בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע אזורי DNA הקשורים ל-RNA לא מקודד ספציפי באמצעות QPCR או רצף ברזולוציה גבוהה (high throughput sequencing). מטרה זו מושגת על ידי קישור צולב (cross-linking) של תאים כדי ללכוד אינטראקציות טבעיות של DNA-RNA in vivo. כשלב שני, התאים עוברים ליזיס וסוניקציה כדי להמיס את ליזיס התא ולשבור את הכרומטין למקטעים קטנים.

בשלב הבא, אוליגנוקלאוטידים אנטי-סנס (antisense oligos) ביוטיניליים מתווספים לליזאט התאים על מנת להעשיר באופן ספציפי את קומפלקסי ה-R-N-A-D-N-A הרלוונטיים; התוצאות המתקבלות מבהירות את זהותם של אתרים גנומיים שקושרו ל-RNA לא מקודד על בסיס QPCR או רצף גנטי בתושבה גבוהה (high throughput sequencing). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון R-N-A-D-N-A FISH, הוא ששיטת CHIRP מאפשרת יצירת מפות של אתרי קישור של RNA לא מקודד ברחבי הגנום ברזולוציה קרובה לרמת זוג בסיסים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ה-RNA הלא מקודד, כגון האופן שבו ה-roxRNAs והזבובים הזכרים משיגים פיצוי מינון (dosage compensation).

ההשלכות של טכניקה זו פתוחות לטיפולים במחלות הקשורות ל-NA שאינו מקודד, מכיוון שהיא מאפשרת להבין טוב יותר כיצד RNA שאינו מקודד מווסת מצבי כרומטין וביטוי גנים. לצורך בידוד כרומטין באמצעות טיהור RNA או ניסוי chirp, יקצרו 40 מיליון תאים לאחר צנטריפוגציה; שפכו את ה-PBS והסִירו את הנוזל שנותר על ידי שאיבה זהירה בזווית, ושחררו את משקע התאים על ידי תיפוף בתחתית פלסון התעלה. הוסיפו glutaraldehyde בריכוז 1% שהוכן לאחרונה, החל מנפח קטן, ושספנדו את משקע התאים עד להגעה לנפח המלא, ולאחר מכן הפכו את המבחנה לערבוב. בצעו קישור צולב (cross-link) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מקצה לקצה או רוטטור. עצרו את תגובת הקישור הצולב עם נפח של עשירית מהנפח של glycine בריכוז 1.25 molar והשאירו על שייקר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות; התאים יהפכו לכתום בהיר.

בצע סבב ספינטיישן נוסף ב-2000 RCF למשך חמש דקות, שפוך ושאב את העל-משקע (supernatant) ושטוף את המשקע (pellet) עם 20 מיליליטר של PBS קר; סובב שוב, שאב את העל-משקע ותלה את המשקע הצולב והשטוף ב-PBS קר. העבר כל מיליליטר של תאים לפסולת (eppendorf tube) וסובב ב-2000 RCF למשך שלוש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הספינטיישן, השתמש בקצה של פיפטה כדי להסיר בזהירות כמה שיותר PBS.

בצעו הקפאה מהירה (Flash freeze) של כל משקעי התאים בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לזמן בלתי מוגבל. להכנת ליזט תאים עבור CHIRP, הפשירו את משקעי התאים המוצלבבים והקפואים בטמפרטורת החדר. הקישו בחוזקה כדי לשחרר ולערבב את משקע התאים.

סבבו את המשקעים במערבל צנטריפוגי (Spin down) והשתמשו בקצה פיפטה חד של 10 µL כדי להסיר שאריות של PBS על מאזניים אלקטרוניים בדיוק של 1 mg. מדו את משקלו של נרתיב א-ינור (einor tube) ריק. שקלו כל משקע ורשמו את משקלו.

הוסיפו לכל מבחנה נפח של 10 x מבחנה של בופר ליזיס (lysis buffer), מועשר במעכב הפרוטאזה PMSF טרי וב-super ace, והשעו את המשקע. יש להקפיא את ליזאט התאים מיד לאחר הכנתו. העבירו לא יותר מ-1.5 milliliters של ליזאט לכל מבחנת falcon של 15 milliliters, והחדירו את חלקי הסוניקציה תוך써 הברגה הדוקה שלהם.

לאחר מכן, הניחו את המבחנות במכשיר bio rupture, ובצעו סוניקציה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בהגדרה הגבוהה ביותר, במרווחי פעימות של 30 שניות פעילות ו-45 שניות השהיה. בדקו את הליזאט בכל 30 דקות. המשיכו בסוניקציה עד שהליזאט התאי אינו עכור יותר.

תהליך זה עשוי להימשך בין 30 דקות לארבע שעות, בהתאם למספר המבחנות, לנפח הדגימה, לטמפרטורת האמבט ולמשך זמן הסוניקציה. כאשר התסה (lysate) הופך לשקוף, העבירו 5 µL למבחנה מסוג einor נקייה. הוסיפו DNA protease K buffer ו-protease K, ערבבו באמצעות וורטקס וסובבו קצרות (spin down). דגרו למשך 45 דקות בטמפרטורה של 50 °C, ולאחר מכן בצעו מיצוי DNA באמצעות ערכה לניקוי PCR.

בדוק את גודל ה-DNA על ג'ל agarose בריכוז 1%. עיקר מריחת ה-DNA צריכה להיות בין 100 ל-500 base pairs, דבר המעיד על סוניקציה מלאה. סנטריפוג את מנות של מילוליטר אחד של דגימות שעברו סוניקציה ב-16,100 RCF למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, העבר את העליון למבחנות einor חדשות והקפא במהירות בחנקן נוזלי כדי להתחיל את הליך ה-chirp. הפשר מבחנות של כרומטין בטמפרטורת החדר עבור דגימת chirp טיפוסית.

מתוך מיליליטר אחד של ליזאט, הסירו 10 µL עבור קלט RNA ו-10 µL עבור קלט DNA והעבירו למבחנות Einor. שמרו על קרח עד להמשך הפרוטוקול. העבירו מיליליטר אחד מכל דגימת כרומטין למבחנה מסוג Falcon בנפח 15 מיליליטר.

הוסיפו שני מיליליטרים של תמיסת חיבור (hybridization buffer) לכל מבחנה. לאחר מכן, הפשירות את הגושים (probes) בטמפרטורת החדר. אוליגו-נוקליאוטידים מרוצפים (tiling oligos) ביוטיניליים אלו מסומנים בהתאם למיקומם לאורך ה-RNA ומופרדים לשני מאגרי דגימות (pools).

המאגר הזוגי מכיל את כל הגששים בעלי מספרים זוגיים, והמאגר האי-זוגי מכיל גששים בעלי מספרים אי-זוגיים. כל הניסויים מבוצעים תוך שימוש בשני המאגרים, המשמשים כבקרות פנימיות זה עבור זה.

אחד ההיבטים המאתגרים ביותר בפרוטוקול המקורי הוא שכל שלבי ההיברידיזציה והשטיפה צריכים להתבצע בטמפרטורה של 37 מעלות. כדי להבטיח טמפרטורה ניסיונית עקבית, בצע את כל השלבים בתוך תנור היברידיזציה או בקרבתו. הוסף את הנפח המתאים של הגששים למבחנות ספציפיות. ערבב היטב והדגר בטמפרטורה של 37 מעלות למשך ארבע שעות עם ניעור, 20 דקות לפני השלמת ההיברידיזציה.

הכינו את חרוזי המגנט C one. השתמשו ב-100 µL לכל 100 pmol של probes. שטפו שלוש פעמים עם 1 mL של lysis buffer ללא תוספות, תוך שימוש במגנט Dyna mag two strip כדי להפריד את החרוזים מהבופר.

לאחר השטיפה האחרונה, השביה מחדש את החרוצים בנפח המקורי של חוצץ הליסיס (lysis buffer) והוסף PMSF טרי ומעכב פרוטאוזים. כאשר תגובת ההיברידיזציה של ארבע השעות הסתיימה, הוסף 100 µL של חרוצים לכל מבחנה. דגור ב-37 °C למשך 30 דקות עם ניעור. שטוף את החרוצים ב-1 mL של חוצץ שטיפה שחומם מראש ל-37 °C בשטיפה הראשונה.

השתמשו בסרט מגנטי dyna mag 15 כדי להפריד את החרו지를, שפכו את הנוזל והשעיקו שוב ב-1 mL של תמיסות שטיפה, והעבירו למבחורת EOR בנפח 1.5 mL. דגרו בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור למשך חמש דקות; בשטיפות הבאות, סובבו כל מבחורה בצנטריפוגה מיני והניחו את הדגימה על סרט מגנטי dyna mag 2 למשך דקה אחת, ולאחר מכן שפכו את הדגימה. נגבו נזילות בעזרת נייר Kim wipe והשעיקו שוב ב-1 mL.

בופר שטיפה, דגירה בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור למשך חמש דקות. חזור על הפעולה לסך הכל חמישה שטיפות. בשטיפה האחרונה, השהה את החרוזיקים היטב, הסר 100 µL והפר אותם לצד לצורך בידוד RNA; שמור 900 µL עבור פראקציית ה-DNA.

הניחו את כל המבחנות על פס המגנט של ה-dyna mag tube והסירו את באפר השטיפה. לאחר סבוב קצר (spin), הניחו שוב את המבחנה על פס המגנט ובסייעו בטיפ פיפט מדויק של 10 microliter. הסירו לחלוטין את שארית באפר השטיפה מכל מבחנה.

מקטעי RNA ו-DNA מבודלים לאחר מכן מדגימות ה-chirp לצורך כימות וריצוף. איור זה מראה העשרה של טלומראז אנושי, RNA או Turk מתאי HELOC לעומת GA dh. RNA תאי נפוץ המשמש כביקורת שלילית.

מרבית ה-Turk RNA שנמצא בתא, כ-88%, נמשך על ידי ביצוע chirp, בעוד שרק 0.46% מה-GA DH RNA שוחזרו, מה שמעיד על מקדם העשרה של פי 200 בקירוב. ניתן להשתמש כביקורות שליליות נוספות בחמיאות שאינן ספציפיות, כגון חמיאות המכוונות ל-LAC ZRNA, אשר בדרך כלל אינו מובע בתאי יונקים. אזורי DNA הצפויים להיקשר למטרה. RNA לא מקודד ארוך מועשר בדרך כלל לעומת אזורים שליליים כאשר הוא נמדד באמצעות QPCR.

איור זה מציג תיקוף באמצעות QPCR של ארבעה אתרים קשורי-hot air בפיברובלסטים ראשוניים של עורה של בן אדם, שנקבעו על ידי ביצוע chirp SSE באותו קו תאים, כאשר אתרי DNA של Turk ו-GA DH משמשים כאזורי בקרה שליליים. הן סטים של גששים זוגיים והן סטים של גששים אי-זוגיים הניבו העשרה דומה של אתרים קשורי-hot air צפויים לעומת האזורים השליליים. סימן היכר לאתרים אמיתיים של קישור RNA לא מקודד ארוך.

ניתן להשיג מפה גלובלית של אתרי קישור של RNA לא מקודד ארוך באמצעות ריצוף בעומס גבוה של DNA מועשר ב-chirp, כפי שמוצג בנתונים אלו עבור ה-long non-coding RNA ROCKS2, הידוע כמי שמתקשר עם כרומוזום X באופן הדרוש לפיצוי מינון. דגימות זוגיות ואי-זוגיות רצפו בנפרד, ורעשים ייחודיים הוסרו כדי להפיק עקבה של אותים חופפים שבהם כל שיא מצביע על אתר קישור חזק של ROCKS2. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להקפיד על טכניקה נכונה של RNase-free. לאחר ביצוע הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון Western blotting, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל באילו חלבונים מגיבה ה-DRNA הבלתי-קלינית הרלוונטית לאחר פיתוחה. CHI סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של ה-RNA למפות את ה-RNAact בתרביות תאים וברקמות מקובעות.