הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגלות תרכובות חדשות המווסתות את פעילותן של תעלות אשלגן מיישר פנימה. זה מושג על ידי ציפוי ראשון של תאי HK 2 9 3, המבטאים ערוץ KIR מעניין לתוך צלחת באר 384. השלב השני הוא להעמיס את התאים בצבע מדווח תליום פלואורסצנטי בשם שפעת לשניים.

לאחר מכן, הצבע הלא משולב נשטף מהתאים ומוחלף במאגר בדיקה המכיל בקרת רכב או תרכובות בדיקה. השלב האחרון הוא הוספת מאגר גירוי לבארות כדי ליזום שטף תליום. בסופו של דבר, קורא לוחות פלואורסצנטי משמש לזיהוי התרכובות המשנות את תנועת יוני התליום דרך תעלת KIR. עני.

היתרון העיקרי של שיטה זו על פני טכניקות קיימות כגון אלקטרופיזיולוגיה ידנית של מהדק תיקון הוא בכך שהיא מאפשרת לחוקר לבצע מאות ניסויים בו זמנית ואלפי ניסויים מדי יום. שיטה זו מאפשרת לחוקר לסנן ספריות של אלפי מולקולות קטנות כדי לגלות מודולטורים של תעלות אשלגן מיישרות פנימה יום לפני ניסוי שטף התליום לנתק את התאים ולכמת את צפיפות תרחיף התאים כמתואר בכתב היד המצורף. לאחר מכן, השתמש במדיום BH המכיל 10% צלחת FBS בדיאליזה 20,000 תאים חד שבטיים שהועברו ביציבות עם גן ערוץ KIR מעניין בכל באר של מעיל טהור BD מצופה אמין 384 צלחת באר באמצעות קומבי תרמו רב טיפות או פיפטר רב ערוצי למחרת, בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נדבקים ומפוזרים באופן שווה על פני קרקעית הבארות.

לאחר מכן השתמש במכונת כביסה ELX 4 0 5 microplate כדי להחליף את מדיום תרבית התאים בבדיקת HBSS. חוצץ ב -20 מיקרוליטר לבאר. לאחר מכן, הכינו את השפעת בתמיסת טעינה של 2:00 AM D על ידי צנטריפוגה קצרה של הצינור כדי להמיס 50 מיקרוגרם של שפעת בשתי אבקות ב-100 מיקרוליטר של DMSO נטול מים.

כעת הוסף לצבע 50 מיקרוליטר של 20% משקל לנפח תמיסת onic F1 27 DMSO. מערבבים אותם על ידי פיפטינג בעדינות. לאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר שפעת ב-2:00 לפנות בוקר onic F1 27 עד 35 מיליליטר של בדיקת HBSS, חוצץ ומערבב בעדינות.

לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר טעינת צבע לכל באר שכבר מכילה 20 מיקרוליטר של בדיקת HBSS. מאגר. דגרו על התאים בטמפרטורת החדר למשך כשעה בזמן שהתאים נטענים בצבע. הכן צלחת גירוי תליום על ידי המסה טרייה של 0.5 גרם נתרן ביקרבונט ב-50 מיליליטר של מאגר גירוי תליום חמישה x תליום.

לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר מהתמיסה לכל באר של צלחת באר פוליפרופילן 384 לאחר שהתאים הועמסו בשפעת בשעה 2:00 לפנות בוקר. שטפו את הצלחת עם מכונת כביסה ELX 4 0 5 מיקרופלייט. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר או 40 מיקרוליטר של בדיקת HBSS. חוצץ בחזרה לכל באר והצלחת מוכנה כעת לניסויים.

טען את התליום וצלחות התאים למערכת סינון תרופות פונקציונלית של Hema Matsu או קורא לוחות הדמיה קינטית שווה ערך עם יכולות חלוקת נוזלים משולבות והשתמש במסננים מתאימים לצבעים מבוססי פלואורסצאין כגון שפעת או ארבע. לאחר מכן, הגדר פרוטוקול הוספה יחיד להוספת 10 מיקרוליטר מחמש סדרות X Thallium לבארות המתאימות של לוחית התא המכילה 40 מיקרוליטר של מאגר בדיקת HBSS. לאחר מכן רשום את הקרינה הבסיסית בתדר דגימה של הרץ אחד למשך 10 שניות לפחות.

הקרינה מבאר לבאר צריכה להיות אחידה ויציבה על פני הצלחת לאחר שנקבעו תנאי ציפוי תאים, כביסה וטעינת תאים אופטימליים. בינתיים, השתמש בצינור המשולב של 384 ערוצים כדי להוסיף את מאגר גירוי התליום לכל באר בו זמנית והמשך את ההקלטה למשך שתי דקות לפחות כך שהקצב והשיא של העלייה הנגרמת על ידי התליום בקרינה יילכדו לניתוח לא מקוון. בסדרת הניסויים הבאה, העריכו את האחידות והשחזור של הבדיקה על ידי ציפוי מעכב בקרה בכל באר אחרת של כל עמודה ושורה של לוחית באר 384 והוסיפו DMSO לבארות האחרות כבקרת רכב.

השתמש בצנרת רב-ערוצית. הכינו צלחת DMSO מורכבת על ידי פיפטינג מעכב של תעלת המטרה KIR בריכוז שנקבע קודם לכן ב-80 מיקרוליטר לבאר ו-0.1% רכב DMSO לתוך צלחת פוליפרופילן של 384 בארות. זה נעשה על ידי הוספת מעכב ידוע המתחיל בבאר A 1 ולסירוגין לבאר B 2 וכן הלאה עד באר B 24.

חזור על הליך זה עם DMSO החל מבאר, B אחד וכן הלאה עד באר A 24. כעת טען את התא, את התרכובת ואת לוחות הגירוי של התליום לתוך קורא הצלחות. לאחר מכן הגדר פרוטוקול הוספה כפולה כדי להוסיף 20 מיקרוליטר משתי סדרות תרכובות ריכוז X לבארות המתאימות של לוחית התא המכילה 20 מיקרוליטר של מאגר בדיקת HBSS.

מוסיפים את התרכובות לצלחת התא ומדגרים אותן עד 20 דקות בטמפרטורת החדר. רשום את שפעת הבסיס בשתי פלואורסצנטיות למשך 10 שניות לפחות. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של חמישה x מאגר תליום לכל באר של לוחית התא.

חזור על הניסוי בשלושה ימים לאחר מכן כדי לקבוע את יכולת השחזור של התוצאות. השתמש בשטף תליום ב-DMSO ובתאים שטופלו בתרופות כדי לחשב ערך עבור Z prime. מדד סטטיסטי של שונות באר לבאר בין שתי אוכלוסיות הבארות מחשב את Z ראשוני באמצעות נוסחה זו המבוססת על הממוצעים וסטיות התקן של P ו-N כאשר P הוא ערך השטף הבלתי מעוכב ו-N הוא ערך השטף המעוכב במלואו.

בדיקה עם ערכי ZPrime גדולים או שווים ל-0.5 בשלושה ימים נפרדים נחשבת מתאימה לבדיקת תפוקה גבוהה. האיורים האלה הם כמה דוגמאות למפות ציפוי התאים המשמשות בסוגים שונים של ניסויים. מיקומי הבארות המכילות תאים לא מושרים או טטרציקלין מסומנים בצבעים שונים.

איור זה מציג את מפת לוחית המקור המשמשת לקביעת ריכוז התליום האופטימלי לפיתוח הבדיקה וסינון התרכובות. שיפוע הצבע מייצג את סדרת הדילול המשולשת הנעה בין 100% ל-0.002% תליום, והנה מפת עוצמת הקרינה המייצגת עם צבעים קרירים עד חמים, המציינת ערכי שטף תליום נמוכים עד גבוהים. מפת ציפוי התאים המוצגת כאן עם התאמה של פונקציה לוגיסטית של ארבעה פרמטרים לתליום CRC משמשת לקביעת ערך EEC 80 של 15% תליום.

איור זה מציג את מפת לוחית המקור המשמשת לקביעת סובלנות ה-DMSO של בדיקה. עמודות 1 ו-24 מכילות מאגר בדיקה בלבד, בעוד ששיפוע הצבע מציין את סדרת הדילול הכפולה הנעה בין 10% ל-0.01% DMSO והנה מפת עוצמת הקרינה מייצגת עם ערכי שטף תליום נמוכים המסומנים בכחול כהה יותר. ערכי שטף התליום הממוצעים שנרשמו מהבארות המכילות את הריכוזים המצוינים של DMSO מסוכמים כאן.

כעת איור זה מציג את מפת לוחית המקור המשמשת לקביעת עקומות תגובת ריכוז עבור המעכבים הידועים של ערוץ KIR. כל תרכובת מסומנת בצבע שונה ומצופה בדרך כלל כסדרת דילול משולשת. מפת עוצמת הקרינה המייצגת מוצגת כאן, ואיור זה מציג את העיכוב התלוי במינון של מעכב שטף תליום לאחר פיתוחו ואופטימיזציה.

ניתן להשתמש בבדיקת שטף התליום גם לביצוע מגוון בדיקות פרמקולוגיה שגרתיות. בדיקת שטף התליום הותאמה בעבר לשימוש עם תעלות מתח ואשלגן קשורות, תעלות קטיון לא סלקטיביות ואפילו מובילי אשלגן. אל תשכח שעבודה עם טליום יכולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון שימוש בכפפות ופינוי פסולת מתאים בעת ביצוע הליך זה.