שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ"א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

מטרת סרטון זה היא להדגים את השיטה לבידוד וזיהוי של רכיבי RNA וחלבונים מקומפלקסים של ריבנוקלאופרוטאין מתוך תמציות תאים באמצעות שיטות של אימונופרסיפיטציה. שלום, שמי גארט דום ואני סטודנט לתואר מתקדמים במחלקה למיקרוביולוגיה מולקולרית ואימונולוגיה באוניברסיטת מיזורי, תחת הדרחתו של ד"ר אלי סו. בעקבות ההתקדמות בריצוף רב-סמיכות ובניתוח יעיל של מערכים זעירים (microarray), ביטוי גנים גלובלי וניתוחו הפכו לצורה קלה וזמינה של איסוף נתונים במודלים רבים של מחקר ומחלות.

עם זאת, רמות ה-mRNA של הגן המטרה במצב יציב אינן תמיד נמצאות במתאם ישיר עם רמות החלבון במצב יציב. בקרה גנטית לאחר השעתוק היא הסבר סביר לשוניקלות בין השניים, המונעת על ידי אינטראקציות של חלבונים קושרים RNA.

בקרה פוסט-טרנסקריפציונלית משפיעה על לוקליזציה, יציבות ותרגום של mRNA על ידי יצירת קומפלקס ריבנוקלאופרוטאין עם mRNA מטרה. זיהוי מטרות mRNA לא ידועות אלו מתוך תמציות תאיות בקומפלקס זה הוא קריטי להבנת המכניזמים והתפקודים של חלבונים קושרי RNA והשפעתם הנובעת על תפוקת החלבון. פרוטוקול זה מתווה שיטה המכונה immuno immunoprecipitation של ריבופרוטאין, או RIP, המאפשרת זיהוי של mRNA ספציפיים הקשורים לקומפלקס הריבנוקלאופרוטאין.

לפני תחילת הניסוי, קריטי שכל الريאגנטים, המכלים והכלים יהיו זמינים. יש לטפל בכלי זכוכית עם מעכב RNase, כגון RNA ZAP מבית Ambion, ולאחריו שטיפה במים שטופלים ב-dpci, ולוודא שכל הריאגנטים מאושרים כנקיים מ-RNA. השלב הראשון של הפרוטוקול הוא בידוד של קומפלקס הריבנוקלאו-חלבון מהליזט התאי; יש לאסוף תאי רקמה הגדלים באופן אקספוננציאלי כדי להפיק בין 2 ל-5 mg של חלבון סה"כ עבור כל דגימה שנעשה בה שימוש; בדרך כלל שתי צלחות תרבית מסוג P150 מספיקות.

כאן אנו קוצרים את שורות תאי סרטן השד האנושיים MB 2 31 ו-MC seven ובוחנים את האינטראקציות של הריבונוקלאו של החלבון קושר ה-RNA. חשוב לציין כי עבור כל חלבון קושר RNA הנבדק, יש לאפטמיזציה את מספר התאים הכולל ואת כמויות החלבון כדי למקסם את האינטראקציות המתאימות בין ה-mRNA למטרה לבין החלבון קושר ה-RNA. השקיעו את התאים באמצעות סנטריפוגציה במהירות של 1000 RPM למשך כ-8 עד 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים ב-PBS קר מאוד. לאחר השטיפה האחרונה, נקשו בעדינות על תחתית המבחנה והשעיכו מחדש את משקע התאים בנפחים שווים של באפר לליזה פוליסומלי מוכן עם מעכבי RNase ופרוטאז.

מומלץ למדוד את הנפח המדויק של משקע התאים, לשאוב בעדינות את התערובת באמצעות פיפטה כדי לפרק גושי תאים ולהדגיר את הליזאט על קרח למשך חמש דקות. סבב במ centrifuge ב-13,000 G למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי לנקות את הליזאט משאריות; העבר מיד את העלייה המנוקה למבחנות מיקרו-צנטריפוגה מקוערות מראש עבור RNA, שמור על קרח ואחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

ניתן לשמור ליזט זה למשך עד שישה חודשים במינוס 80 מעלות צלזיוס. יש להימנע ממספרי הפשרה וההקפאה חוזרים, שכן הדבר עלול להוביל לפירוק של חלבונים ו/או mRNA. מומלץ לבצע את ה-IP באופן מיידי.

בצעו מדידה כמותית מהירה של ריכוז החלבון בליזאט באמצעות בדיקת חלבון בשיטת Bradford סטנדרטית. לאחר מכן, נצטרך להכין את החומרים לבידוד החלבון הספציפי המבוקש. ראשית, בצעו נפיחות מוקדמת של החלבון.

השרה של חרוזי Sphero למשך לילה בבופר NT two בתוספת 5%BSA, באחסון בטמפרטורה של 4°C. השתמש בבופר NT two ביחס של 4:1 עם חרוזי PAS. ניתן לאחסן לטווח ארוך למשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4°C.

כאשר מוסיפים 0.1% sodium azi לפני השימוש, יש להסיר עודפי תמיסת NT two כך שיחס החרזים לתמיס יישאר ביחס של אחד לאחד. באמצעות מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter נקיות מ-RNA, יש להוציא 100 microliters של SRO speed slurry ולהוסיף 30 micrograms של נוגדן עבור כל תגובת IP בודדת. לדוגמה, בניסוי שלנו השתמשנו בנוגדן who are, שהוא נוגדן mouse IgG one.

לפיכך, הנוגדן השליטה שלנו הוא גם מסוג IgG 1. בשלב הבא, הוסיפו 100 עד 200 µL של בופר NT 2 לתערובת הנוגדנים והחרוזים. בנוסף, יש להשתמש במקביל בנוגדן תואם איזוטייפ או בסרום נורמלי שלם מאותו מין כשליטת נוגדנים נגד רקע של RNA.

הוסיפו נוגדן מתאים לתערובת החרוזים והדגירו למשך לילה בערבול סיבובי (tumbling) בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הכינו את החרוזים המצופים בנוגדן מיד לפני השימוש על ידי שטיפה עם 1 mL של בופר NT2 קר מאוד בקרח, חמש פעמים; שטפו את החרוזים באמצעות סרכזגה ב-13,000 G למשך אחת עד שתי דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות. הסירו בזהירות את על-משקע באמצעות פיפטה ידנית או שואב (aspirator).

שטיפה זו מסייעת בהסרת נוגדנים שאינם קשורים וכן זיהומי RNAs מתערובת הנוגדנים. עם השלמת השטיפה האחרונה, יש לסספנד מחדש את החרוזיים ב-700 µL של תמיסת NT2 קרה מהקרח, ולאחר מכן לטפל במעכבי RNAs שונים כדי להגן על ה-mRNAs המטרה, כולל 10 µL של RNase OUT, 10 µL של 100 mM DTT ו-15 µL של EDTA. יש להביא את הנפח ל-900 µL באמצעות תמיסת NT2.

בשלב הבא, נבצע שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של הקומפלקס המטרה. אנו ממליצים בחום להשתמש בשלב של ניקוי מקדים (pre-clear) כדי להפחית את רעש הרקע בניתוח ה-RNA לאחר הליך ה-RIP; בצעו ניקוי מקדים עם 15 micrograms של בקרת isotype למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הוסיפו 50 microliters של חרוזי PAS שנפחו מראש ואינם מצופים בנוגדן.

דגרו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C עם סיבוב, ולאחר מכן centrifugate במהירות של 10,000 G בטמפרטורה של 4°C. השקיעו את המשקע. שמרו את הנוזל העליון (supernatant) עבור ip.

בשלב הבא, העבירו 100 µL של ליזט (lysate) מנוקה ומבודל, המכיל כ-שני עד חמישה mg של חלבון, אל תערובת הנוגדנים שהוכנה. דילול הליזט יסייע להפחית את הרקע; סגרו את הפ menutup את המבחנה היטב כדי להבטיח איטום מלא, והדגירו בטמפרטורה של 4 °C למשך ארבע שעות תוך כדי תנועה סיבובית (tumbling). לאחר מכן, השקיעו את חרוזי הפלטין (beads) במהירות של 5,000 G למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C, ושמרו את הסופרנאט (supernatant) לאנליזה פוטנציאלית על ידי אחסון בטמפרטורה של 80- °C, כפי שתואר בעבר. שטפו את החרוזים חמש פעמים עם 1 mL של בופר TNT2 קר, ולאחר מכן ביצעו צנטריפוגציה.

לאחר מכן, הסירו את הנוזל העיל באמצעות פיפטה ידנית או שואב (aspirator). ניתן להשתמש בשיטות קפדניות יותר כדי להפחית את הרקע על ידי תוספת של sodium deoxy coate, urea או SDS לתמיפת NT two. שמרו את הדגימות על קרח ככל האפשר ועבדו במהירות כדי למזער את פירוק ה-mRNA של המטרה.

לבסוף, נשתמש בטיפולים ב-DNAs וב-proteinase K ולאחריהם שקיעת RNA כדי לבודד את ה-RNAs של החלבוני הריבונוקלאים; לאחר השטיפה, השביה מחדש את החרו지를 ב-100 µL של N NT two buffer מועשר ב-5 µL של RNAs free DNAs one. שמור את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך 5 עד 10 דקות. הוסף 1 mL של N NT two buffer וסבב ב-5,000 ×g למשך חמש דקות.

השליכו את תג שם ה-SUPERNAT מהסרבבג' (spin protein a SROs), והוסיפו למשקע 100 microliters של NT two buffer עם five microliters של proteinase K בריכוז 10 milligrams per milliliter ואחד microliter של 10% SDS. דגרו את תערובת החרוזיים המושהית למשך 30 דקות במקבץ מים בטמפרטורה של 55 degree Celsius, תוך써 הנקשה עדינה מדי 10 דקות. Proteinase K יסייע לשחרור רכיבי הריבו-נוקלאו-פרוטאין. השקיעו את החרוזיים לצנטריפוגה.

סובב ב-5,000 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואסוף את supernatant, שנפחו אמור להיות כ-100 microliters. לאחר מכן, הוסף לخرזיים 200 microliters של NT two buffer וסובב ב-5,000 G למשך שתי דקות. אסוף כ-200 microliters של supernatant והשלך את החרוזים.

יש לשלב את הנוזל העליון (supernatant) ולהוסיף 300 microliters של חומצת פנול לשכבה התחתונה, ואז לערבב ב-vortex. יש להמתין דקה אחת בטמפרטורת החדר ולסבב בצנטריפוגה במהירות מקסימלית בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לאחר מכן, יש לאסוף 250 microliters מהשכבה העליונה.

הקפידו מאוד לא להפריע לממשק, שכן הדבר יגרום לזיהום. לדגימת ה-RNA, הוסיפו 25 µL של sodium acetate ב-pH של 5.2, 625 µL של ethanol 100% מקורר וחמישה µL של glyco blue mix. אחסנו במקרר למשך לילה בטמפרטורה של 20- °C.

בנוסף, כדי להבטיח השגה נאותה של ה-RNA, הוספת glyco blue תגביר את נראות משקע ה-RNA על ידי תפקוד כמולקולת נשא. למחרת, ערבבו את המבחנות על ידי הפיכה של שלוש עד חמש פעמים, ולאחר מכן סובבו בцентריפוגה ב-12,000 G בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות והסילו את הנוזל העליון (supernatant). הוסיפו 1 mL של ethanol 70% מקורר למשקע הכחול וערבבו על ידי הפיכה או vortexing, ולאחר מכן סובבו בцентריפוגה.

סבב את הדגימה ב-12,000 G בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. השלך את הסופרנאט וסבב שוב ב-12,000 G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. הסר שאריות של 70% ethanol באמצעות פיפטה ויבש את המשקע באוויר.

השאירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. המיסו מחדש ב-20 עד 40 µl של מים נקיים מ-RNA ו-DNA. הדגימה מוכנה כעת לכימות באמצעות ספקטרומטריית NanoDrop וליישומים המשכיים כגון quantitative real-time PCR או אנליזת microarray. לאחר בידוד ה-RNA, בוצעו microarray ו-quantitative real-time PCR כדי לחשוף את יעדי ה-mRNA של החלבון הקושר RNA, ואת ההעשרה שהתקבלה מה-immunoprecipitation.

אישור באמצעות western blot חושף בידוד נקי של חלבוני ריבנוקלאו-פרוטאין. PCR כמותי מדגים את פי העשירה של ה-mRNA של יעד beta actin בהשוואה לבקרי IgG. בעוד שניתוח microarray חושף פרופילים גנטיים ייחודיים בין MC seven ל-MB 2 31, שורות תאי סרטן השד, באופן כללי, שיטת immunoprecipitation של ריבנוקלאו-פרוטאין הוכחה על ידי הקבוצה שלנו, כמו גם על ידי קבוצות מחקר רבות אחרות, ככלי מצוין המשמש לבידוד ולבדיקה של האינטראקציות בין חלבונים קושרים של RNA לבין יעדי ה-mRNA שלהם; למרות טבעה הרגיש של השיטה בביצוע, יישום נכון של הליך זה יניב בידוד של קומפלקסי ריבנוקלאו-פרוטאין אלו, אשר עד לא מזמן לא היו נגישים לגילוי ולניתוח.