שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ"א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

מטרת סרטון זה היא להדגים את השיטה לבידוד וזיהוי של RNA ורכיבי חלבון של קומפלקסים של ריבונוקלאופרוטאין מתמציות תאים בשיטות אימונו-משקעים. שלום, שמי גארט דום ואני סטודנט לתואר שני במחלקה למולקולרית ומיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת מיזורי ולומד אצל ד"ר אלי סו. מההתקדמות בריצוף תפוקה גבוהה וניתוח מיקרו-מערך יעיל, ביטוי וניתוח גנים גלובליים הפכו לצורה קלה וזמינה של איסוף נתונים במודלים רבים של מחקר ומחלות.

עם זאת, רמות מצב המחקר של mRNA של גן המטרה לא תמיד נמצאות בקורלציה ישירה עם רמות חלבון במצב יציב. ויסות גנים לאחר שעתוק הוא הסבר סביר להבדלים בין השניים. מונע על ידי האינטראקציות של חלבונים קושרי RNA.

ויסות לאחר שעתוק משפיע על לוקליזציה, יציבות ותרגום mRNA על ידי יצירת קומפלקס חלבון גרעין צלעות עם mRNA מטרה. זיהוי מטרות ה-mRNA הלא ידועות הללו של Denovo מתמציות תאיות בקומפלקס זה הוא חיוני להבנת המנגנונים והתפקודים של חלבון קושר ה-RNA והשפעתם הנובעת מכך על תפוקת החלבון. פרוטוקול זה מתאר שיטה הנקראת חלבון ריבו, immuno immunoprecipitation, או rip, המאפשרת זיהוי של mRNAs ספציפיים הקשורים לקומפלקס הריבונוקלאופרוטאין.

לפני תחילת הניסוי, קריטי שיהיו את כל הריאגנטים, המיכלים והכלים. כלי זכוכית לטיפול חופשי ב-RNA עם מעכב R nase כגון RNA ZAP מאמביון, ואחריו שטיפה במים שטופלו ב-dpci, מבטיחים שכל הריאגנטים מאושרים כנטולי RNA. השלב הראשון בהליך הוא לקצור את קומפלקס חלבון גרעין הצלעות מקציר הליזאט התאי תאי רקמה הגדלים באופן אקספוננציאלי כדי לייצר בין שניים לחמישה מיליגרם של חלבון כולל עבור כל דגימה בשימוש, בדרך כלל מספיקות שתי מנות תרבית P אחת 50.

כאן אנו קוצרים MB 2 31 ו-MC שבעה קווי תאי סרטן שד אנושיים וחוקרים את אינטראקציות גרעין הריבון של חלבון קושר ה-RNA. למי חשוב לציין עבור כל חלבון קושר RNA הנחקר, יש לבצע אופטימיזציה של מספר התאים הכולל וכמויות החלבון כדי למקסם את האינטראקציות המתאימות של mRNA וחלבון קושר RNA. תאי גלולה באמצעות צנטריפוגה ב-1000 סל"ד למשך כשמונה עד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים עם PBS קר כקרח לאחר הכביסה האחרונה, העבירו בעדינות את תחתית הצינור והשעו מחדש את כדור התא בנפחים שווים של מאגר ליזה פוליסומלי מוכן עם RNA ומעכבי פרוטאז.

מומלץ למדוד את הנפח המדויק של כדור התא, לפזר בעדינות את תערובת הפיפטות כדי לפרק גושי תאים ולדגור ליזאט על קרח למשך חמש דקות. צנטריפוגה ב-13,000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לנקות את הליזאט מפסולת מעבירה מיד את הסופרנטנט המנוקה ל-RNA מקורר מראש. צינורות מיקרו צנטריפוגות בחינם נשמרים על קרח ומאוחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס.

ניתן לאחסן ליזאט זה עד שישה חודשים במינוס 80 מעלות צלזיוס. הימנע ממחזורי הפשרה חוזרים ונשנים בהקפאה מכיוון שהדבר עלול להוביל לפירוק חלבון ו/או mRNA. עדיף לעשות את ה-IP באופן מיידי.

בצע כימות מהיר של ריכוז החלבון והליזאט באמצעות בדיקת חלבון ברדפורד סטנדרטית. לאחר מכן, נצטרך להכין את החומרים לבידוד החלבון הספציפי שמעניין אותנו. ראשית יש להתנפח.

חרוזי Sphero לילה ב- N NT שני מאגר בתוספת 5% BSA מאגר בארבע מעלות צלזיוס. השתמש במאגר NT שני ביחס של ארבעה לאחד עם חרוזי PAS. אחסון לטווח ארוך של עד מספר חודשים בארבע מעלות צלזיוס אפשרי.

בתוספת 0.1% נתרן אזי לפני השימוש, הסר עודף NT two buffer כך שיחס החרוזים הסופי לחצץ יהיה אחד לאחד. באמצעות צינורות מיקרו צנטריפוגות ללא RNA בנפח 1.5 מיליליטר, הסר 100 מיקרוליטר של תמיסת מהירות SRO והוסף 30 מיקרוגרם נוגדן לכל תגובת IP בודדת. לדוגמה, בניסוי שלנו אנו משתמשים בנוגדן, שהוא נוגדן IgG אחד של עכבר.

לכן נוגדן הבקרה שלנו הוא גם IgG אחד. לאחר מכן, הוסף 100 עד 200 מיקרוליטר של NT שני מאגר לתערובת חרוזי נוגדנים. בנוסף, יש להשתמש בנוגדנים תואמי איזוטיפ או בסרום תקין שלם מאותו מין במקביל כבקרת נוגדנים כנגד RNA ברקע.

הוסף נוגדן מתאים לתערובת החרוזים ודגר למשך הלילה בקצה בארבע מעלות צלזיוס. הכינו חרוזים מצופים נוגדנים מיד לפני השימוש על ידי שטיפה עם מיליליטר אחד של NT קר כקרח שני חוצצים חמש פעמים שטפו חרוזים על ידי צנטריפוגה ב-13,000 גרם למשך דקה עד שתיים בארבע מעלות. הסר בזהירות את הסופרנטנט בעזרת צינור ידני או שואב.

שטיפה זו מסייעת בהסרת נוגדנים לא קשורים כמו גם מזהמי RNA מתערובת הנוגדנים. לאחר השלמת השטיפה הסופית, החייאה השעתה את החרוזים ו-700 מיקרוליטר T קר כקרח שני חוצצים, ולאחר מכן טיפול במעכבי RNA שונים כדי להגן על ה-mRNAs המטרה, כולל 10 מיקרוליטר של RNAs, מתוך 10 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי DTT ו-15 מיקרוליטר של EDTA. הביאו נפח ל-900 מיקרוליטר עם NT שני מאגרים.

לאחר מכן, נזרז את קומפלקס המטרה. אנו ממליצים בחום להשתמש בשלב טרום-קליר כדי להפחית את אות הרקע בניתוח ה-RNA שלך לאחר הליך קריעה מראש עם 15 מיקרוגרם של בקרת איזוטיפ למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הוסף 50 מיקרוליטר של חרוזי PAS נפוחים מראש שאינם מצופים בנוגדן.

דגירה 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב ומעלה בצנטריפוגה ב-10,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. שתי גלולות. שמור את הסופר נאטין ל-ip.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של ליזט מבודד עם כ-2 עד 5 מיליגרם חלבון לתערובת נוגדנים מוכנה. דילול ליזאט יעזור להפחית את צינור עטיפת הרקע והפרפורם כדי להבטיח תקרה הדוקה ודגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות נפילה ושוב בחרוזי הגלולה הבאים ב-5,000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשמור סופרנט לניתוח פוטנציאלי על ידי אחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס כפי שתואר קודם לכן. שטפו חרוזים חמש פעמים עם מיליליטר אחד של קר קרח ו-T שני חיץ וצנטריפוגה.

לאחר מכן הסר את סופר נאטין בעזרת פיפטר ידני או שואב. ניתן להשתמש בשיטות מחמירות יותר על מנת להפחית את הרקע על ידי השלמת NT 2 buffer עם נתרן דאוקסי קואט, אוריה או SDS. שמור דגימות על קרח ככל האפשר ועבוד במהירות כדי למזער את הפירוק של mRNA המטרה.

לבסוף, נשתמש בטיפולי DNA ופרוטאינאז K ואחריהם משקעי RNA כדי לבודד את RNA החלבון הגרעיני של ריבון לאחר שטיפת חרוזי השעיה עם 100 מיקרוליטר של N NT שני מאגר בתוספת חמישה מיקרוליטרים של RNA ללא DNA אחד. שמור דגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות. הוסף מיליליטר אחד של N NT שני מאגר וסובב ב -5, 000 גרם למשך חמש דקות.

השליכו את חלבון הספין של SUPERNAT Reese כדור SROs ו-100 מיקרוליטר NT שני חוצץ עם חמישה מיקרוליטר של חלבון K ב-10 מיליגרם למיליליטר ומיקרוליטר אחד של 10% SDS דגרו על תערובת החרוזים המושהה למשך 30 דקות באמבט מים של 55 מעלות צלזיוס תוך החלקה עדינה כל 10 דקות. פרוטאינאז K יסייע בשחרור מרכיבי חלבון נוקלאו הצלעות. חרוזי גלולה.

הוסף 5, 000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, אסוף את שם העל, שאמור להיות בערך 100 מיקרוליטר בנפח. שני החרוזים הבאים, הוסף 200 מיקרוליטר של NT שתי צנטריפוגות חיץ ב -5, 000 גרם למשך שתי דקות. אוספים כ-200 מיקרוליטר סופר נאטין וזורקים חרוזים.

שלב סופר נאטין והוסף 300 מיקרוליטר של מערבולת פנול חומצה בשכבה התחתונה. דקה אחת בטמפרטורת החדר וצנטריפוגה במהירות מקסימלית בטמפרטורת החדר למשך דקה. אוספים 250 מיקרוליטר של שכבה עליונה.

היזהר מאוד לא להפריע לממשק מכיוון שזה יזהם. דגימת RNA מוסיפה 25 מיקרוליטר נתרן אצטט ב-pH של 5.2,625 מיקרוליטר צונן, 100% אתנול וחמישה מיקרוליטרים של תערובת גליקו כחולה. ובכן יש לאחסן למשך הלילה בחום של מינוס 20 מעלות צלזיוס.

בנוסף כדי להבטיח התאוששות תקינה של RNA. תוספת של גליקו כחול תגביר את הנראות של גלולת ה-RNA על ידי פעולה כמולקולת נשא למחרת, ערבוב צינורות על ידי היפוך שלוש עד חמש פעמים, ואז סיבוב ב-12,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות והשלכת הסופר נאטין. הוסף מיליליטר אחד של אתנול צונן של 70% לגלולה הכחולה וערבב על ידי צנטריפוגה היפוכה או מערבולת.

דגימה ב-12,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. השליכו סופרנט וצנטריפוגה ב-12,000 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. הסר כל שאריות אתנול 70% בעזרת פיפט וכדור יבש באוויר.

מוסיפים את טמפרטורת החדר למשך חמש דקות. להוציא מחדש 20 עד 40 מיקרוליטר של RNAs, מים ללא DNA. הדגימה מוכנה כעת לכימות על ידי ספקטרומטריית NanoDrop ויישומים נוספים במורד הזרם כגון PCR כמותי בזמן אמת או ניתוח מיקרו-מערך לאחר בידוד RNA, מיקרו-מערך ו-PCR כמותי בזמן אמת בוצעו כדי לחשוף את מטרות ה-mRNA של חלבון קושר ה-RNA שהם, ואת ההעשרה הנובעת מכך מהמשקעים החיסוניים.

אישור על ידי כתם מערבי חושף בידוד נקי של מי הם חלבון. PCR כמותי מדגים את העשרת הקיפול של מטרת ה-mRNA בטא אקטין בהשוואה לבקרות IgG one. בעוד שניתוח מיקרו-מערך חושף פרופילים גנטיים ייחודיים בין MC 7 ל-MB 2 31, קווי תאי סרטן השד הוקמו ככלי מצוין המשמש לבידוד ולחקר האינטראקציות בין חלבוני קשירת RNA ל-MR שלהם. מטרות של הקבוצה שלנו, כמו גם של קבוצות מחקר רבות אחרות, למרות שהן רגישות באופיין ובפרקטיקה, ביצוע נכון של הליך זה יניב בידוד של קומפלקסים אלה של חלבוני גרעין הצלעות, שעד לאחרונה לא היו נגישים לגילוי וניתוח.