תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא כימות יעיל של טיטרי נגיפי שפעת בדרכי הנשימה של עכברים נגועים. העכברים מחוסנים תחילה תוך-נזאלית בנגיף השפעת בנקודות זמן נבחרות לאחר ההדבקה.

העכברים מוקרבים ונוזל שטיפה ברונכ׳אוולבולארית (BAL) נאסף. לאחר מכן, נוזל ה-BAL משמש להדבקת תאי MDCK. ניתן לצבוע תאים נגועים לנוכחות של חלבונים נגיפיים באמצעות נוגדנים ראשוניים ספציפיים, ולאחריהם נוגדנים משניים המשורשריים למסמנים באינפרא-אדום.

אותות אינפרא-אדום נקראים באמצעות סורק Lycor Odyssey, וניתן להשתמש בתוכנת Odyssey כדי לקבוע את הטיטרים הויראליים. באמצעות עקומה סטנדרטית, ניתן לקבל קביעה כמותית של הטיטרים הויראליים. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הם הכימות המדויק של הטיטרים הויראליים, ההדירות (reproducibility), והנפח הקטן הדרוש לביצוע בדיקה זו.

ניתן להרחיב את השלכותיה של טכניקה זו לאבחון ולטיפול במגוון מחלות נשימה נגיפיות, כיוון שניתן להשתמש בה לכימות טריטרים נגיפיים בדגימות קליניות לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון QPCR, כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון מספר עותקים של הנגיף. בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב לזכור לבדוק את וירוס בקרת הסטנדרט של הטריטר לאחר פיתוח זה.

טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום הווירוסים לבחון את הטר של הנגיף או לבצע צביעה של חלבון נגיפי בדגימות קליניות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 17 שעות. הפרוטוקול מבוצע באופן מדויק: ראשית, יש להדביק עכברים באופן תוך-נחרי ב-5,000 יחידות forming plaque או PFU של נגיף השפעת PR8 ב-30 µL של PBS סטרילי, או ב-PBS בלבד כביקורת שלילית. לצורך איסוף נוזל BAL מבעלי חיים שהורדמו, יש לפתוח תחילה את חלל בית החזה ולבצע חתך של 1 ס"מ במקביל לקנה הנשימה כדי לחשוף אותו באמצעות מספריים סטריליים עדינים.

בצעו חתך קטן בקנה הנשימה, מזגו לקנה הנשימה 0.5 milliliters של PBS המכיל 1%BSA ושאבו בעדינות את נוזל השטיפה החוצה. שמרו את נוזלי ה-BAL בטמפרטורה של negative 20 degrees centigrade לצורך כימות הטיטרים הוויראליים בנוזלי השטיפה. ראשית, תרבתו 5 million תאי MDCK ב-20 milliliters של RPMI מלא בבקבוק T 75 למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees centigrade; למחרת, אספו את התאים וזרוו אותם בלוח 96 בארות שחור בעל תחתית שטוחה אופטית בריכוז של 10,000 תאים לבארה.

לאחר מכן, דגרו את הפלטה למשך לילה ב-37 °C בעקבות הדגירה. שאבו בעדינות את העלייה (supernatant) ושטפו את התאים פעמיים ב-DMEM מלא אך נטול סרום, המכיל 0.2% BSA במקום FBS. לאחר שטיפת התאים, הוסיפו 50 µL של נוזל BAL או 50 µL של תמיסה המכילה ריכוז ידוע של נגיף לכל באר.

לאחר מכן, הוסיפו לכל באר 50 µL של DMEM, מצע המכיל trypsin שעבר טיפול ב-TPCK בריכוז של 0.2 µg/mL כדי לשפר את ההיצמדות, החדירה והשכפול של הנגיף. דגרו את התאים למשך שעה אחת ב-37 °C כדי לאפשר לספיגת הנגיף. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של FBS המכיל RPMI מלא לכל באר ודגרו את התאים למשך הלילה כדי לאפשר להדבקה להתפשט לאחר דגירת הלילה.

שטוף את התאים עם 100 µL של 1%B-S-A-P-B-S. לאחר שטיפת התאים, הוסף 100 µL לבאר של 1%para formaldehyde והדגס את הפלטות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבע את התאים. לאחר מכן, שטוף עם 100 µL לבאר של 1%B-S-A-P-B-S והדגס את התאים למשך 30 דקות נוספות לצורך חסימה. לאחר חסימת התאים, הוסף 50 µL לבאר של נוגדן ראשוני אנטי-ויראלי M two המדולל ביחס של 1:1000, והדגס את הפלטות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לצבוע כל חלבון ויראלי קיים. לאחר ההדגסה, שטוף את התאים שלוש פעמים ב-1%B-S-A-P-B-S והדגס אותם עם 100 µL לבאר של נוגדן משני המצומד לצבע אינפרא-אדום בדילול של 1:200 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ובחושך. לאחר צביעת התאים, שטוף אותם שלוש פעמים כפי שבוצע קודם לכן.

לאחר מכן, מקמו את הפלטות על פלטת זכוכית הקריאה של סורק האינפרה-אדום Licor Odyssey. בחרו בהגדרת פלטת 96 בארות בקורא באמצעות תוכנת ה-Licor Odyssey. זהו את בארות הביקורת השלילית הריקות (blanks), ולאחר מכן כמתו את הפלואורסצנציה מכל הפלטה.

השתמש בכלי הצורות האוטומטיות כדי לצייר את אזור העניין או ה-ROI במרכז באר בדיקה. נשתמש ב-ROI מתוך בקרה שלילית כדי לקבוע את ערך פלואורסצנציית הבסיס של הבדיקה, ולאחר מכן נמקם את שני קווי הצלב המנוגדים המסופקים על ידי תוכנת ה-Odyssey בתוך ה-ROI כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנציה לאורך הבאר.

בשלב הבא, סרקו את הפלטה באמצעות ערוץ 780 nanometer לזיהוי ו-680 nanometer כאורך גל ייחוס. לאחר הפעלת פקודת הקריאה, יימדדו עוצמות פלואורסצנציה במרווחים אחידים של ה-ROI. לאחר מכן, נקודות הנתונים שנאספו יסוכמו.

מכפיל סטיית תקן יקבע את רמת האות מעל קו הבסיס שתיכלל ב-ROI; יש לוודא כי נבחרה אפשרות העוצמה המשולבת (integrated intensity) לצורך החישובים, מכיוון שהיא מייצגת את נפח הפיקסלים נטו עבור אזורים מוגדרים ללא תלות בגודלם. פלואורסצנציית רקע תכמת מתוך ביקורות ה-mock infected ותשמש להערכת העוצמה המשולבת בבארות הבדיקה. הפלואורסצנציה באינפרא-אדום מבארות כפולות המכילות דילולות סדרתיות של נגיף שעבר תיתור משמשת לבניית עקום סטנדרטי.

ניתן להשתמש בעקומת הסטנדרט כדי לקבוע את הטיטרים של נוזל BAL מעכברים מזוהמים. בניסוי זה, נצפתה עלייה משמעותית בעומס הוויראלי ביום השני והרביעי. כפי שמוצג כאן, הווירוס פונה מהגוף עד ליום ה-10 לאחר ההדבקה.

טיטרים ויראליים שנמדדו באמצעות בדיקה זו נמצאים במתאם טוב עם ירידה במשקל העכברים לאחר הדבקה. ניתן להחיל טכניקה זו גם על דגימות אנושיות. מוצג כאן כימות של נגיף H1N1 מתוך סוואב נזאלי אנושי.

גבול הגילוי כאן הוא 10 בחזקת 3 TCID או מנה זיהומית לתרבית רקמה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך את תיתור נגיפי השפעת באמצעות בדיקה המבוססת על צבע אינפרא-אדום. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית מכיוון שהשימוש במדמם ה-corp עשוי להיות קשה, וסרטון זה יעזור לפשט ולהדגים את השיטות שלנו לכימות תיתורים נגיפיים בלוח של 96 או 384 בארות.

ולסיום, אל תשכחו שעבודה עם נגיפים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות מקדימים, כגון ציוד מיגון אישי, בעת ביצוע פרוצדורה זו.