Name: בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: למדו את שיטת ChIRP לבידוד כרומטין באמצעות טיהור RNA לזיהוי אתרי קישור של lncRNA בגנום. שיטה זו מספקת מיפוי ברזולוציה גבוהה לחקר אינטראקציות RNA-DNA ורגולציה גנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים ט האנג, MC. צאי, א &#39;מנור, א&#39; סגל, מ &#39;קארודה, ט Swigut, ואני Shestopalov לדיונים. נתמך על ידי הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר של סינגפור (CC), NIH R01-R01 ו-CA118750 HG004361 (HYC), וקליפורניה המכון לרפואה הרגנרציה (HYC). HYC הוא המדען הקריירה המוקדמת של הווארד יוז רפואי במכון.

<ol><li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 142-148 (2010).</li>
<li>Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNAs%3A+insights+into+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNAs: insights into functions.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 155-159 (2009).</li>
<li>Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129, 1311-1323 (2007).</li>
<li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li>
<li>Kelley, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+spreading+of+the+Drosophila+dosage+compensation+complex+from+roX+RNA+genes+into+flanking+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin.</a> Cell. 98, 513-522 (1999).</li>
<li>Pandey, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kcnq1ot1+antisense+noncoding+RNA+mediates+lineage-specific+transcriptional+silencing+through+chromatin-level+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation.</a> Mol. Cell. 32, 232-246 (2008).</li>
<li>Wang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+noncoding+RNA+maintains+active+chromatin+to+coordinate+homeotic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression.</a> Nature. 472, 120-124 (2011).</li>
<li>Khalil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11667-11672 (2009).</li>
<li>Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol. Cell. 40, 939-953 (2010).</li>
<li>Meller, V. H., Wu, K. H., Roman, G., Kuroda, M. I., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((roX1+RNA+paints+the+X+chromosome+of+male+Drosophila+and+is+regulated+by+the+dosage+compensation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">roX1 RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system.</a> Cell. 88, 445-457 (1997).</li>
<li>Franke, A., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rox1+and+rox2+RNAs+are+essential+components+of+the+compensasome%2C+which+mediates+dosage+compensation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The rox1 and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 117-122 (1999).</li>
<li>Gupta, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+HOTAIR+reprograms+chromatin+state+to+promote+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis.</a> Nature. 464, 1071-1076 (2010).</li>
<li>Tsai, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+as+modular+scaffold+of+histone+modification+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.</a> Science. 329, 689-693 (2010).</li>
<li>Zappulla, D. C., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+flexible+scaffold+for+proteins%3A+yeast+telomerase+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol.%22%5BJournal%5D)">RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.. 71, 217-224 (2006).</li>
<li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Air+noncoding+RNA+epigenetically+silences+transcription+by+targeting+G9a+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin.</a> Science. 322, 1717-1720 (2008).</li>
<li>Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+chromatin+regulatory+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-range chromatin regulatory interactions in vivo.</a> Nature. 32, 623-626 (2002).</li>
<li>Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Maps+of+Long+Noncoding+RNA+Occupancy+Reveal+Principles+of+RNA-Chromatin+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions.</a> Mol. Cell. , (2011).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li>
</ol>

ס צ &#39;ו ח.י. צ&#39;אנג נקראים כמו ממציאים על יישום פטנט על שיטה זו.

כאן תיארנו ציוץ-seq, שיטת מיפוי באתרים ב vivo lncRNA מחייב הגנום כולו. הפרמטרים העיקריים להצלחה הם בריכות מפוצלים של ריצוף בדיקות oligonucleotide ו crosslinking glutaraldehyde. העיצוב של זיקה הבדיקות, הוא פשוט נתן את רצף הרנ&quot;א ואינה דורשת ידע מוקדם על מבנה של RNA או תחומים פונקציונליים. ההצלחה שלנו עם roX2, TERC, ו HOTAIR - שלושה RNAs שונות למדי בשני המינים - מצביע על כך ציוץ-seq היא להכליל צפוי lncRNAs רבים. כמו עם כל הניסויים, פקדי טיפול ונכון נדרשים לפרש את התוצאות. LncRNA שונים עשויים לדרוש טיטרציה של התנאים, ושינוי מושכל של תנאים, כגון מבחר של בדיקות קרבה או crosslinkers שונים, עשוי להדגיש היבטים שונים של RNA-הכרומטין אינטראקציות. כמו SEQ-Chip, לא כל האירועים המחייבים הינם פונקציונלי בהכרח, ועל מחקרים נוספים נדרשים כדי לברר את ההשלכות הביולוגיות של RNA Occupancy על הכרומטין. עם זאת, אנו צופים יישומים מעניינים של טכנולוגיה זו עבור חוקרים של הכרומטין הקשורים lncRNAs אחרים, אשר כעת מספר אלפי 8,9. בדיוק כמו שבב ואילך פתחה את הדלת הגנום כולו החקירות של אינטראקציות חלבון דנ&quot;א, ציוץ-seq מחקרים של &quot;RNA interactome&quot; עשוי לחשוף אפיקים חדשים רבים של הביולוגיה.

<table><tbody><tr><td colspan="4">רשימת באפרים:</td></tr><tr><td colspan="4">יש להמיס pellet של מעכב פרוטאזה מלא ב-1 ml מים כמלאי 50x. יש להכין 100 mM PMSF באיסופרופנול (מלאי 100x). Superase-in משמש כמלאי 200x. יש לאחסן את כולם ב- -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">באפר ליזיס (Lysis Buffer):</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM Tris-Cl pH 7.0&lt;br/&gt;10 mM EDTA&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;יש להוסיף תמיד PMSF, P.I. ו-Superase-in טריים לפני השימוש, למעט בעת שטיפת חרוזיים (beads)</td></tr><tr><td colspan="4">באפר Proteinase K (עבור DNA)</td></tr><tr><td colspan="4">100 mM NaCl&lt;br/&gt;10 mM TrisCl pH 8.0 (עבור RNA יש להשתמש ב-pH 7.0)&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;0.5% SDS&lt;br/&gt;יש להוסיף 5% בנפח Proteinase K (Ambion AM2546 20 mg/ml) טרי לפני השימוש</td></tr><tr><td colspan="4">באפר היברידיזציה (Hybridization Buffer)</td></tr><tr><td colspan="4">750 mM NaCl&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;50 mM Tris-Cl pH 7.0&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;15% formamide (יש לאחסן בחושך ב-4 &amp;deg;C)&lt;br/&gt;יש להוסיף תמיד PMSF, P.I. ו-Superase-in טריים לפני השימוש</td></tr><tr><td colspan="4">באפר שטיפה (Wash Buffer)</td></tr><tr><td colspan="4">2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (מהול ממלאי 20x SSC של Invitrogen)&lt;br/&gt;0.5% SDS&lt;br/&gt;יש להוסיף תמיד PMSF טרי לפני השימוש</td></tr><tr><td colspan="4">באפר אלוטיה של DNA (DNA elution Buffer)</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM NaHCO3&lt;br/&gt;1% SDS</td></tr><tr><td colspan="4">טבלת ריאגנטים וציוד ספציפיים:</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (דרגת EM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10x10ml</td><td></td></tr><tr><td>מערבל pellet ממוטור</td><td>VWR international</td><td>V8185-904</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאזה (Protease inhibitor)</td><td>Roche Group</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Superase-in</td><td>Ambion</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696">AM2696&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות Falcon (עבור סוניקציה)</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לניקוי PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי C-1 מגנטיים</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>מגנט DynaMag-15</td><td>Invitrogen</td><td>123-01D</td><td></td></tr><tr><td>מגנט DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>ערכת MIRNeasy mini</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>R0601K</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy</td><td>5 PRIME</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:Isoamyl</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם (Chloroform)</td><td>Ricca</td><td>RSOC0020-1C</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>גליצין (Glycine)</td><td>JT Baker</td><td>4057-06</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>באפר אלוטיה (EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-027</td><td></td></tr><tr><td>DNA-&lt;em&gt;free&lt;/em&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>ערכת באפרים</td><td>Ambion</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד (Formamide)</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד הכרומטין על ידי טיהור rna (ציוץ)

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

RNAs noncoding ארוכים הם וסתים מרכזיים של הכרומטין מדינות תהליכים ביולוגיים חשובים כגון פיצוי המינון, החתמה, ועל ביטוי גנים התפתחותיים 1,2,3,4,5,6,7. התגלית האחרונה של אלפי lncRNAs בשיתוף עם ספציפיים שינוי מתחמי הכרומטין, כגון קומפלקס מדכא Polycomb 2 (PRC2) כי מתווך היסטון H3 ליזין 27 trimethylation (H3K27me3), מציע תפקידים רחבים עבור lncRNAs רבים בניהול מדינות הכרומטין של הגן הספציפי אופנה 8,9. בעוד כמה lncRNAs נחשבים לעבוד בחבר העמים על גנים סמוכים, lncRNAs אחרים לעבוד טרנס להסדיר גנים הממוקמים רחוק. למשל, תסיסנית lncRNAs roX1 ו roX2 לאגד באזורים רבים על כרומוזום X של תאים זכריים, הם קריטיים עבור פיצוי במינון 10,11. עם זאת, המיקומים המדויקים של אתרי הקישור שלהם אינם ידועים ברזולוציה גבוהה. באופן דומה, אדם lncRNA HOTAIR יכול להשפיע PRC2 תפוסה על Hundreds של גנים בגנום כולו 3,12,13, אבל איך הספציפיות מושגת אינו ברור. LncRNAs יכול גם לשמש פיגומים מודולריים לגייס את הרכבה של קומפלקסים חלבונים רבים. קלאסי חוצה משחק RNA הפיגום הוא RNA TERC המשמש תבנית ואת הפיגום על telomerase מורכב 14; HOTAIR יכול גם לשמש פיגום עבור PRC2 ו demethylase H3K4 מורכב 13. מחקרים קודמים מיפוי תפוסה RNA על הכרומטין חשפו תובנות משמעותיות 15,16, אבל רק לוקוס גן יחיד בכל פעם. האתרים התפוסה של רוב lncRNAs אינם ידועים, וכן את התפקידים של lncRNAs בוויסות הכרומטין היה להסיק בעיקר את ההשפעות העקיפות של ההפרעות lncRNA. כשם immunoprecipitation הכרומטין ואחריו microarray או רצף עמוק (שבב שבב או שבב seq, בהתאמה) השתפר מאוד את הבנתנו-DNA חלבון אינטראקציות בקנה מידה גנומי, הנה אנחנו להמחיש recenפורסם tly האסטרטגיה למפות רב תפוסה RNA הגנום כולו ברזולוציה גבוהה 17. , שיטה זו בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ) (איור 1), מבוסס על לכידת הזיקה של יעד lncRNA: מורכב הכרומטין על ידי ריצוף antisense-oligos, אשר לאחר מכן יוצרת מפה של אתרי הקישור הגנומי ברזולוציה של מאות בסיסים שונים עם רגישות גבוה ונמוך רקע. ציוץ הוא ישים lncRNAs רבים בגלל העיצוב של זיקה הבדיקות, הוא פשוט נתן את רצף הרנ&quot;א ואינה דורשת ידע על מבנה של RNA או תחומים פונקציונליים.

ציוץ הוא טכניקה חדשנית ומהירה למפות אתרי הקישור הגנומי של RNAs noncoding ארוכות (lncRNAs). השיטה מנצלת את הייחודיות של תחושת אנטי oligonucleotides ריצוף כדי לאפשר ספירה של lncRNA הנכנס אתרים הגנומי.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

RNA שאינם מקודדים לאורך (Long noncoding RNAs) הם רגולטורים מרכזיים של מצבי כרומטין בתהליכים ביולוגיים חשובים כגון פיצוי מינון, הטבעה והתפתחות...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע אזורי DNA הקשורים ל-RNA לא מקודד ספציפי באמצעות QPCR או רצף ברזולוציה גבוהה (high throughput sequencing). מטרה זו מושגת על ידי קישור צולב (cross-linking) של תאים כדי ללכוד אינטראקציות טבעיות של DNA-RNA in vivo. כשלב שני, התאים עוברים ליזיס וסוניקציה כדי להמיס את ליזיס התא ולשבור את הכרומטין למקטעים קטנים.בשלב הבא, אוליגנוקלאוטידים אנטי-סנס (antisense oligos) ביוטיניליים מתווספים לליזאט התאים על מנת להעשיר באופן ספציפי את קומפלקסי ה-R-N-A-D-N-A הרלוונטיים; התוצאות המתקבלות מבהירות את זהותם של אתרים גנומיים שקושרו ל-RNA לא מקודד על בסיס QPCR או רצף גנטי בתושבה גבוהה (high throughput sequencing). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון R-N-A-D-N-A FISH, הוא ששיטת CHIRP מאפשרת יצירת מפות של אתרי קישור של RNA לא מקודד ברחבי הגנום ברזולוציה קרובה לרמת זוג בסיסים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ה-RNA הלא מקודד, כגון האופן שבו ה-roxRNAs והזבובים הזכרים משיגים פיצוי מינון (dosage compensation).ההשלכות של טכניקה זו פתוחות לטיפולים במחלות הקשורות ל-NA שאינו מקודד, מכיוון שהיא מאפשרת להבין טוב יותר כיצד RNA שאינו מקודד מווסת מצבי כרומטין וביטוי גנים. לצורך בידוד כרומטין באמצעות טיהור RNA או ניסוי chirp, יקצרו 40 מיליון תאים לאחר צנטריפוגציה; שפכו את ה-PBS והסִירו את הנוזל שנותר על ידי שאיבה זהירה בזווית, ושחררו את משקע התאים על ידי תיפוף בתחתית פלסון התעלה. הוסיפו glutaraldehyde בריכוז 1% שהוכן לאחרונה, החל מנפח קטן, ושספנדו את משקע התאים עד להגעה לנפח המלא, ולאחר מכן הפכו את המבחנה לערבוב. בצעו קישור צולב (cross-link) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מקצה לקצה או רוטטור. עצרו את תגובת הקישור הצולב עם נפח של עשירית מהנפח של glycine בריכוז 1.25 molar והשאירו על שייקר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות; התאים יהפכו לכתום בהיר.בצע סבב ספינטיישן נוסף ב-2000 RCF למשך חמש דקות, שפוך ושאב את העל-משקע (supernatant) ושטוף את המשקע (pellet) עם 20 מיליליטר של PBS קר; סובב שוב, שאב את העל-משקע ותלה את המשקע הצולב והשטוף ב-PBS קר. העבר כל מיליליטר של תאים לפסולת (eppendorf tube) וסובב ב-2000 RCF למשך שלוש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הספינטיישן, השתמש בקצה של פיפטה כדי להסיר בזהירות כמה שיותר PBS.בצעו הקפאה מהירה (Flash freeze) של כל משקעי התאים בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לזמן בלתי מוגבל. להכנת ליזט תאים עבור CHIRP, הפשירו את משקעי התאים המוצלבבים והקפואים בטמפרטורת החדר. הקישו בחוזקה כדי לשחרר ולערבב את משקע התאים.סבבו את המשקעים במערבל צנטריפוגי (Spin down) והשתמשו בקצה פיפטה חד של 10 µL כדי להסיר שאריות של PBS על מאזניים אלקטרוניים בדיוק של 1 mg. מדו את משקלו של נרתיב א-ינור (einor tube) ריק. שקלו כל משקע ורשמו את משקלו.הוסיפו לכל מבחנה נפח של 10 x מבחנה של בופר ליזיס (lysis buffer), מועשר במעכב הפרוטאזה PMSF טרי וב-super ace, והשעו את המשקע. יש להקפיא את ליזאט התאים מיד לאחר הכנתו. העבירו לא יותר מ-1.5 milliliters של ליזאט לכל מבחנת falcon של 15 milliliters, והחדירו את חלקי הסוניקציה תוך써 הברגה הדוקה שלהם.לאחר מכן, הניחו את המבחנות במכשיר bio rupture, ובצעו סוניקציה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בהגדרה הגבוהה ביותר, במרווחי פעימות של 30 שניות פעילות ו-45 שניות השהיה. בדקו את הליזאט בכל 30 דקות. המשיכו בסוניקציה עד שהליזאט התאי אינו עכור יותר.תהליך זה עשוי להימשך בין 30 דקות לארבע שעות, בהתאם למספר המבחנות, לנפח הדגימה, לטמפרטורת האמבט ולמשך זמן הסוניקציה. כאשר התסה (lysate) הופך לשקוף, העבירו 5 µL למבחנה מסוג einor נקייה. הוסיפו DNA protease K buffer ו-protease K, ערבבו באמצעות וורטקס וסובבו קצרות (spin down). דגרו למשך 45 דקות בטמפרטורה של 50 °C, ולאחר מכן בצעו מיצוי DNA באמצעות ערכה לניקוי PCR.בדוק את גודל ה-DNA על ג'ל agarose בריכוז 1%. עיקר מריחת ה-DNA צריכה להיות בין 100 ל-500 base pairs, דבר המעיד על סוניקציה מלאה. סנטריפוג את מנות של מילוליטר אחד של דגימות שעברו סוניקציה ב-16,100 RCF למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, העבר את העליון למבחנות einor חדשות והקפא במהירות בחנקן נוזלי כדי להתחיל את הליך ה-chirp. הפשר מבחנות של כרומטין בטמפרטורת החדר עבור דגימת chirp טיפוסית.מתוך מיליליטר אחד של ליזאט, הסירו 10 µL עבור קלט RNA ו-10 µL עבור קלט DNA והעבירו למבחנות Einor. שמרו על קרח עד להמשך הפרוטוקול. העבירו מיליליטר אחד מכל דגימת כרומטין למבחנה מסוג Falcon בנפח 15 מיליליטר.הוסיפו שני מיליליטרים של תמיסת חיבור (hybridization buffer) לכל מבחנה. לאחר מכן, הפשירות את הגושים (probes) בטמפרטורת החדר. אוליגו-נוקליאוטידים מרוצפים (tiling oligos) ביוטיניליים אלו מסומנים בהתאם למיקומם לאורך ה-RNA ומופרדים לשני מאגרי דגימות (pools).המאגר הזוגי מכיל את כל הגששים בעלי מספרים זוגיים, והמאגר האי-זוגי מכיל גששים בעלי מספרים אי-זוגיים. כל הניסויים מבוצעים תוך שימוש בשני המאגרים, המשמשים כבקרות פנימיות זה עבור זה.אחד ההיבטים המאתגרים ביותר בפרוטוקול המקורי הוא שכל שלבי ההיברידיזציה והשטיפה צריכים להתבצע בטמפרטורה של 37 מעלות. כדי להבטיח טמפרטורה ניסיונית עקבית, בצע את כל השלבים בתוך תנור היברידיזציה או בקרבתו. הוסף את הנפח המתאים של הגששים למבחנות ספציפיות. ערבב היטב והדגר בטמפרטורה של 37 מעלות למשך ארבע שעות עם ניעור, 20 דקות לפני השלמת ההיברידיזציה.הכינו את חרוזי המגנט C one. השתמשו ב-100 µL לכל 100 pmol של probes. שטפו שלוש פעמים עם 1 mL של lysis buffer ללא תוספות, תוך שימוש במגנט Dyna mag two strip כדי להפריד את החרוזים מהבופר.לאחר השטיפה האחרונה, השביה מחדש את החרוצים בנפח המקורי של חוצץ הליסיס (lysis buffer) והוסף PMSF טרי ומעכב פרוטאוזים. כאשר תגובת ההיברידיזציה של ארבע השעות הסתיימה, הוסף 100 µL של חרוצים לכל מבחנה. דגור ב-37 °C למשך 30 דקות עם ניעור. שטוף את החרוצים ב-1 mL של חוצץ שטיפה שחומם מראש ל-37 °C בשטיפה הראשונה.השתמשו בסרט מגנטי dyna mag 15 כדי להפריד את החרו지를, שפכו את הנוזל והשעיקו שוב ב-1 mL של תמיסות שטיפה, והעבירו למבחורת EOR בנפח 1.5 mL. דגרו בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור למשך חמש דקות; בשטיפות הבאות, סובבו כל מבחורה בצנטריפוגה מיני והניחו את הדגימה על סרט מגנטי dyna mag 2 למשך דקה אחת, ולאחר מכן שפכו את הדגימה. נגבו נזילות בעזרת נייר Kim wipe והשעיקו שוב ב-1 mL.בופר שטיפה, דגירה בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור למשך חמש דקות. חזור על הפעולה לסך הכל חמישה שטיפות. בשטיפה האחרונה, השהה את החרוזיקים היטב, הסר 100 µL והפר אותם לצד לצורך בידוד RNA; שמור 900 µL עבור פראקציית ה-DNA.הניחו את כל המבחנות על פס המגנט של ה-dyna mag tube והסירו את באפר השטיפה. לאחר סבוב קצר (spin), הניחו שוב את המבחנה על פס המגנט ובסייעו בטיפ פיפט מדויק של 10 microliter. הסירו לחלוטין את שארית באפר השטיפה מכל מבחנה.מקטעי RNA ו-DNA מבודלים לאחר מכן מדגימות ה-chirp לצורך כימות וריצוף. איור זה מראה העשרה של טלומראז אנושי, RNA או Turk מתאי HELOC לעומת GA dh. RNA תאי נפוץ המשמש כביקורת שלילית.מרבית ה-Turk RNA שנמצא בתא, כ-88%, נמשך על ידי ביצוע chirp, בעוד שרק 0.46% מה-GA DH RNA שוחזרו, מה שמעיד על מקדם העשרה של פי 200 בקירוב. ניתן להשתמש כביקורות שליליות נוספות בחמיאות שאינן ספציפיות, כגון חמיאות המכוונות ל-LAC ZRNA, אשר בדרך כלל אינו מובע בתאי יונקים. אזורי DNA הצפויים להיקשר למטרה. RNA לא מקודד ארוך מועשר בדרך כלל לעומת אזורים שליליים כאשר הוא נמדד באמצעות QPCR.איור זה מציג תיקוף באמצעות QPCR של ארבעה אתרים קשורי-hot air בפיברובלסטים ראשוניים של עורה של בן אדם, שנקבעו על ידי ביצוע chirp SSE באותו קו תאים, כאשר אתרי DNA של Turk ו-GA DH משמשים כאזורי בקרה שליליים. הן סטים של גששים זוגיים והן סטים של גששים אי-זוגיים הניבו העשרה דומה של אתרים קשורי-hot air צפויים לעומת האזורים השליליים. סימן היכר לאתרים אמיתיים של קישור RNA לא מקודד ארוך.ניתן להשיג מפה גלובלית של אתרי קישור של RNA לא מקודד ארוך באמצעות ריצוף בעומס גבוה של DNA מועשר ב-chirp, כפי שמוצג בנתונים אלו עבור ה-long non-coding RNA ROCKS2, הידוע כמי שמתקשר עם כרומוזום X באופן הדרוש לפיצוי מינון. דגימות זוגיות ואי-זוגיות רצפו בנפרד, ורעשים ייחודיים הוסרו כדי להפיק עקבה של אותים חופפים שבהם כל שיא מצביע על אתר קישור חזק של ROCKS2. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להקפיד על טכניקה נכונה של RNase-free. לאחר ביצוע הליך זה.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון Western blotting, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל באילו חלבונים מגיבה ה-DRNA הבלתי-קלינית הרלוונטית לאחר פיתוחה. CHI סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של ה-RNA למפות את ה-RNAact בתרביות תאים וברקמות מקובעות.

chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מציגים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) נוהל לניתוח הגנום כולו מיקום isoforms חלבונים שונים בתחום היסטון מחייב. אנו מיישמים אותו לניתוח שבב Seq לזהות מטרות demethylase היסטון KDM5A/JARID1A/RBP2.

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) היא...

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

זיהוי מולקולות הקשורות לאזורי עניין גנומיים ספציפיים נדרש כדי להבין את מנגנוני הבקרה של התפקודים של אזורים אלה. פרוטוקול זה מתאר נהלים לביצוע אימון-אופרפריצציה של כרומטין בתיווך מולקולות קשירת DNA (enChIP) לזיהוי חלבונים ו-RNA הקשורים לאזור גנומי ספציפי.

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור טנדם כרומטין רצף immunoprecipitation (tChIP-Seq) המאפשרת הניתוח של שינוי היסטון הגנום כולו ייחודיים לסוג התא.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללכידת אינטראקציות בין DNA-DNA כרומטין ל-RNA למיפוי ארגון הגנום התלת-ממדי הקשור ל-RNA.

שיטת האינטראקציה של כרומטין DNA-DNA המקושר ל-RNA

למדו את שיטת ChIRP לבידוד כרומטין באמצעות טיהור RNA לזיהוי אתרי קישור של lncRNA בגנום. שיטה זו מספקת מיפוי ברזולוציה גבוהה לחקר אינטראקציות RNA-DNA ורגולציה גנית.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

גלה סרטונים נוספים