלאה וכביסה לפני הכלאה באמצעות מסנן פתרונות מסחריים בדרגת ביולוגיה מולקולרית באמצעות מזרק נקודתי של 22 מיקרומטר וחממו מראש מאגרי הכלאה וכביסה ל-55 מעלות צלזיוס.

הוסף בדיקות אוליגונוקלאוטידים עם תווית פלואורסצנטית למאגר הכלאה שחומם מראש לריכוז בדיקה סופי של חמישה ננוגרם למיקרוליטר על שטח המגע של הדגימה של הקלטת עם 300 מיקרוליטר של מאגר הכלאה המכיל את קוקטייל הבדיקה ותאים קשורים בסרט היברידי בתא דגירה אטום לח המוגדר ל-55 מעלות צלזיוס עבור חממת מגע ישיר, כגון מכשיר מצב החלקה היברידי למשך 15 דקות. לאחר ההכלאה, השקופיות מוסרות והגשושית המכילה שכבת מאגר הכלאה מושלכת. יש לשטוף בקצרה ובעדינות עם מאגר כביסה שחומם מראש על ידי פיפטינג.

נפח קטן של חיץ מעל מגלשה מוטה מאפשר למגלשות להתייבש באוויר לזיהוי onap של מיני סלמונלה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שכבו את השקופית בכ-10 מיקרוליטר של מגן וקטורי H 1200, מדיום הרכבה המכיל dpi, כתם הנגד הגרעיני דגר בחושך למשך 10 דקות. מניחים שמן טבילה על המכסה, מחליקים ובודקים דגימות באמצעות מטרת שמן בהגדלה גבוהה.

מסנן ה-DPI משמש כדי להביא את הדגימה למיקוד. לאחר מכן המיקרוסקופ מועבר למסנן המתאים, ותאי סלמונלה מקבלים ניקוד חזותי על פי הקרינה הירוקה או האדומה שלהם, תלוי באיזה צבע משתמשים לתיוג הבדיקות. זיהוי ציטרי קדמי מעביר דגימות תלויות PBS לצינורות דגימה תחתונים עגולים של חמישה מיליליטר ובודק באמצעות ציטומטר זרימה עם עירור ב-647 ננומטר.

נתח נתונים באמצעות תוכנת FlowJo. דגימת סרט דבק של terica serovar, Ty Murium מפני השטח של עגבנייה מזוהמת באופן מלאכותי, מאפשרת ניתוח ישיר לאחר הדגים באמצעות מיקרוסקופיה או מטען תא ציטומטריה זרימה. הקלטות עובדו לפלואורסצנטיות מהירה בהכלאה של C 2 באמצעות שילוב של בדיקות DNA ספציפיות לסלמונלה וסומנו בטקסס אדום, בהתאם לריכוז המקומי הראשוני של תאי סלמונלה על הקלטת.

העשרה בשלב מוצק הניבה תוצאות שנעו בין מושבות מיקרו מבודדות לצמיחה משולבת. ניתן לנתח תאים שנדגמו באמצעות ציטומטריה משולבת של דגים וזרימה, מיד לאחר הדגימה או לאחר משטח נוזלי של חמש שעות. מיני העשרה תרבותית ב-35 מעלות צלזיוס.

למרות שתיארנו את השימוש בטכניקת הסרט לבטיחות מזון, לשיטה יש גם פוטנציאל טוב לשימוש בדיסציפלינות אחרות, כולל מיקרוביולוגיה סביבתית, פתולוגיה של צמחים או מיקרוביולוגיה קלינית. במקביל להליך זה, ניתן לבצע ניסויים נוספים כמו בדיקות ביוכימיות או PCR על העשרת פאזה מוצקה או נוזלית מדגימות שחולצו בקלטת. ניתן להשתמש בבדיקות כדי לענות על שאלות על סלמונלה שעלולות להיות נוכחות, שאלות שהן מעבר להיקף הליך הדגים.