Name: שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנא ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: למד שיטת RIP לבידוד וזיהוי mRNAs וחלבונים במכלולי ribonucleoprotein מתמציות תאים. הפרוטוקול מאפשר חקר אינטראקציות של חלבוני קישור RNA ורגולציה גנטית בתרביות תאי סרטן שד אנושיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

משרד ההגנה (פרס הרעיון W81XWH-07-0406) - כדי Ulus אטסוי NIH RO1 A1080870 - כדי Ulus אטסוי NIH R21 A1079341 - כדי Ulus אטסוי אוניברסיטת מיזורי קרנות מוסדיות - כדי Ulus אטסוי

<ol><li>Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+protein+HuR+differentially+regulates+unique+subsets+of+mRNAs+in+estrogen+receptor+negative+and+estrogen+receptor+positive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.</a> BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).</li>
<li>Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+RNA+binding+protein+HuR+impairs+tumor+growth+in+triple+negative+breast+cancer+associated+with+deficient+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).</li>
<li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP-Chip%3A+the+isolation+and+identification+of+mRNAs%2C+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonomics%3A+identifying+mRNA+subsets+in+mRNP+complexes+using+antibodies+to+RNA-binding+proteins+and+genomic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays.</a> Methods. 26, 191-198 (2002).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+regulatory+analysis+using+en+masse+nuclear+run-ons+and+ribonomic+profiling+with+autoimmune+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera.</a> Gene. 317, 79-87 (2003).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).</li>
<li>Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+RIP-Chip+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in RIP-Chip Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).</li>
<li>de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).</li>
<li>de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuR%3A+post-transcriptional+paths+to+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">HuR: post-transcriptional paths to malignancy.</a> RNA Biol. 2, 11-13 (2005).</li>
<li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+stability+using+transcription+inhibitors+and+microarrays+reveals+posttranscriptional+control+of+ribosome+biogenesis+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors.</a> Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).</li>
<li>Hieronymus, H., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA-protein+interactions+illustrates+specificity+of+the+mRNA+export+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery.</a> Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).</li>
<li>Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mRNA+surveillance+is+coupled+to+mRNA+export%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export.</a> Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).</li>
<li>Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Regulatory+Mapping+Indicates+that+the+RNA-Binding+Protein+HuR+Couples+Pre-mRNA+Processing+and+mRNA+Stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability.</a> Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

בשל האופי של ניסוי, אופטימיזציה וניסיון זה יהיו הדרכים מובטחות רק כדי לרכוש את התוצאות המצופות בהצלחה. בשלבים רבים של הליך זה, טמפרטורה וטיפול יעיל של חומרים הכימיים ומוצרים הם חשובים וקריטיים. תכנון וביצוע של טכניקה נכון יעזרו להבטיח כי הניסוי בוצע במסגרת זמן מתאימה בטמפרטורה האופטימלית המומלצת. נושא מרכזי בניסויי בידוד RNA הוא הרגישות של RNAs לשפלה ידי RNases. כל ריאגנטים צריכים להיות RNase חופשי ומאוחסן או משמש במכולות RNase חינם. זה הוא שלב קריטי בהבטחת השלמות של מדגם mRNA שלך. גם כאשר הניסוי מבוצע כראוי, עם זאת, התוצאה הרצויה לא יכולה להיות מושגת בשל האופי של האינטראקציה בין RBP וmRNAs היעד שלה. בעיה פוטנציאלית אחת היא שיש נמוכה או אפילו אין אות מרנ&quot;א מבודד על ידי RIP שבב.למרות שעשוי להיות אות מ-RNA המוחלט, זה עשוי להיות תוצאה של חלבון מחייב לקוי שנגרר על ידי החרוזים. הצעד הראשון הוא פתרון הבעיות כדי לאשר שlysate הסלולרי בשימוש יש ביטוי נאות RBP הספציפי. עם האישור, חלבון יכול להיות מבודד לאחר NT2 השטיפה הסופית וresuspended במאגר Laemmli או אחר חיץ denaturing מתאים ומחומם על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. ניתוח הכתם מערבי ניתן להשתמש בדגימות אלה בתיאום עם lysate קלט כמו גם בקרות שליליות כדי להבטיח מספיק למשוך למטה של ​​חלבון קשור. יתר על כן, בגלל lysing התא נדרש כדי לגשת לרכיבים אלה, הפוטנציאל לאינטראקציות בלתי תקינות ובלתי רצויות בין חלבונים וmRNA בדרך מופרדים עשוי להיות מוצג. אינטראקציות אלה עלולות להיקשר ו&quot; לספוג &quot;mRNAs היעד שלך או החלבונים מחייבים דרך אינטראקציות לא ספציפיות. בנוסף, חלבונים אלו בשיתוף שונהnditions יכול לקפל בוריאציות שונות, והמוטיבים המחייבים שלהם עשויים להיות נגישים לmRNAs היעד שלהם, ומונעים האינטראקציות ביניהם. שני אלה מחזקים את החשיבות של עבודה ביעילות, כמו גם ניצול האופטימלי הטמפרטורות מפורטים להגביל אינטראקציות בלתי רצויות אלה. בנוסף, אופטימיזציה של שטיפת תנאים לכל חלבון המטרה ספציפי תהיה קריטית למקסם את הטוהר של האינטראקציה. תנאים מחמירים יותר להדחה עשויים להיות נחוצים. לדוגמה, החיץ לשטוף ניתן להשלים עם SDS או כמות מתאימה של אוריאה להפחית אינטראקציות ורקע לא ספציפיות באות הפלט שלך. זה יהיה תלוי לחלוטין בRBP היעד של הנסיין, כמו גם את ה-mRNA היעד בתנאים הפיסיולוגיים הייחודיים שלהם. תנאים מסוימים לא יהיו מתאימים לכלים מסוימים mRNA ניתוח, שיצוינו בהכנת דגימות. לבסוף, למרות RIP הוא מוצלח בהעשרה של רנ&quot;אאינטראקציות RBP, בעיה מוכרת היטב עם שיטת RIP (שבב) היא חוסר היכולת לזהות את התחומים המחייבים הספציפיים של RBP על יעדי mRNA החולפים. כמה טכניקות צלב מקשר-יכולים לשמש אחרי RIP לבודד יעדי רצף ייחודיים, עם זאת, השימוש בקרינת UV בגלים קצרים נוטה להוביל לניזק חומצות גרעין. שיטה חדשה המכונית PAR-CLIP, או crosslinking ribonucleoside photoactivatable וimmuoprecipitation, מעסיקה ארוך UV-גל לשלב thiouridine לרנ&quot;א המתהווה המאפשר זיהוי של אתרי קישור ייחודיים מאינטראקציות RNA הוא יציבות וחולפות. בסך הכל, שבב RIP הוקם ככלי מצוין המשמש לבודד ולבחון את יחסי גומלין בין חלבונים המחייבים RNA ויעדי mRNA שלהם על ידי הקבוצה שלנו, כמו גם רבות קבוצות מחקר אחרות. למרות רגיש בטבע ובפועל, ביצוע נכון של הליך זה יניב את הבידוד של קומפלקסי RNP אלה, שעד לא מזמן, היה inaccessible לגילוי וניתוח.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 1 ז dithiothreitol </td><td> דיג </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> 1 DNase </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNase חופשי </td></tr><tr><td> Ethylendiamine חומצת Tetraccetic </td><td> דיג </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> גליקוגן </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> סיגמא </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7.0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 ז KCl </td><td> דיג </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ז MgCl 2 </td><td> דיג </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 מאגר </td><td> * ראה להלן </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מאגר תמוגה Polysome </td><td> * ראה להלן </td><td></td><td></td></tr><tr><td> טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז </td><td> רוש </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> חלבון חרוזי Sepharose </td><td> סיגמא </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> דיג </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNase אאוט RNase המעכב </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / μl </td></tr><tr><td> 1 ז NaCl </td><td> דיג </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> סולפט נתרן dodecyl </td><td> דיג </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 ז טריס-HCl </td><td> דיג </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7.4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> מכלולי Ribonucleoside Vanadyl </td><td> מעבדות ניו אינגלנד </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בירור מגיב </td></tr><tr><td> הכן ריאגנטים בRNase / DNase חינם, כלי הזכוכית DEPC טופלה </td></tr><tr><td> מאגר תמוגה Polysome </td></tr><tr><td> 100 המ&quot;מימ KCl </td></tr><tr><td> 5 המ&quot;מ MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 HEPES מ&quot;מ (pH 7.0) </td></tr><tr><td> 0.5% NP40 </td></tr><tr><td> 1 המ&quot;מ DTT </td></tr><tr><td> 100 יחידות / מיליליטר RNase אאוט </td></tr><tr><td> 400 מיקרומטר VRC </td></tr><tr><td> לוח קוקטייל מעכב פרוטאז </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל של חיץ תמוגה Polysome </td></tr><tr><td> הוסף 50 μl של 1 HEPES M (pH 7.0) </td></tr><tr><td> 500 μl של ז KCL 1 </td></tr><tr><td> 25 μl של ז MgCl 1 2 </td></tr><tr><td> 25 μl של NP40 </td></tr><tr><td> 4.7 המ&quot;ל RNase-DNase ללא H 2 O </td></tr><tr><td> 50 μl של M-DTT 1 </td></tr><tr><td> 12.5 μl של 100 U / המ&quot;ל RNase אאוט </td></tr><tr><td> קוקטייל 200 μl פרוטאז מעכב (מומס על פי יצרן) </td></tr><tr><td> 10 μl 200 המ&quot;מ VRC (בזמן שימוש) </td></tr><tr><td> NT2 מאגר </td></tr><tr><td> 50 mM טריס-HCl (pH 7.4) </td></tr><tr><td> 150 המ&quot;מ NaCl </td></tr><tr><td> 1 המ&quot;מ MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0.05% NP40 </td></tr><tr><td> 1 ליטר של NT2 מאגר </td></tr><tr><td> 50 המ&quot;ל טריס (pH 7.4) </td></tr><tr><td> 30 מ&quot;ל 5 M NaCl </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;ל 1 ז MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 NP40 μl </td></tr><tr><td> 820 המ&quot;ל RNase-DNase ללא H 2 O </td></tr></tbody></table>

שיטה לבידוד וזיהוי mrnas, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב rip

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

כתוצאה מההתפתחות של רצף תפוקה גבוהה וניתוח microarray יעיל, ניתוח ביטוי גנים העולמי הפך צורה קלה וזמינה של איסוף נתונים. במחקר רב ומודלים למחלות עם זאת, רמות המצב יציבות של mRNA גן היעד לא תמיד לתאם ישירות עם רמות חלבון המצב יציבות. רגולציה של גנים לאחר השעתוק היא הסבר סביר של הסטייה בין שתיים. מונע על ידי הקשירה של חלבונים מחייבים RNA (RBP), רגולציה שלאחר השעתוק משפיעה לוקליזציה-mRNA, יציבות ותרגום על ידי יצירת Ribonucleoprotein (RNP) מורכבת עם mRNAs היעד. זיהוי מטרות de mRNA נובו הידועות אלה מתמציות סלולריות במתחם RNP הוא מרכזי להבנת מנגנונים ופונקציות של RBP וההשפעה שלהם על תוצאת פלט חלבון. פרוטוקול זה מתאר שיטה כינתה RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), המאפשרת לזיהוי שלmRNAs pecific קשור במתחם ribonucleoprotein, תחת תנאי ניסוי משתנה, יחד עם אפשרויות לייעול נוסף לניסוי לחוקר הבודד. בכלי ניסיוני חשוב זה, חוקרים יכולים לחקור את המנגנונים המורכבים הקשורים לרגולציה של גנים שלאחר שעתוק, כמו גם אינטראקציות ribonucleoprotein אחרות.

צעד אחר צעד לפרוטוקול בידוד וזיהוי RNA מתחמים הקשורים באמצעות RIP שבב.

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

כתוצאה מפיתוחם של ריצוף רחב-פס (high-throughput sequencing) וניתוח יעיל של מערכי זקיקים (microarray), ניתוח גלובלי של ביטוי גנים הפך לקל ו...

מטרת סרטון זה היא להדגים את השיטה לבידוד וזיהוי של RNA ומרכיבי חלבון של קומפלקסים של ריבונוקלאופרוטאין מתוך תמריות תא באמצעות שיטות של immunoprecipitation. שלום, שמי גארט דום ואני סטודנט לתואר מתקדמים במחלקה למיקרוביולוגיה מולקולרית ואימונולוגיה באוניברסיטת מיזורי, תחת הנחייתו של ד"ר אלי סו. הודות להתקדמות בריצוף בתפוקה גבוהה ובניתוח יעיל של מערכי מיקרו-מערכים (microarray), ביטוי גנים גלובלי וניתוחו הפכו לצורה קלה וזמינה של איסוף נתונים במודלים רבים של מחקר ומחלות.עם זאת, רמות mRNA של הגן המטרה במצב יציב אינן תמיד נמצאות במתאם ישיר עם רמות החלבון במצב יציב. בקרה גנטית פוסט-טרנסקריפציונלית היא הסבר סביר להבדל בין השניים, המונעת על ידי אינטראקציות של חלבונים קושרי RNA.בקרת פוסט-טרנסקריפציה משפיעה על מיקום, יציבות ותרגום של mRNA על ידי יצירת קומפלקס ריבנוקלאופרוטאין עם mRNA מטרת. זיהוי מטרות mRNA חדשות (Denovo) שאינן ידועות מתוך תמציות תאיים בקומפלקס זה הוא מרכזי להבנת המכניזמים והתפקודים של חלבון קושר RNA והשפעתם הנובעת על תפוקת החלבון. פרוטוקול זה מפרט שיטה המכונה שיקוע חיסוני של ריבופרוטאין, או RIP, המאפשרת זיהוי של mRNA ספציפי המשויך לקומפלקס הריבנוקלאופרוטאין.לפני תחילת הניסוי, קריטי להכין את כל הריאגנטים, המכלים והכלי המעבדתיים. יש לטפל בכלי זכוכית עם מעכב RNase כדי להבטיח שהם נקיים מ-RNA, כגון RNA ZAP מבית Ambion, ולאחר מכן לשטוף אותם במים שעובדו עם DEPC, ולוודא שכל הריאגנטים מאושרים כנקיים מ-RNA. השלב הראשון של הפרוטוקול הוא בידוד קומפלקס הריבונוקלאופרוטאין מהליזאט התאי; יש לאסוף תאי רקמה הגדלים באופן אקספוננציאלי כדי להפיק בין 2 mg ל-5 mg של חלבון כולל עבור כל דגימה בשימוש, כאשר בדרך כלל שתי צלחות תרבית מסוג P150 מספיקות.כאן אנו קוצרים את שורות התאים של סרטן השד האנושי MB 2 31 ו-MC seven וחוקרים את האינטראקציות הריבנוקלאואיות של חלבון קושר RNA. חשוב לציין עבור כל חלבון קושר RNA הנחקר, כי יש לבצע אופטימיזציה של מספר התאים הכולל וכמויות החלבון כדי למקסם את האינטראקציות המתאימות בין ה-mRNA המטרה לבין החלבון הקושר RNA. השקיעו את התאים באמצעות סרכוז במהירות של 1000 RPM למשך כ-8 עד 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים עם PBS קר מאוד. לאחר השטיפה האחרונה, נקשו בעדינות על תחתית המבחנה והשעיו מחדש את משקע התאים בנפחים שווים של באפר ליזיס פוליסומלי מוכן עם מעכבי RNase ופרוטאז.מומלץ למדוד את הנפח המדויק של משקוף התאים, לערבב בעדינות באמצעות פיפט כדי לפרק גושים של תאים, ולהדגיר את הליזאט על קרח למשך חמש דקות. סבבו בצנטריפוגה ב-13,000 G למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי לנקות את הליזאט משאריות; העבירו מיד את העלייה המנוקה למבחנות מיקרו-צנטריפוגה RNase-free שקוללו מראש, שמרו על קרח ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.ניתן לאחסן ליזט זה למשך עד שישה חודשים בטמפרטורה של 80°C- . יש להימנע ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים, שכן אלו עלולים להוביל לדגרדציה של חלבונים ו/או של mRNA. מומלץ לבצע את ה-IP באופן מיידי.בצעו כימות מהיר של ריכוז החלבון בליזאט באמצעות בדיקת חלבון בשיטת Bradford סטנדרטית. לאחר מכן, נצטרך להכין את החומרים לבידוד החלבון הספציפי המבוקש. ראשית, בצעו הנפחה מוקדמת של החלבון.השרו חרוזי Sphero למשך לילה בבופר NT two מועשר ב-5% BSA, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C. השתמשו בבופר NT two ביחס של 4:1 עם חרוזי PAS. ניתן לאחסן את החרוזים לטווח ארוך למשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4°C.כאשר מוסיפים 0.1% sodium azi לפני השימוש, יש להסיר עודפי בופר NT two כך שיחס החרוזים לבופר הסופי יהיה אחד ለአחד. באמצעות מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter נקיות מ-RNA, הסר 100 microliters של SRO speed slurry והוסף 30 micrograms של נוגדן עבור כל תגובת IP בודדת. לדוגמה, בניסוי שלנו השתמשנו בנוגדן who are, שהוא נוגדן mouse IgG one.לפיכך, הנוגדן השליטה שלנו הוא גם IgG 1. לאחר מכן, יש להוסיף 100 עד 200 µL של NT buffer 2 לתערובת הנוגדנים והחרו지를. בנוסף, יש להשתמש במקביל בנוגדן בעל איזוטיפ תואם או בסרום נורמלי שלם מאותו מין כבקרת נוגדנים נגד RNA רקע.הוסיפו את הנוגדן המתאים לתערובת החרוצים והדגירו למשך לילה בתנאי גלגול (tumbling) בטמפרטורה של 4 °C. הכינו את החרוצים המצופים בנוגדן מיד לפני השימוש על ידי שטיפה עם 1 mL של בופר NT 2 קר מאוד (בטמפרטורת קרח) חמש פעמים; שטפו את החרוצים באמצעות סנטריפוגציה ב-13,000 G למשך דקה עד שתיים ב-4 °C. הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות פפיטר ידני או שואב (aspirator).שטיפה זו מסייעת בהסרת נוגדנים שאינם קשורים, כמו גם זיהומי RNAs מתערובת הנוגדנים. לאחר השלמת השטיפה האחרונה, השביה מחדש את החרוצים ב-700 microliters של תמיסת T two קרה מאוד, ולאחר מכן טפל במעכבי RNAs שונים כדי להגן על ה-mRNAs המטרה, כולל 10 microliters של RNAs, out 10 microliters של 100 millimolar DTT ו-15 microliters של EDTA. השלם את הנפח ל-900 microliters באמצעות תמיסת NT two.בשלב הבא, נבצע שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של הקומפלקס המטרה. אנו ממליצים מאוד להשתמש בשלב של ניקוי מקדמי (pre-clear) כדי להפחית את רעש הרקע בניתוח ה-RNA לאחר הליך ה-RIP; בצעו ניקוי מקדמי עם 15 micrograms של בקרת isotype למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הוסיפו 50 microliters של חרוזי PAS שנפחו מראש שאינם מצופים בנוגדן.דגרו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C תוך סיבוב, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-10,000 G בטמפרטורה של 4°C. רססו למשקע. שמרו את הנוזל העליון (supernatant) עבור ה-ip.בשלב הבא, הוסף 100 µL של ליזט מנוקה ומבודל המכיל כ-2 עד 5 mg חלבון לתערובת הנוגדנים שהוכנה. דילול הליזט יסייע בהפחתת הרקע; עטוף את המבחנה ב-Parafilm כדי להבטיח איטום הדוק, ודגירה בטמפרטורה של 4 °C למשך ארבע שעות תוך כדי גלגול. לאחר מכן, שקיע את החרו지를 ב-5,000 ×g למשך חמש דקות ב-4 °C, ושמור את הסופרנאט לניתוח פוטנציאלי על ידי אחסון ב-80 °C-, כפי שתואר בעבר. שטוף את החרוזים חמש פעמים עם 1 mL של בופר TNT2 קר מאוד וביצוע סנטריפוגציה.לאחר מכן, הסר את הנוזל העליון באמצעות פיפטה ידנית או שואב. ניתן להשתמש בשיטות מחמירות יותר כדי להפחית את הרעש ברקע על ידי תוספת של sodium deoxy coate, urea או SDS לבאפר NT two. שמור את הדגימות על קרח ככל הניתן ועבוד במהירות כדי למזער את הפירוק של ה-mRNA המטרה.לבסוף, נשתמש בטיפולים ב-DNase וב-proteinase K, ולאחריהם שיקוע RNA, כדי לבודד את ה-RNAs של הריבונוקלאו-פרוטאין. לאחר השטיפה, השהו את החרוצים מחדש ב-100 µL של N NT two buffer בתוספת של 5 µL של RNAs free DNAs one. השאירו את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך 5 עד 10 דקות. הוסיפו 1 mL של N NT two buffer וסובבו ב-5,000 ×g למשך חמש דקות.השליכו את ה-SUPERNAT. סובבו את תרחיף החלבון כדי להוביל להיווצרות משקע SROs, והוסיפו 100 µL של תמיסת NT two buffer עם 5 µL של proteinase K בריכוז 10 mg/mL ו-1 µL של 10% SDS. דגרו את תערובת החרו지를 שהושחתה למשך 30 דקות במקלח מים בטמפרטורה של 55 °C, תוך נקישה עדינה מדי 10 דקות. Proteinase K יסייע בשחרור רכיבי הריבנוקלאופרוטאין. צנטריפוגו להשקת החרוזים.צנטריפוגה במהירות 5,000 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואסוף את הנוזל העליון (supernatant), שנפחו אמור להיות כ-100 µl. לאחר מכן, הוסף לטיפות 200 µl של באפר NT 2 וצנטריפוגה ב-5,000 G למשך שתי דקות. אסוף כ-200 µl מהנוזל העליון והשלך את הטיפות.שלבו את הנוזל העליון (supernatant) והוסיפו 300 microliters של חומצה פנולית לשכבה התחתונה, ערבבו ב-vortex. המתינו דקה אחת בטמפרטורת החדר וסובבו בצנטריפוגה במהירות מקסימלית בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. אספו 250 microliters מהשכבה העליונה.יש להיזהר מאוד לא להפריע לממשק כדי למנוע זיהום. לדגימת ה-RNA, הוסף 25 µL של sodium acetate ב-pH של 5.2, כ-625 µL של 100% ethanol מקורר ו-5 µL של glyco blue mix. ערבב היטב ואחסן למשך לילה בטמפרטורה של 20- °C.בנוסף, על מנת להבטיח השבה תקינה של ה-RNA, הוספת GlycoBlue תגביר את הנראות של משקע ה-RNA על ידי תפקוד כמולקולת נשא. למחרת, ערבבו את המבחנות על ידי הפיכה של שלוש עד חמש פעמים, ולאחר מכן סובבו בנצורה ב-12,000 G בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות והסילו את הנוזל העליון (supernatant). הוסיפו 1 mL של אתנול 70% מקורר למשקע הכחול וערבבו על ידי הפיכה או וורטקס, ולאחר מכן סובבו בנצורה.סבב את הדגימה ב-12,000 G בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. השלף את הסופרנטנט וסבב שנית ב-12,000 G למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסר שאריות של 70% ethanol באמצעות פיפט וייבש את המשקע באוויר.השאירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. המיסו מחדש ב-20 עד 40 µL של מים נקיים מ-RNA ו-DNA. הדגימה מוכנה כעת לכימות באמצעות ספקטרומטריית NanoDrop ו ליישומים המשכיים כגון qPCR או אנליזת מיקרו-מערך (microarray). לאחר בידוד ה-RNA, בוצעו אנליזת מיקרו-מערך ו-qPCR כדי לחשוף את מטרות ה-mRNA של החלבון הקושר RNA, וכן את ההעשרה שהתקבלה מה-immunoprecipitation.אישור באמצעות western blot חושף בידוד נקי של חלבוני ribonucleoprotein. qPCR כמותי מדגים את פי ההעשרה של mRNA של beta actin בהשוואה לבקרי IgG. בעוד שניתוח microarray חושף פרופילים גנטיים ייחודיים בין תאי MCF-7 לבין תאי MDA-MB-231, שניהם שורות תאים של סרטן השד, immunoprecipitation של ribonucleoprotein הוכח על ידי הקבוצה שלנו, כמו גם על ידי קבוצות מחקר רבות אחרות, ככלי מצוין המשמש לבידוד ובחינת האינטראקציות בין חלבונים נקשרי RNA לבין מטרות ה-mRNA שלהם. למרות הרגישות של הפרוצדורה בטבעה ובביצועה, ביצוע נכון של הליך זה יביא לבידוד של קומפלקסי ribonucleoprotein אלו, אשר עד לא מזמן לא היו נגישים לגילוי ולניתוח.

method-for-isolation-identification-mrnas-micrornas-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

כתב יד זה מתאר גישה לבידוד RNPs קוגנטיים נבחרים הנוצרים בתאים אוקריוטיים באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים ספציפית. אנו מדגימים את הישימות של גישה זו על ידי בידוד RNP מקביל הקשור לאזור הרטרו-ויראלי 5' הלא מתורגם המורכב מ-DHX9/RNA הליקאז A.

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

פרוטוקול מפורט להחלת לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome הלכידה (CARIC) האסטרטגיה כדי לזהות חלבונים איגוד כדי שני קידוד ו noncoding RNAs מוצג.

לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה צעד אחר צעד עבור בידוד RNAs קטנים, העשרת עבור microRNAs, והכנת דגימות עבור רצף תפוקה גבוהה. לאחר מכן נתאר כיצד לעבד רצף וליישר אותם ל-microRNAs, באמצעות כלי קוד פתוח.

צינור מלא לבידוד ולרצף של מיקרו-משתמשים וניתוחם באמצעות כלי קוד פתוח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעשיר את אתרי ה-RNA האנדוגניים או "עקבות" של RNA: מכלולי חלבון (RNP) מתאי יונקים. גישה זו כוללת שני immunoprecipitations של RNP תת יחידות, ולכן המכונה RNA immunoprecipitation בטנדם (RIPiT).

זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq)

כאן, אנו מתארים את immunoprecipitation של ריבוזומים ו-RNA הקשורים מאוכלוסיות לבחור של בוגרים זכר תאים הנבט באמצעות מערכת ריבוtag. הרבייה אסטרטגי ולimmunoprecipitation התוצאה הנקייה, התוצאות להתרבות להודיע על תא הנבט translatome ולספק תובנה לתוך מנגנונים של פנוטיפים מוטנטים.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

למד שיטת RIP לבידוד וזיהוי mRNAs וחלבונים במכלולי ribonucleoprotein מתמציות תאים. הפרוטוקול מאפשר חקר אינטראקציות של חלבוני קישור RNA ורגולציה גנטית בתרביות תאי סרטן שד אנושיים.

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ"א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

גלה סרטונים נוספים