תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת ביעילות את טיטר נגיף השפעת בדרכי הנשימה של עכברים נגועים. עכברים מחוסנים תחילה דרך האף בנגיף השפעת בזמן שנבחר. נקודות לאחר הדבקה.

ה-M מוקרבים ונאספת שטיפת סימפונות או נוזל BAL. לאחר מכן, נוזל ה-BAL משמש להדבקת תאי MDCK. לאחר מכן ניתן לצבוע תאים נגועים לנוכחות חלבונים נגיפיים באמצעות נוגדנים ראשוניים ספציפיים, ואחריהם נוגדנים משניים מצומדים אינפרא אדום.

אותות אינפרא אדום נקראים באמצעות סורק Lycor Odyssey וניתן להשתמש בתוכנת Odyssey כדי לקבוע טיטרים ויראליים. באמצעות עקומה סטנדרטית ניתן לקבל קביעה כמותית של טיטרים ויראליים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הם הכימות המדויק של הטיטר הנגיפי, יכולת השחזור והנפח הקטן הנדרש לביצוע בדיקה זו.

ניתן להרחיב את ההשלכות של טכניקה זו לאבחון וטיפול במחלות נגיפיות נשימתיות שונות מכיוון שניתן להשתמש בה כדי לכמת טיטרים נגיפיים בדגימות קליניות בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטה אחרת כמו QPCR על מנת לענות על שאלות נוספות כגון מספר עותק ויראלי. בעת ניסיון טכניקה זו, חשוב לזכור לבדוק את וירוס הבקרה הסטנדרטי של הטיטר לאחר התפתחות זו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקר בתחום הלוגיקה הנגיפית לחקור טיטר וירוס או חלבון נגיפי כתם פיתול בדגימות קליניות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 17 שעות. הוא ביצע במדויק להדביק עכברים תוך האף עם 5,000 יחידות פלטפורמה או PFU של PR שמונה נגיף שפעת ב-30 מיקרוליטר של PBS סטרילי או עם PBS בלבד כבקרה שלילית לאיסוף נוזל BAL מבעלי חיים שעברו המתת חסד תחילה, לחתוך את חלל בית החזה ולבצע חתך של סנטימטר אחד במקביל לקנה הנשימה כדי לחשוף אותו עם מספריים סטריליים עדינים.

בצע חתך קטן בקנה הנשימה, החדיר לקנה הנשימה 0.5 מיליליטר של 1% BSA המכיל PBS ושאב בעדינות את נוזל השטיפה החוצה. אחסן את נוזלי ה-BAL בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס כדי לכמת את הטיטר הנגיפי בנוזלי שטיפה. תרבית ראשונה של 5 מיליון תאי MDCK ב-20 מיליליטר של RPMI מלא בבקבוק T 75 למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס למחרת, קצרו את התאים וצלחו אותם בצלחת אופטית שטוחה שחורה 96 באר ב-10,000 תאים לבאר.

לאחר מכן דגרו את הצלחת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס לאחר הדגירה. שאפו בעדינות את הסופרנטנט ושטפו את התאים פעמיים ב-DMEM מלא אך נטול סרום המכיל 0.2% BSA במקום FBS. לאחר שטיפת התאים, הוסיפו 50 מיקרוליטר של נוזל BAL או 50 מיקרוליטר של תרחיף המכיל ריכוז ידוע של נגיף לכל באר.

לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר לבאר של DMEM, מדיום המכיל טריפסין שטופל ב-TPCK ב-0.2 מיקרוגרם למיליליטר כדי לשפר את ההיצמדות, הכניסה והשכפול של הנגיף. דגרו על התאים למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לנגיף להיספג. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של FBS המכילים RPMI מלא לכל באר תרבית התאים למשך הלילה כדי לאפשר לזיהום להתפשט לאחר הדגירה הלילית.

שוטפים את התאים עם 100 מיקרוליטר של 1% B-S-A-P-B-S. לאחר שטיפת התאים, הוסיפו 100 מיקרוליטר לבאר של 1% פרה פורמלדהיד ודגרו על הצלחות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים לאחר מכן שטפו עם 100 מיקרוליטר לבאר של 1% B-S-A-P-B-S ודגרו על התאים למשך 30 דקות נוספות לחסימה. לאחר חסימת התאים, יש להוסיף 50 מיקרוליטר לבאר של אנטי-ויראלי M ראשוני שני נוגדנים מדוללים ב-1 עד 1000, ולדגור על הצלחות למשך שעה בטמפרטורת החדר כדי להכתים כל חלבון ויראלי הקיים לאחר הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים ב-1% B-S-A-P-B-S ולדגור אותם עם 100 מיקרוליטר לבאר של נוגדן משני מצומד בצבע אינפרא אדום בדילול של 1 עד 200 למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך לאחר שהתאים מוכתמים, שטפו אותם פי שלושה מבעבר.

לאחר מכן מקם את הלוחות על פלטפורמת זכוכית הקריאה של סורק האינפרא אדום Licor Odyssey. בחר את הגדרת צלחת 96 בארות בקורא באמצעות תוכנת Licor Odyssey. זהה את בארות הבקרה השליליות הריקות, ולאחר מכן כמת את הקרינה מכל הצלחת.

השתמש בכלי הצורה האוטומטית כדי לצייר את אזור העניין או את ההחזר על ההשקעה באמצע הבדיקה. ובכן השתמש בהחזר ההשקעה משליטה שלילית. ובכן, כדי להגדיר את ערך הקרינה הבסיסי עבור הבדיקה, הציגו את שתי שערות הצלב המנוגדות המסופקות על ידי תוכנת Odyssey בתוך ה-ROI כדי למדוד את עוצמת הקרינה על פני הבאר.

לאחר מכן, סרוק את הצלחת באמצעות ערוץ 780 ננומטר לזיהוי ו-680 ננומטר כאורך גל הייחוס. לאחר הפעלת פקודת הקריאה, יימדדו עוצמות פלואורסצנטיות במרווחים אחידים של ההחזר על ההשקעה. ואז שולבו נקודות הנתונים שנאספו.

מכפיל סטיית תקן יקבע את רמת האות מעל קו הבסיס הכלולה בהחזר ה-ROI, הקפד לבחור באפשרות העוצמה המשולבת לחישובים מכיוון שהיא מייצגת את נפח הפיקסלים נטו עבור אזורים מוגדרים ללא תלות בגודל. הקרינה ברקע תכומת מהבקרות הנגועות המדומות ותשמש להערכת העוצמה המשולבת בבארות בדיקה. הקרינה האינפרא אדום מבארות כפולות המכילות דילולים סדרתיים של נגיף טיטר משמשת לבניית עקומה סטנדרטית.

לאחר מכן ניתן להשתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לקבוע את הטיטר של נוזל BAL מעכברים נגועים. בניסוי זה נצפתה עלייה משמעותית בעומס הנגיפי ביום השני והרביעי. הנגיף לאחר ההדבקה נוקה עד היום העשירי כפי שמוצג כאן.

טיטרים נגיפיים שנמדדו באמצעות בדיקה זו נמצאים בקורלציה טובה עם ירידה במשקל העכבר לאחר הדבקה. ניתן ליישם טכניקה זו גם על דגימות אנושיות. מוצג כאן כימות של נגיף H אחד N אחד ממקלון אף אנושי.

גבול הזיהוי כאן הוא 10 למינון הזיהומי השלישי של TCID או תרבית רקמה. לאחר צפייה בסרטון זה, יש לך גם הבנה טובה כיצד להעריך את טיטר נגיף השפעת באמצעות בדיקה מבוססת אינפרא אדום. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית מכיוון שהשימוש בהדמיית הגוף יכול להיות קשה וזה יעזור לפשט ולהדגים את השיטות שלנו לכימות טיטרים נגיפיים בצלחת באר 96 או 384.

ולבסוף, אל תשכח שעבודה עם וירוס עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש ליטול קודמנים כגון ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.