דור, טיהור, ואפיון של מיני חלבון DISC1 הסלולריים פולשניים

המטרה הכוללת של ההליכים הבאים היא ליצור דיסק מטוהר. אגרגטים אחד מסוגלים לפלוש לתאים מקבלים. שתי שיטות שונות להשגת מטרה זו יודגמו בשיטה הראשונה.

החלבון הפלואורסצנטי היוצר דיסק אחד של חלבון היתוך מתבטא יתר על המידה בתאי תורם נוירובלסטומה אנושיים NLF. לאחר מכן נשטפים התאים עם PBS שנאסף ומונח ללא שימוש בחומרי ניקוי. ה-DNA מתעכל ואזורי החקלאות מטוהרים באמצעות מערכת שיפוע סוכרוז.

לאגריוס המטוהר בשיטה זו יש יעילות פלישה נמוכה לתאים. הגישה האלטרנטיבית היא ביטוי יתר של חומצות אמינו 5 98 עד 7 85 של הדיסק הרקומביננטי חלבון אחד באי קולי. לאחר מכן, שבר החלבון מסומן ב-DITE 5 94 בדיאליזה ומטוהר באמצעות מטריצת NI NTA המסירה כל דיסק מולטימרי שנותר בצבע לא קשור.

לאחד השברים שנוצרו בשיטה זו יש יעילות פלישה גבוהה לתאים כדי להעריך את פלישת התאים המארחים. או דיסק החלבון הפלואורסצנטי המטוהר, אחד ריזומים או הדיסק הרקומביננטי המסומן. קטע אחד מודגר עם תאי הנמענים המעניינים.

לאחר מכן מוסיפים כחול טריאן כדי להרוות את הקרינה החוץ-תאית והפלישה מדומיינת על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. עד כה, צבירת חלבונים לא הייתה מאפיין מוכר של מחלות נפש כרוניות כמו סכיזופרניה. כאשר ההפרעה בסכיזופרניה חלבון אחד הוא מועמד לפולשניות תאים של אגרגטים חלבונים היא תכונה סימן היכר למחלות אישור חלבון.

כאן אנו מראים בשתי שיטות כי אגרגטים של חלבון דיסק אחד הם פולשניים לתאים ומכאן שהפרעות הקשורות לדיסק אחד או נוירופתיות דיסק אחד הן הפרעות לאישור חלבון. שתי השיטות הן ראשית טיהור דיסק באורך מלא, האחת ASOS מקווי תאים נוירובלסטומה ושנית, ביטוי של דיסק מולטימרי טרמינלי C. שבר אחד באי קולי כמו גם הטיהור והתיוג עם הצבע הפלואורסצנטי.

בעוד שהשיטה הראשונה מובילה רק לפלישת תאים ביעילות נמוכה של 0.3% מהתאים התופסים את המיקרוזומים המטוהרים, מקטע החלבון הרקומביננטי הטהור מדביק עד 20% מהתאים החשופים. השיטות המתוארות כאן צריכות להיות ניתנות להעברה לחלבונים אחרים שבהם היווצרות אקרוזומים או הרכבה מולטימרי הודגמו בצורה משכנעת. בכל אחת מ-10 הכלים של 10 סנטימטרים.

זרע 1.5 כפול 10 לששת תאי נוירובלסטומה ו-LF אנושיים בתוספת RPMI 1640 בינוני וגדל בן לילה. למחרת התאים צריכים להיות 70 עד 80% תווית משולבת חמש מנות לטרנספקציה עם PC DNA 3.1 MRFP ו-EGFP מתויג דיסק אנושי באורך מלא אחד וחמש לטרנספקציה עם פלסמיד EGFP בלבד. עבור כל צלחת של 10 סנטימטרים, שלב 15 מיקרוגרם של DNA פלסמיד 30 מיקרוליטר פגש משפיע ו -750 מיקרוליטר.

אופטי MEM בצינור מיקרו צנטריפוגה ועושה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן, כדי להעביר את התאים, הוסף את תמיסת המגיב לטרנספקציה של DNA, טיפה לתאים לדגור את התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 48 שעות לאחר הטרנספקציה ניטר את הביטוי של MRFP באורך מלא דיסק אחד ואישר את היווצרותם של אזורי אגרו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאים מסוימים מכילים הכללת חלבון פלואורסצנטי מסיבי כפי שמוצג כאן.

פרוטוקול זה משלב שיטה לטיהור גופי לוי מרקמת המוח והפרוטוקול לבידוד אגרגטים גדולים יותר או אזורי אגרו מכיוון שהשיטות הקיימות כבר מבוססות על שימוש בחומרי ניקוי, בידוד חלבון ללא חומרי ניקוי ליישום במבחני פולשניות לתאים הוא קריטי. לאחר מכן, שאפו את הכביסה הבינונית עם PBS והוסיפו 400 מיקרוליטר PBS המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז. לאחר מכן מגרדים את התאים ומוסיפים מיליליטר אחד של תרחיף תאים ו -10 חרוזי קרמיקה לצינור ליזה של שני מיליליטר.

ליז את התאים באמצעות שלושה פולסים 62 על הומוגנייזר קדם-תא ליז 24. הכוח המכני של התהליך עשוי להעלות את הטמפרטורה בתוך הדגימה מעל 37 מעלות צלזיוס. לכן יש להקפיד לצנן את הדגימה על קרח לאחר הליך הליזיס, לאחר קירור התאים על קרח, יש להוסיף 10 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד 40 יחידות למיליליטר DNA ולדגור למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול.

הכן 10 מיליליטר כל אחד של 80%50% ו-20% משקל סוכרוז לנפח ב-PBS. לאחר מכן, בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, הכינו את שיפוע הסוכרוז החל משני מיליליטר של 80% סוכרוז ואחריהם שני מיליליטר של 50% ושני מיליליטר של 20% סוכרוז. יוצקים את השיפוע לאט והיזהרו לא להפריע לשכבות שכבר נשפכו.

לאחר מכן שכבו את הליזאט המעוכל על גבי השיפוע והצנטריפוגה למשך 15 דקות ב 1000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. עם ההפסקה, אספו בזהירות את הממשק בין שכבת הסוכרוז של 50 עד 80% בעזרת פיפטה וערבבו עם חמישה נפחים של צנטריפוגה של צינור חרוטי של 15 מיליליטר למשך 15 דקות ב-1000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את הסופרנטנט ושמור על האזור החקלאי המכיל גלולה.

חזור על הכביסה פעמיים נוספות בממשק זה. אזורי החקלאות הם פלואורסצנטיים וניתן לדמיין אותם במיקרוסקופ תחת אור UV לאחר הכביסה האחרונה, להשליך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את הגלולה ב-250 עד 500 מיקרוליטר של PBS. כדור זה מכיל את אזורי האגרו המטוהרים.

הוסף 10 מיקרוליטר של דיסק MRFP, תרחיף אחד לכל באר של צלחת 24 בארות המכילה תאי נוירובלסטומה אנושיים SHSY חמישה Y. ביטוי קונסטרוקטיבי של דיסק GFP מסיס בקצה C אחד על כיסוי זכוכית סטרילית מחליק ודוגר במשך 48 עד 72 שעות לאחר הדגירה. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS והרוו את הקרינה החוץ-תאית עם 0.04% טריאן כחול למשך חמש דקות.

לאחר מכן שטפו עם PBS כדי להסיר את הכחול הטריאן. לאחר מכן, הניחו את המנה על קרח והוסיפו 4% PFA ו-PBS למשך 10 דקות כדי לתקן את התאים. לאחר מכן שטפו פעם אחת במים סטריליים והרכיבו את החלקות הכיסוי על מגלשות זכוכית עם זהב ממושך עם מדיום הרכבה DPI.

אשר את הקליטה בפלישה של אקסוגני. אזורי אגרו מיושמים על ידי קולוקליזציה עם חלבונים מגויסים המתבטאים על ידי תאי נמען בתמונות זאק. זאק זה מקיף כשישה מיקרומטר בעומק.

24 תמונות שצולמו במרווחים של 200 ננומטר. הקרינה של דיסק MRFP אזור אגרי אחד המוצג באדום מגייסת את הדיסק הטרמינלי הציטוזולי GFPC. קטע אחד המוצג בקולוקליזציה ירוקה מוצג כצהוב ומצביע על כך שאזורי החקלאות נכנסו לציטוזול הנמען וגייסו חלבון דיסק אחד מסיס לשעבר.

בחלק זה של הפרוטוקול דיסק אנושי אחד יסומן ב-DITE 5 94. D זה מאפשר ניטור ישיר של החלבון הרקומביננטי ללא צורך בצביעה חיסונית נוספת. התחל בשחרור חלבון שהוכן כמתואר במסמך הנלווה מקרן מרקפטואתנול על ידי דיאליזה שלו שלוש פעמים בשני ליטר PBS בדילול של אחד עד 2000.

ליד התווית דיסק מיליגרם אחד עם DITE 5 94 IDE ממיסים מיליגרם אחד למיליליטר חלבון ב-PBS ומוסיפים חמישה מילי-מולרי TCEP כדי לשחזר קבוצות TH חופשיות מוסיפים 20 מיקרוליטר של הצבע המומס DMF לתגובה ודוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר באמצעות קלטת דיאליזה SLI עם חיתוך משקל מולקולרי של 10, 000. דלטון מבצע דיאליזה של החלבון שלוש פעמים ב- PBS ביחס של אחד ל -2000 למשך שעתיים בכל פעם. לאחר מכן להגדיל עוד יותר את טוהר החלבון המסומן.

מתבצע טיהור זיקה מבוסס תג שריקה בעמודת NI NTA. שוטפים מטריצת NI NTA אחת של מיליליטר עם 10 מיליליטר. לאחר מכן PBS מורחים את חלבון הדיאליזה המסומן על העמודה ונותנים לו לעבור על העמודה.

לאט לאט התמיסה תאבד חלק מהצבע הכחול שלה עקב קשירת החלבון למטריצת NTA צבע חופשי ללא תווית יישאר בזרימה. לאחר הזנת תמיסת החלבון. העמודה, שטפו את העמוד שלוש פעמים עם 20 מיליליטר PBS כדי להוציא את החלבון להוסיף שני מיליליטר PBS המכילים 500 מילי-מולרי אול לעמודה.

הגדר את השסתום למהירות איטית ולשטוף טיפה תוך ניטור הרצועה הצבעונית בעמודת N NI NTA. יש לרמוז, חלק צבעוני זה של האלואט מכיל חלבון רקומביננטי מסומן המעביר את ה-EIT לקלטת דיאליזה SLI ועושה דיאליזה של ה-EIT שלוש פעמים ל-10 מילי-מולרי NAPI בדילול של 1 עד 2000 למשך שעתיים כל אחד בשני ליטר לאחר דיאליזה. דחף את ה-EIT דרך מסנן מזרק סטרילי של 0.45 מיקרומטר, ולאחר מכן הכניס חמש פעמים 100 מיקרוליטר דגימות והקפיא בחנקן נוזלי.

הכמות הכוללת של חלבון צריכה להיות 0.5 עד 1 מיקרוגרם למיליליטר בכל 100 מיקרוליטר אליקוט. כדי להעריך את הפולשניות של החלבון, הוסף מדיום המכיל 5 עד 10 מיקרוגרם למיליליטר המסומן בדיסק רקומביננטי חלבון אחד לכל באר של צלחת 24 בארות המכילה תאי נוירובלסטומה אנושיים SH SY חמישה Y. מבטא באופן מהותי את דיסק תג ה-GFP המסיס קצה C אחד על החלקות כיסוי זכוכית סטריליות לדגור למשך 48 עד 72 שעות.

להרוות, לתקן ולהרכיב את התאים כפי שנעשה עבור תאים שטופלו באזור החקלאי מאשרים את הפלישה של חלבון רקומביננטי מיושם אקסוגני על ידי Zack Imaging. כאשר החלבון המסומן נקלט, הוא מתגלה בהיקף התאים הנמענים בתמונות שנוצרו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. זאק זה מקיף כחמישה מיקרומטר של עומק ב-24 צעדים של 220 ננומטר.

כאן הדיסק הרקומביננטי קטע אחד 5 98 עד 7 85 המוצג באדום נקלט על ידי תאים נמענים המבטאים את הדיסק המתויג GFP מסוף C המסיס המוצג בירוק כדי לקבוע את הפולשניות של הדיסק. חלבון אחד צובר אזורי אגרו המורכבים מ-MRFP מתויג באורך מלא, דיסק אחד טוהר מתאי NLF והוחלו על תאי SH SY חמישה תאי Y הנמענים כמתואר בתמונה זו כפי שמוצג כאן. דיסק מתויג A-M-R-F-P אקרוזום אחד פלש לנוירובלסטומה אנושית SH SY חמישה תאי Y המבטאים GFP מסיס מתויג C טרמינל דיסק אחד.

יתר על כן, הדיסק המתויג MRFP אחד הצליח לגייס דיסק אחד מתויג GFP מסיס לאגרגטים בלתי מסיסים כדי לקבוע את הפולשניות של דיסק רקומביננטי מתויג אור DIA אחד הוחל על תאי נוירובלסטומה SH SY חמישה Y המבטאים דיסק GFP מסיס אחד כפי שמוצג כאן. דיסק רקומביננטי אחד חלבון מלטר המוצג באדום פלש לתא הנמען נקודות צהובות מצביעות על גיוס של GFP מסיס מתויג C טרמינל דיסק אחד לאגרגטים המסומנים דיסק רקומביננטי אחד מבוטא ומטוהר מאי קולי היה גם תא פולש לנוירונים in vivo כאשר החלבון המולטימרי הוזרק באופן סטריאוטקטי לקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית של חולדה. הדמיית זאק מאשרת את נוכחותו של חלבון דיסק רקומביננטי אחד בנוירון קליפת המוח של חולדה המוכתם בנוגדנים כנגד גרעיני עצב

זה עתה הראינו לכם שתי שיטות ליצירת אגרגטים של דיסק אחד לחקר פלישת תאים. באמצעות כל אחת מהשיטות הללו, אנו יכולים לחקור את ההשפעות התאיות של ספיגת אגרגטים של דיסק 1 ללא המשתנים המבלבלים הפוטנציאליים של ביטוי גנים רקומביננטיים על ידי טרנספקציה של DNA זר. ניתן ליישם טכניקות אלה כדי לחקור את ההשפעות הביולוגיות של פתולוגיה של חלבון דיסק אחד במבחנה בתאים, וב-in vivo על ידי חיסון תוך מוחי או מתן אחר במודלים של בעלי חיים.

אנו בטוחים שטכניקות אלה עשויות להיות מועברות גם לצברי חלבון אחרים בסופו של דבר עם שינויים קלים בפרוטוקול שאומץ לכל חלבון מסוים. בעת ביצוע הליך זה, הקפד להקדיש זמן לניתוח חרוץ של תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית.