Name: הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: למדו שיטת סקרינינג בקצב גבוה לגילוי מולקולות קטנות המשנות פעילות של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה. השיטה משתמשת בדיו פלואורסצנטי לזיהוי תנועת יוני תליום דרך ערוצי Kir בתאי HK293.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות מענקי 1R21NS073097-01 ו1R01DK082884 (JSD) וקרן למכוני המענק PIER11VCTR הלאומי.

<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
<li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213(2007).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

טיפול נתונים: לאחר שהנתונים נאסף, צעד נפוץ בניתוח כרוך בנרמול התגובה של כל גם פלואורסצנטי, F, לשווי הראשוני שלה בתחילת הניסוי, נ 0. זה נפוץ המכונה &quot;יחס סטטי&quot; וסמל &quot;F / F 0&quot;. במקרים בי F 0 נשלטים על ידי צבע חיווי פעולת יחס סטטי משמעותי תתקן לגורמים רבים, כגון disuniformities בתאורה, אוסף אות, ומספר תא. במקרים בם את אות הצבע חלשה או קרינת רקע או השתקפויות במערכת הן גבוהה, יחס סטטי לא יהיה יעיל, אלא אם כ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> וקטור הביטוי טטרציקלין-מושרה </td></tr><tr><td> T-Rex-HEK293 תאים </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> שורת תאים טטרציקלין-מושרה </td></tr><tr><td> Lipofectamine מגיב LTX / פלוס </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> מגיב transfection </td></tr><tr><td> FBS </td><td> אטלנטה ביולוגית </td><td> S11550 </td><td> תקשורת סלולרית התרבות </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> תקשורת סלולרית התרבות </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> תקשורת סלולרית התרבות </td></tr><tr><td> S Blasticidin </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> תקשורת סלולרית התרבות </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> תקשורת סלולרית התרבות </td></tr><tr><td> HBSS-divalent חופשי </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> שטיפת תא </td></tr><tr><td> טריפסין-0.25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> התא דיסוציאציה </td></tr><tr><td> טטרציקלין-HCl </td><td> סיגמא </td><td> T9823 </td><td> מגיב אינדוקציה </td></tr><tr><td> FBS הדיאליזה </td><td> אטלנטה ביולוגית </td><td> S12650 </td><td> תקשורת ציפוי </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> צבע פלואורסצנטי </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> דאה טעינה </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> חיץ assay </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> חיץ assay </td></tr><tr><td> 3 NaHCO </td><td> סיגמא </td><td> S6297 </td><td> Tl + גירוי חיץ </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> סיגמא </td><td> M2643 </td><td> Tl + גירוי חיץ </td></tr><tr><td> קאסו 4 • 2H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> C3771 </td><td> Tl + גירוי חיץ </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G7528 </td><td> Tl + גירוי חיץ </td></tr><tr><td> תליום סולפט </td><td> אולדריץ </td><td> 204625 </td><td> Tl + גירוי חיץ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמא </td><td> H4034 </td><td> Tl + גירוי חיץ </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> סיגמא </td><td> D4540 </td><td> ממס </td></tr><tr><td> שמונה ערוץ האלקטרוני pipettor </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> ציפוי תא ב384 -גם צלחות </td></tr><tr><td> BD PureCoat צלחות אמינות מצופות 384 גם </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> microplates Assay </td></tr><tr><td> אקו כשיר 384 ובכן פוליפרופילן microplate (384PP) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> microplates המקור המתחם </td></tr><tr><td> microplates פוליפרופילן 384 גם </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> מתקן ריאגנט קומבי Multidrop </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 מכונת כביסת microplate </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> שטיפת תא אוטומטית </td></tr><tr><td> הד מטפל נוזלי </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte אקו 550 </td><td></td></tr><tr><td> פלטפורמת טיפול נוזל ראבו האוטומטי </td><td> טכנולוגיות Agilent </td><td> מודל סטנדרטי </td><td></td></tr><tr><td> חמאמה6000 טס FDSS </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> הדמית קינטי צלחת קורא </td></tr></tbody></table> טבלת 1. רשימה של חומרים וחומרים כימיים.

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

חברים מסוימים של המשפחה פנימה מיישר אשלגן (קיר &#39;) הערוץ הם הניחו מטרות תרופה למגוון של הפרעות, כולל יתר לחץ דם, פרפור פרוזדורים, ו1,2 כאב. ברוב המקרים, עם זאת, התקדמות לקראת הבנת הפוטנציאל הטיפולי שלהם או הפונקציות פיסיולוגיות בסיסיות אפילו הואטה על ידי המחסור בכלים פרמקולוגיים טובים. אכן, פרמקולוגיה המולקולרית של משפחת המיישר פנימה כבר פגרה הרחק מאחורי זו של superfamily S4 של אשלגן ערוצי מתח מגודר (KV), שעבורו מספר של זיקת nanomolar ומאפנני הרעלן פפטיד סלקטיבית מאוד התגלו 3. Tertiapin דבורת ארס הרעל ונגזרותיו הם מעכבי עצמה של Kir1.1 וKir3 ערוצים 4.5, אבל הפפטידים של שימוש המוגבל טיפולי, כמו גם בניסוי בשל מאפייני antigenic והזמינות הביולוגיות ירודה, יציבות מטבולית וחדירנות רקמות. הפיתוח של עצמהובדיקות, במולקולה קטנה סלקטיבית עם תכונות פרמקולוגיות משופרות תהיינה מפתח להבנת הפיסיולוגיה והפוטנציאל טיפולי של ערוצי קיר &#39;באופן מלא. מולקולרי ספריות בדיקות הפקת מרכז הרשת (MLPCN) הנתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) קרן משותפת יצרה הזדמנויות למדענים אקדמיים ליזום קמפייני בדיקת גילוי מטרות מולקולריות ולמסלולי איתות בצורך לפרמקולוגיה הטובה יותר 6. MLPCN מספק חוקרי גישה למרכז הקרנת התעשייה בקנה מידה ובכימיה ואינפורמטיקה רפואית תומכות לפתח חלליות מולקולה קטנה שתסברנה את הפונקציה של גנים ורשתות גנים. השלב הקריטי בהשגת הכניסה לMLPCN הוא הפיתוח של היעד או מסלול הספציפי assay החזק שהוא נוח לתפוקה גבוהה הקרנה (HTS). כאן, אנו מתארים כיצד לפתח פלואורסצנטי מבוסס תליום (Tl +) שטף אסאy של פונקצית קיר &#39;ערוץ להקרנת מתחם תפוקה גבוהה 7,8,9,10. assay מתבסס על החדירות של K + ערוץ הנקבובי לK + + Tl משלימתו. זמין מסחרי ניאון Tl + כתב צבע משמש לאיתור שטף הטרנסממברני של Tl + הדרך הנקבובית. ישנן לפחות שלושה צבעים זמינים מסחרי שמתאימים לTl + מבחני שטף: BTC, FluoZin-2, וFluxOR 7,8. פרוטוקול זה מתאר פיתוח assay באמצעות FluoZin-2. למרות שפותח במקור ושווק כמחוון אבץ, FluoZin-2 מוצגי גידול יציב ותלוי במינון בפליטת פלואורסצנטי על Tl + כריכה. התחלנו לעבוד עם FluoZin-2 לפני FluxOR היה זמין 7,8 וממשיך לעשות זאת 9,10. עם זאת, בשלבים בפיתוח assay הם למעשה זהים בכל השלושה הצבעים, והמשתמשים צריכים לקבוע איזה צבע מתאים ביותר עבור n הספציפי שלהםeeds. כמו כן, אנו דנים את מדדי ביצועים של assay שיש להגיע אליה כדי להיחשב לכניסה לMLPCN. מאז Tl + + בקלות מחלחל ערוצים רוב K, assay צריך להיות להתאמה מרבית היעדים + K הערוץ.

השימוש במערכת ביטוי טטרציקלין-מושרה מספק בקרה פנימית נוחה להבחנת Tl + שטף דרך מסלולים אנדוגניים וערוץ הקיר &#39;של עניין. איור 1 מציג מספר דוגמאות של מפות ציפוי סלולרי בשימוש בסוגים שונים של ניסויים. העמדות של בארות המכילות תאי uninduced או טטרציקלין מושרים מסומנות בצבעים שונים. 2A האיור מציג את מפת צלחת המקור משמשת לקביעה האופטימלית Tl + הריכוז לפיתוח assay והקרנת מתחם. שיפוע הצבע מייצג את סדרת הדילול 3-לקפל נעה בין 100% ל -...

שיטות לפיתוח והאימות של assay פלואורסצנטי כמוני למדידת פעילותם של אשלגן rectifier פנימה (קיר &#39;) ערוצים להקרנת מתחם תפוקה גבוהה מוצגות.

חברים ספציפיים במשפחת תעלות האשלגן מסוג מיישר פנימה (Kir) נחשבים למטרות תרופתיות פוטנציאליות למגוון הפרעות, כולל יתר לחץ דם, ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לגלות תרכובות חדשות המודולות את הפעילות של תעלות אשקום מסוג inward rectifier. מטרה זו מושגת תחילה על ידי זריעה של תאי HK 2 9 3, המופעלים על ידי טטרהציקלין ומבטאים תעלת KIR רלוונטית, לתוך פלטת 384 בארות. השלב השני הוא טעינת התאים בצבע รายงาน פלואורסצנטי של תליום הנקרא flu in two.בשלב הבא, שוטפים מהתאים את הצבע שלא נקשר ומחליפים אותו בתמיסת Assay המכילה ביקורת Vehicle או תרכובות לבדיקה. השלב האחרון הוא הוספת תמיסת גירוי (stimulus buffer) לבארים כדי להתניע את זרימת הטאליום. לבסוף, משתמשים בקורא פלטות פלואורסצנציה כדי לזהות את התרכובות המשנות את תנועת יוני הטאליום דרך תעלת ה-KIR.היתרון המרכזי של שיטה זו על פני טכניקות קיימות, כגון אלקטרופיזיולוגיה של patch clamp ידנית, הוא שהיא מאפשרת לחוקר לבצע מאות ניסויים בו-זמנית ואלפי ניסויים מדי יום. שיטה זו מאפשרת לחוקר לסרוק ספריות של אלפי מולקולות קטנות כדי לגלות מודולטורים של תעלות אשומה (potassium channels) בעלות מוליכה פנימה (inward rectifying). יום לפני ניסוי זרימת התליום, יש להפריד את התאים ולכמת את צפיפות תרחיף התאים כפי שמתואר בכתב העת המצורף. לאחר מכן, השתמש במדיום BH המכיל 10% dialyzed FBS כדי להוסיף 20,000 תאים מונוקלונליים שעברו טרנספקציה יציבה של גן תעלת KIR רלוונטי לכל באר של פלטת BD pure coat Amin בעלת 384 בארות, באמצעות thermo multi drop combi או פיפטה רב-ערוצית. למחרת, יש לבחון את הפלטה תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים הדבקו ומפוזרים באופן אחיד על פני תחתית הבארות.לאחר מכן, השתמש בשוטף מיקרו-פלייטים ELX 4 0 5 כדי להחליף את מצע תרבית התאים בבופר HBSS assay בנפח של 20 microliters לבאר. לאחר מכן, הכן את תמיסת הטעינה flus in 2:00 AM D על ידי צנטריפוגה קצרה של המבחנה להמסה של 50 micrograms של אבקת flus in two ב-100 microliters של DMSO ללא מים.כעת הוסף 50 µL של תמיסת DMSO בריכוז 20% weight per volume onic F1 27 לצבע. ערבב אותם באמצעות פיפוט עדין. לאחר מכן, הוסף 150 µL של flus in 2:00 AM onic F1 27 ל-35 mL של תחליל HBSS assay, buffer וערבב בעדינות.בשלב הבא, הוסיפו 20 µL של תמיסת טעינה עם צבע לכל באער שכבר מכיל 20 µL של HBSS assay.Buffer. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך כשעה, בזמן שהתאים נטענים בצבע. הכינו פלטת גירוי תליום על ידי המסה רגעית של 0.5 g של נתרן ביקרבונט ב-50 mL של תמיסת גירוי תליום 5x.לאחר מכן, יש להוסיף 50 µL מהתמיסה לכל באר של פלטת פוליפרופילן בעלת 384 בארות. לאחר שהתאים נטענו בفلوس (flus) ב-2:00 AM, יש לשטוף את הפלטה באמצעות שוטף מיקרו-פלטות ELX 4 0 5. לאחר מכן, יש להוסיף 20 µL או 40 µL של HBSS assay Buffer חזרה לכל באר, והפלטה מוכנה כעת לניסויים.העמידו את פלטות ה-thallium והתאים במערכת לסריקת תרופות פונקציונלית מסוג Hema Matsu או בקורא פלטות עם דימיג קינטי שווה ערך בעל יכולות חלוקת נוזלים מובנות, והשתמשו במסננים מתאימים לצבעים מבוססי פלואורסצאין כגון flu oh four. לאחר מכן, הגדירו פרוטוקול הוספה בודדת (single add) להוספת 10 µL של סדרת Thallium בריכוז five X לבארות המתאימות בפלטת התאים המכילה 40 µL של בופר HBSS assay. לאחר מכן, רשמו את פלואורסצנציית הבסיס בתדירות דגימה של 1 Hz למשך 10 seconds לפחות.הפלואורסצנציה בין הבארות צריכה להיות אחידה ויציבה לכל אורך הפלטה לאחר קביעת תנאי זריעת התאים, השטיפה והטעינה האופטימליים. בינתיים, השתמשו בפיפט 384 הערוצים המובנה כדי להוסיף את באפר גירוי ה-thallium לכל בארה בו-זמנית, והמשיכו בהקלטה למשך שתי דקות לפחות, כך שקצב ושיא העלייה בפלואורסצנציה המושרית על ידי thallium ייתפסו לצורך ניתוח לא מקוון (offline).השתמשו בפיפט רב-ערוצי. הכינו פלטת תרכובות DMSO על ידי פיפטור של מעכב לערוץ ה-KIR המטרה בריכוז שנקבע בעבר, בנפח של 80 microliters לבאר, ושל 0.1%DMSO vehicle אל תוך פלטת פוליפרופילן בעלת 384 בארות. פעולה זו מבוצעת על ידי הוספת מעכב ידוע החל מבאר A1, ובחלוקה לסירוגין לבאר B2, וכן הלאה עד לבאר B 24.חזור על הליך זה עם DMSO, החל מבאר B1 וכן הלאה עד לבאר A24. כעת, העמס את לוחיות התאים, התרכובות והגירוי בתליום אל קורא הלוחיות. לאחר מכן, הגדר פרוטוקול הוספה כפול (two add) להוספת 20 µL של סדרת התרכובות בריכוז 2X לבארי התאים המתאימים, המכילים 20 µL של תמיסת HBSS assay buffer.הוסיפו את התרכובות לפלטת התאים והדגירו אותן למשך עד 20 דקות בטמפרטורת החדר. רשמו את רמות הפלואורסצנציה הבסיסיות בשני ערוצי פלואורסצנציה למשך 10 שניות לפחות. לאחר מכן, הוסיפו 10 µL של תמיסת באפר תליום ריכוז 5x לכל באר בפלטת התאים.חזור על הניסוי שלושה ימים רצופים כדי לבסס את השחזוריות של התוצאות. השתמש בזרימת תליום ב-DMSO ובתאים שטופלו בתרופה כדי לחשב ערך עבור Z prime. מדד סטטיסטי של השונות בין באריות בקרב שתי אוכלוסיות הבאריות; חשב את Z prime באמצעות נוסחה זו המבוססת על הממוצעים וסטיות התקן של P ו-N, כאשר P הוא ערך הזרימה ללא עיכוב ו-N הוא ערך הזרימה עם עיכוב מלא.בדיקה עם ערכי ZPrime הגדולים או השווים ל-0.5 בשלושה ימים נפרדים נחשבת כמתאימה לסריקה בשריח גבוה (high throughput screening). איורים אלו הם דוגמאות למפות פריסת תאים שנעשה בהן שימוש בסוגים שונים של ניסויים. מיקומי הבארים המכילות תאים ללא השראה או תאים שהושרו באמצעות טטרציקלין מסומנים בצבעים שונים.איור זה מציג את מפת פלטת המקור ששימשה לקביעת ריכוז התליום האופטימלי לפיתוח הבדיקה ולסריקת תרכובות. מדרג הצבעים מייצג סדרת דילול פי שלושה הנעה בין 100% ל-0.002% תליום, וכאן מוצגת מפת עוצמת פלואורסצנציה מייצגת עם צבעים קרים עד חמים, המצביעים על ערכי שטף תליום נמוכים עד גבוהים. מפת פריסת התאים המוצגת כאן, עם התאמה של פונקציה לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים לעקומת כיול הריספונס (CRC) של התליום, משמשת לקביעת ערך EEC 80 של 15% תליום.איור זה מציג את מפת פלטת המקור ששימשה לקביעת הסבילות ל-DMSO של הבדיקה. עמודות 1 ו-24 מכילות תמיסת בפר בלבד, בעוד שמסגרת הצבעים מצביעה על סדרת דילול דו-מכפלית הנעה בין 10% ל-0.01% DMSO; כאן מוצגת מפת עצימות פלואורסצנציה מייצגת, שבה ערכי שטף thallium נמוכים מסומנים בכחול כהה יותר. ערכי שטף thallium הממוצעים שנמדדו מהבארים המכילות את ריכוזי ה-DMSO המצוינים מסוכמים כאן.כעת דמות זו מציגה את מפת לוחית המקור ששימשה להקמת עקומות תגובה לריכוז עבור מעכבים ידועים של תעלת KIR. כל תרכובת מסומנת בצבע שונה ובדרך כלל מועברת ללוחית כסדרה של דילול פי שלושה. מפה מייצגת של עוצמת פלואורסצנציה מוצגת כאן, ודמות זו מראה את העיכוב התלוי במינון של זרימת תליום על ידי המעכב לאחר פיתוחו ואופטימיזציה שלו.ניתן להשתמש בבדיקת שטף התליום גם לביצוע מגוון בדיקות פרמקולוגיות שגרתיות. בדיקת שטף התליום הותאמה בעבר לשימוש עם תעלות אשלגן תלויות-מתח ותעלות אשלגן מקושרות, תעלות קטיונים לא סלקטיביות, ואפילו נשאי אשלגן. אין לשכוח שעבודה עם תליום עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש בכפפות וסלקה נאותה של הפסולת, בעת ביצוע הליך זה.

high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בזמן אמת ההקרנה הליך לזיהוי סמים כי אינטראקציה עם חלבון G-מגודרת פנימה מיישר...

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

טכניקות biosensor אופטיות יכולות לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה בתאים חיים ומאפשרות אחד כדי לעקוב אחר תגובות תאיות בתאים ובאוכלוסיות של תאים בודדים. פרוטוקול זה יתאר גילוי האפנון של תעלות אשלגן על ידי קולטנים בשילוב ה-G-חלבון בתאים שלמים באמצעות גישה זו.

שימוש בBiosensors האופטי ללא תווית לזיהוי מודולציה של תעלות אשלגן על ידי קולטנים מצמידים G-חלבון

כאן אנו מתארים בדיקת גן מדווח מבוססת תאים ככלי רב ערך לסינון ספריות כימיות עבור תרכובות המווסתות מנגנוני בקרה פוסט-שעתוק המופעלים באמצעות 3' UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

האינטראקציה בין ערוצי HCN ו למקטע העזר שלהם זוהה כיעד טיפולי הפרעת דיכאון מג'ורית. כאן, שיטת קרינה מבוססת קיטוב לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של אינטראקציה בין חלבונים זה, מוצגת.

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כמותי וניתן להרחבה לבצע מסכי מולקולה קטנים ממוקד עבור הרגולטורים קינאז של המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם.

שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

באמצעות שיטת הסריקה (NADH)-ביחד התאמה ATPase הותאמה הקרנה חצי תפוקה גבוהה של מולקולה קטנה רירן מעכבי. זה שיטת הקינטי מופעל בפורמט 384-היטב אימונולוגיה עם כמויות התגובה הכולל של רק 20 μl לכל טוב. הפלטפורמה צריכה להיות ישימה כמעט כל הפקת האנזים.

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקר חלבוני ממברנה אלקטרוגניים על ידי מדידת שינויים בפוטנציאל הממברנה. בדיקה זו מספקת פלטפורמה לקריאה פונקציונלית של תעלות יונים מרובות המבוטאות אנדוגנית בשורות תאי אפיתל.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות של פוטנציאל ממברנה למחקר פונקציונלי בתפוקה גבוהה של שתי תעלות יונים אנדוגניות בשני קווי תאי אפיתל

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש את היישום של טכניקת כתם מערבית כדי לחקור את הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2. הפרוטוקול מתאר את חקירת הזרחון KCC2 באתרים רגולטוריים של קינאז Thr906/1007 באמצעות כתם מערבי. כמו כן, שיטות נוספות לאישור פעילות KCC2 מודגשות בקצרה בטקסט זה.

חקר הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2 באמצעות כתם מערבי

פרוטוקול זה מתאר שיטת סינון מבוססת ציטומטריה של זרימה בתפוקה גבוהה לזיהוי תרופות במולקולות קטנות המעכבות הפעלת אינטגרין β2 על נויטרופילים אנושיים.

טכניקת תפוקה גבוהה מבוססת ציטומטריה של זרימה לבדיקת תרופות מעכבות אינטגרין

המיקוד הפרמקולוגי של תעלות יונים הוא גישה מבטיחה לטיפול בגידולים מוצקים. פרוטוקולים מפורטים ניתנים לאפיון תפקוד תעלות היונים בתאים סרטניים ולהערכת ההשפעות של אפנון תעלות יונים על כדאיות הסרטן.

בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים

למדו שיטת סקרינינג בקצב גבוה לגילוי מולקולות קטנות המשנות פעילות של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה. השיטה משתמשת בדיו פלואורסצנטי לזיהוי תנועת יוני תליום דרך ערוצי Kir בתאי HK293.

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

גלה סרטונים נוספים