בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע אזורי DNA הקשורים ל-RNA ספציפי שאינו מקודד באמצעות QPCR או ריצוף תפוקה גבוהה. זה מושג על ידי קישור צולב של תאים כדי ללכוד אינטראקציות D-N-A-R-N-A מקוריות in vivo. כשלב שני, תאים עוברים ליזה ונתונים לסוניקציה כדי להמיס את התא, ליזאט וכרומטין שקוף לשברים קטנים.

לאחר מכן, אוליגואים אנטיסנס ביוטיניליים מתווספים לליזאט התא על מנת להעשיר במיוחד עבור קומפלקסים מעניינים של R-N-A-D-N-A מתקבלות תוצאות המבהירות את זהותם של אתרים גנומיים הקשורים ל-RNA שאינם מקודדים על סמך QPCR או ריצוף תפוקה גבוהה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון R-N-A-D-N-A FISH, הוא שהציוץ מאפשר מפות רחבות גנום של אתרי קשירת RNA שאינם מקודדים ברזולוציות קרובות לזוגות בסיסים. שיטה זו יכולה לסייע לנו לענות על שאלות מפתח בתחום הרנ"א הלא מקודד, כגון כיצד הסלעים, הרנ"א והזבובים הזכרים משיגים פיצוי מינון.

ההשלכות של טכניקה זו, היקף הטיפולים במחלות הקשורות ל-NA שאינן מקודדות מכיוון שהיא מאפשרת להבין טוב יותר כיצד RNA לא מקודד מווסת מצבי כרומטין וביטוי גנים. לצורך בידוד כרומטין זה על ידי טיהור RNA או ניסוי ציוץ, 40 מיליון תאים ייקצרו לאחר צנטריפוגה, ישפכו את ה-PBS ויסירו את הנוזל שנותר על ידי שאיבה זהירה בזווית שתעקור את כדור התא על ידי הקשה על תחתית צינור הבז. הוסף 1% גלוטרלדהיד טרי שהוכן טרי, החל מנפח קטן והשהה מחדש את כדור התא עד לנפח המלא ולאחר מכן הפוך לערבב קישור צולב למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר או מסובב מקצה לקצה להרוות את תגובת הקישור הצולב עם נפח עשירי אחד של 1.25 גליצין מולרי ולהשאיר על שייקר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, התאים יהפכו לכתומים בהירים.

לאחר מכן יש לסובב ב-2000 RCF למשך חמש דקות, לשפוך ולשאוף את הסופרנטנט ולשטוף את הכדור עם 20 מיליליטר של PBS צונן שוב, לשאוב את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את החיך המכובס עם PBS צונן. מעבירים כל מיליליטר תאים לצינור איינור ומסתובבים ב-2000 RCF למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, השתמש בקצה פיפטה כדי להסיר בזהירות כמה שיותר PBS.

הבזק, הקפיאו את כל כדורי התא בחנקן נוזלי ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן. כדי להכין ליזאט תאים לציוץ, הפשירו את כדורי התאים הקפואים בטמפרטורת החדר. הקש חזק כדי לעקור ולערבב את כדור התא.

סובב את הכדורים והשתמש בקצה פיפטה חד של 10 מיקרוליטר כדי להסיר את כל ה-PBS שנותר באיזון אלקטרוני מדויק עד מיליגרם אחד. לקרוע את המסה של צינור עינור ריק. שקלו כל כדור ורשמו את משקלו.

הוסף פי 10 נפח של מאגר ליזה בתוספת מעכב פרוטאז טרי PMSF וסופר אס לכל צינור והשהה מחדש את הגלולה. יש לאכול את ליזט התא מיד לאחר הכנתו. העבירו לא יותר מ -1.5 מיליליטר ליזט לכל צינור בז של 15 מיליליטר והכניסו את בדיקות הסוניקציה המבריגות אותם בחוזקה.

לאחר מכן, הנח את הצינורות בקרע ביולוגי, סוניקט בארבע מעלות צלזיוס בהגדרה הגבוהה ביותר עם 30 שניות במרווחי דופק של 45 שניות. בדוק ליזאט כל 30 דקות. המשך סוניקט עד שליזאט התא כבר לא עכור.

זה עשוי להימשך בין 30 דקות לארבע שעות בהתאם למספר הצינורות, נפח הדגימה, טמפרטורת האמבטיה ותקופת זמן הסוניקציה. כאשר הליזאט מתבהר, העבירו חמישה מיקרוליטר לצינור איינור טרי. הוסף DNA פרוטאז K מאגר ופרוטאז K מערבולת כדי לערבב ולהסתובב למטה לזמן קצר לדגור למשך 45 דקות ב-50 מעלות צלזיוס לאחר חילוץ DNA עם ערכת טיהור PCR.

בדוק את גודל ה-DNA על ג'ל 1%aros. עיקר מריחת ה- DNA צריכה להיות 100 עד 500 זוגות בסיסים המעידים על צנטריפוגה סוניקציה מלאה. מיליליטר אחד של דגימות סוניקציה ב-16, 100 RCF למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מעביר את הסופרנטנט לצינורות איינור טריים ומקפיא בזק בחנקן נוזלי כדי להתחיל בהליך להפשרת צינורות ציוץ של כרומטין בטמפרטורת החדר עבור דגימת ציוץ טיפוסית.

בעזרת מיליליטר אחד של ליזאט, הסר 10 מיקרוליטר לכניסת RNA ו-10 מיקרוליטר לכניסת DNA והנח בצינורות einor. המשיכו עם קרח עד להמשך. השתמש בהעברת מיליליטר אחד מכל דגימת כרומטין לשפופרת בז של 15 מיליליטר.

הוסף מאגר הכלאה של שני מיליליטר לכל צינור. לאחר מכן, הפשירו את הבדיקות בטמפרטורת החדר. אוליגוס אריחים ביוטיניליים אלה מסומנים על פי מיקומם לאורך ה-RNA ומופרדים לשתי בריכות.

המאגר הזוגי מכיל את כל הבדיקות עם מספרים זוגיים. והמאגר האי-זוגי מכיל בדיקות עם מספרים אי-זוגיים. כל הניסויים מבוצעים באמצעות שני המאגרים המשמשים כבקרות פנימיות זה לזה.

אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של הפרוטוקול האמיתי הוא שכל שלבי ההכלאה והכביסה צריכים להתבצע ב-37 מעלות. כדי להבטיח טמפרטורת ניסוי עקבית, בצע את כל השלבים בתנור מגורים או בקרבתו, הוסף את נפח הבדיקות המתאים לצינורות ספציפיים. מערבבים היטב בדגירה בחום של 37 מעלות למשך ארבע שעות עם ניעור 20 דקות לפני השלמת ההכלאה.

הכן את החרוזים המגנטיים C one. השתמש ב -100 מיקרוליטר לכל 100 שומה פיקו של בדיקות. שטפו עם מאגר ליזה בתוספת מיליליטר אחד שלוש פעמים באמצעות מגנט שני רצועות של Dyna mag כדי להפריד חרוזים ממאגר.

לאחר הכביסה הסופית, יש להחיות חרוזים מושעים בנפח המקורי של מאגר הליזיס ולהשלים עם סופרין טרי PMSF ומעכב פרוטאז. לאחר השלמת תגובת ההכלאה של ארבע שעות, הוסף 100 מיקרוליטר חרוזים לכל תערובת צינורות. דגירה טובה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם חרוזי כביסה רועדים עם מיליליטר אחד של מאגר כביסה מחמם מראש ל -37 מעלות צלזיוס בכביסה הראשונה.

השתמש בפס מגנטי dyna mag 15 כדי להפריד חרוזים, לשפוך ולתלות מחדש במאגר כביסה של מיליליטר אחד, להעביר לשפופרת EOR של 1.5 מיליליטר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור במשך חמש דקות בשטיפות הבאות, סובב כל צינור בצנטריפוגה מיני והניח דגימה על פס מגנטי של dyna mag two למשך דגימת דקה אחת. נגב את כל הטפטפות עם מגבון קים והשהה מחדש במיליליטר אחד.

יש לשטוף את המאגר, לדגור בחום של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך חמש דקות. חזור על הפעולה בסך הכל חמש כביסות ב-Resus הכביסה האחרונה. השעו היטב את החרוזים, הסירו 100 מיקרוליטר והפרישו לבידוד RNA 900 מיקרוליטר לשבר ה-DNA.

הנח את כל הצינורות על הפס המגנטי של צינור dyna mag והסר את מאגר הכביסה. לאחר סיבוב קצר, הנח את הצינור שוב על רצועת המגנט עם קצה פיפטה חד של 10 מיקרוליטר. הסר את מאגר הכביסה הנותר לחלוטין מכל צינור.

שברי RNA ו-DNA מבודדים לאחר מכן מדגימות הציוץ לצורך כימות וריצוף. איור זה מראה העשרה של טלומראז, RNA או טורק אנושיים מתאי HELOC על פני GA dh. RNA תאי בשפע המשמש כבקרה שלילית.

רוב ה-RNA הטורקי הקיים בתא, כ-88% נמשך כלפי מטה על ידי ביצוע ציוץ, בעוד שרק 0.46% מה-GA DH RNA אוחזר והדגים מקדם העשרה של פי 200 בערך בדיקות לא ספציפיות כגון בדיקות המכוונות ל-LAC ZRNA, שבדרך כלל אינו מתבטא בתאי יונקים, יכולות לשמש כבקרות שליליות נוספות. אזורי DNA צפויים לקשור את המטרה. RNA ארוך שאינו מקודד מועשר בדרך כלל על פני אזורים שליליים כאשר הוא נמדד על ידי QPCR.

איור זה מציג אימות QPCR של ארבעה אתרים הקשורים לאוויר חם בפיברובלסטים ראשוניים של עורלה אנושית שנקבעו על ידי ביצוע ציוץ SSE באותו קו תאים, בעוד שאתרי ה-DNA של Turk ו-GA DH משמשים כאזורי בקרה שליליים. גם ערכות בדיקה זוגיות וגם אי-זוגיות הניבו העשרה דומה של אתרים צפויים הקשורים לאוויר חם על פני אזורים שליליים. סימן היכר של אתרי קשירת RNA ארוכים אמיתיים שאינם מקודדים.

לקבל מפה גלובלית של אתרי קשירת RNA ארוכים שאינם מקודדים על ידי ריצוף תפוקה גבוהה של DNA מועשר בציוץ כפי שמודגם על ידי נתונים אלה מ-RNA ארוך ללא ציפוי סלעי 2, הידוע כמקיים אינטראקציה עם כרומוזום X באופן הנדרש לפיצוי מינון. גם דגימות זוגיות וגם אי-זוגיות רוצפו בנפרד והרעשים הייחודיים שלהן בוטלו כדי לייצר מסלול של אותות חופפים כאשר כל פסגה מצביעה על מראה חזק של סלעים שניים קשורים תוך כדי ניסיון הליך זה. חשוב לתרגל טכניקה נכונה ללא RNA בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כגון חלבון לעשות ספיגת על מנת לענות על שאלות נוספות כגון אילו חלבונים מקיימים אינטראקציה עם ה-DRNA הלא קליני המעניין לאחר פיתוחו. CHI סלל את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הרנ"א למפות את פעולת ה-RN בתאי תרבית וברקמות קבועות.