דור מצע לEndonucleases של מערכות CRISPR / קאש

המטרה הכוללת של הניסויים הבאים היא להפיק מצעי RNA למחקר של Cas Endonuclease, הממלאים תפקידים מכריעים במערכות החיסון crispr Cass הנמצאות בחיידקים וב-ArcHa, על מנת להשיג מצעי RNA עבור Cas Endonuclease. ניתן להשתמש בהגברה באמצעות PCR של אזור CRISPR ספציפי כדי להשיג תבנית DNA ארוכה להפקת RNA in vitro, במידת הצורך.

ניתן להשכיב (anneal) שני אוליגנוקלאוטידים כדי ליצור תבניות קצרות יותר לייצור RNA של סובסטרט. לחלופין, ניתן לבחון רצפי חזרות קצרים שסונתזו בהתאמה אישית במבחני CAS Endonuclease. בסופו של דבר, ניתן להדגים את ייצור תמלילי ה-RNA והשסועה העוקבת על ידי CAS six endonuclease באמצעות רדיוגרפיה עצמית.

המטרה העיקרית של הטכניקות המוצגות היא לאפשר לחוקרים לבחון עיבוד של CRISPR RNA באמצעות סובסטרטים של RNA באורכים משתנים. לפיכך, נעשה שימוש בשיטות שונות ליצירת RNA קצרים, לדוגמה, אלמנטים חוזרים בודדים, או RNA גדולים יותר, כגון טרנסקריפטים של crispr RNA המקיפים מספר ספייסרים (spacers). למרות ששיטות אלו מספקות תובנה ספציפית לגבי הבשלת CRISPR RNA, ניתן לאמץ אסטרטגיות דומות להכנת תבניות עבור מערכות עיבוד RNA אחרות. את הפרוצדורה ידגימו סטודנט לתארים מתקדמים ופוסט-דוקטורנט, שניהם ממעבדה העוסקת במערכות CRISPR החיסוניות בחיידקים ובארכאה.

רצף DNA ויראלי הנקרא proto spacer יכול להושתב בין שני אלמנטים חוזרים בתוך צביר CRISPR גדל בתהליך הנקרא adaptation. לאחר מכן, צביר ה-CRISPR כולו עובר שעתוק ואז מעובד ל-CRISPR RNAs קטנים על ידי Cass Endonuclease, לדוגמה, CAS six. ה-CRISPR RNAs הקטנים משולבים לאחר מכן במתחם חלבוני ה-CAS cascade ומתווכים את הגנת המארח מפני התקפה ויראלית חוזרת, תוך שימוש במשלביות הבסיסים בין ה-CRISPR RNA ל-proto spacer כסימן לפירוק ה-DNA הויראלי כדי ליצור substrates של pre CRISPR RNA ארוכים.

התחילו בעיצוב פריימרים ל-PCR, המכוונים לאזורי הרווח (spacer) של מקבץ CRISPR, על ידי הוספת רצף הפרומוטר של T7 RNA polymerase לפריימר הפרומי (forward). לאחר מכן, הוסיפו אתרי הגבלה לשני הפריימרים לצורך שיבוט של תוצר ה-PCR לתוך וקטור. שימו לב ש-T7 RNA polymerase דורש שארית guanine עבור התחלה תקינה של התעתוק, לאחר הגברת רצף ה-pre-CRISPR RNA הרלוונטי מה-DNA הגנומי באמצעות PCR.

הפרידו את תוצרי ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וביצעו מיצוי ג'ל של הפס הרצוי, ולאחר מכן עיכלו את תוצר ה-PCR באמצעות אנזימי הגבלה ליצירת קצוות דביקים. לאחר מכן, לאחר טיהור תוצר ה-PCR באמצעות ערכה לטיהור PCR כדי להסיר תוצרי לוואי של העיכול, הוסיפו T4 DNA Ligase, בופר T4 DNA Ligase, ויחס מולרי של 3:1 בין תוצר ה-PCR המועכל לבין וקטור pUC4 המתאים בעל הקצוות הדביקים התואמים. כעת דגרו את תגובת הליגציה בטמפרטורה של 16 °C למשך לילה, ולאחר מכן בצעו טרנספורמציה של התערובת לתאי e coli מסוג DH5α קומפטנטים לפי פרוטוקולים סטנדרטיים, תוך שימוש בסינון כחול-לבן (blue-white screening) לזיהוי ליגציות מוצלחות.

לבסוף, בודדו את הפלסמידים מהמושבות הלבנות באמצעות ערכה להכנת פלסמידים, וזהו את השיבטים החיוביים על ידי ריצוף הפלסמידים כדי להפיק סובסטראטים של pre CRISPR RNA בגודל ביניים. התחילו בתכנון אוליגנוקלאוטידים קדמיים (forward) ואחוריים (reverse) עם רצפי מרווחי CRISPR repeat הרצויים, באופן דומה לרצפים המוצגים כאן. שימו לב כי האוליגנוקלאוטידים מכילים את הרצף של פרומוטור T7 RNA polymerase, וכן אתרי הגבלה טרמינליים לאחר סיום האוליגנוקלאוטידים, כדי להבטיח היווצרות של קצוות דביקים.

לאחר מכן, דגרו את הדגימות עם T4 polynucleotide kinase ומסייען (buffer) של T4 polynucleotide kinase למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C, כדי לבצע פוספורילציה בקצה '5 ל-1 nmol מכל אחד מהאוליגנוקלאוטידים. לאחר מכן, דגרו את האוליגנוקלאוטידים הפוספוריליים (קדימה ואחורה) עם T4 DNA ligase buffer למשך חמש דקות ב-95 °C על בלוק חימום. לאחר שהדגימות עברו היברידיזציה, כבו את מקור החום והניחו לתערובת להצטנן במשך כשעתיים עד שלוש שעות, עד להגעה לטמפרטורת החדר.

כעת בצעו ליגציה של האוליגנוקלאוטידים עם וקטור P T4 שועבדה ועברה דה-פוספורילציה, בתוספת תמיסת ליגציה של DNA ו-T4 DNA Ligase בטמפרה של 16 מעלות צלזיוס למשך לילה. לאחר מכן, טרנספורמו את הפלסמידים שעברו ליגציה לתאי E. coli מסוג DH5α קומפטנטים לפי פרוטוקולים סטנדרטיים, תוך שימוש בסינון כחול-לבן (blue-white screening) לזיהוי ליגציות מוצלחות. לבסוף, בודדו את הפלסמידים וזהו את הכלונים החיוביים באמצעות עיכול וריצוף פלסמידי עוקב.

ניתן לעצב רצפי מצע RNA קצרים עם חזרה בודדת של cas באופן דומה לאלו המוצגים כאן. יש לוודא שכלול דאוקסי-ריבונוקלאוטיד. במידה ויש לקבוע את אתר השסוע של ה-RNA, ניתן להשתמש במעבדה לסינתזה בהתאמה אישית כדי לבצע את הייצור של האוליגונוקלאוטיד של ה-RNA.

לאחר בידוד הפלסמידים עם התסבכת המותאמת שנבחרה, השתמשו בערכה לניקוי פלסמידים בשיטת maxi prep כדי להפוך את הפלסמידים לליניאריים באמצעות אנזים הגבלה שחותך במורד למקטעים השבטים. לאחר וידוא כי העיכול הושלם, נקו את הפלסמיד הליניארי באמצעות מיצוי פנול-כלורפורמה והשקעה באתנול. שחזרו את חומצות הגרעין על ידי ריסספנזיה (resus), תוך השעיית המשקע במים סטריליים שעובדו ב-DEPC.

כעת הדגרירו את הפלסמידים המעובדים בתערובת תעתוק runoff טרייה של T7 RNA polymerase in vitro, הכוללת ATP, CTP, GTP ו-UTP, למשך שלוש שעות ב-37 °C. לבסוף, נתחו את תסריטי ה-RNA שהתקבלו על ג'ל פוליאקרילמיד 12% עם 8 M urea דנטורטיבי. ניתן גם לטהר את התסריטים באמצעות כרומטוגרפיית חילוף אניונים Mono Q, ולאחר מכן להחזיר את התסריטים על ידי שקיעה באתנול של פракציות ה-RNA והמסה מחדש של המשקעים במים סטריליים שעובדו ב-DEPC, כדי לנתח את סובסטראטי העיצוב באמצעות בדיקות אנדונוקלאז; התחילו בויזואליזציה של פסי הסובסטראט באמצעות אוטורדיוגרפיה וטהרו את תוצרי התגובה על ידי מיצוי מג'ל דנטורטיבי של 8 M urea.

ג'ל פוליאקרילאמיד בריכוז 12%, ולאחר מכן ייצור וניקוי של חלבוני ה-cas הרקומיננטיים הרצויים באמצעות שיקוע בחום וכרומטוגרפיית nickel NTA, כפי שמוצג עבור חלבון CAS six זה מ-Clostridium thermo cell. לאחר מכן, ערבבו את חלבון ה-CAS עם תערובת תגובה רעננה של אנדונוקליאז עבור 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C כדי לאפשר לתגובת בדיקת האנדונוקליאז להתרחש. לבסוף, העמיסו 5 µL מתערובת התגובה על ג'ל Urea בריכוז 8 M.

ג'ל poly acrylamide בריכוז 12% והדמיה של תוצרי השבירה לאחר אלקטרופורזה באמצעות auto radiography. כאן מוצג ג'ל poly acrylamide שנצבע ב-hine blue של אוליגונוקלאיד RNA בעיצוב מותאם אישית ושני תמלילי RNA שיוצרו in vitro. שימו לב כי יעילות ייצור ה-RNA משתנה בין המבנים הקצרים, הארוכים והאמצעיים.

בחינה של פעילות אנדונוקלאז של RNA מחייבת בקרות חיוביות ושליליות, וכן חלבון Cas רקומביננטי מטוהר מאוד. בדמות זו, ג'ל SDS-PAGE של תכשיר דגימה של Cas6 מ-Clostridium thermocellum.

מוצגת הרצה של כרומטוגרפיית Ni-NTA לאחר שקיעה בחום, לצד סמן חלבון סטנדרטי. דגימת ביקורת שלילית מתאימה צריכה להכיל ליזט תאים ללא ביטוי של CAS6, אך לאחר ביצוע הליך טיהור זהה של CAS6, נקבע כי תכשיר ה-CAS6 הוא בעל רמת הטוהר הגבוהה הנדרשת. כאן, ניתן להנמיח באמצעות רדיוגרפיה אוטומטית את שסועו של סבסטרט בעל רצף חוזר המסומן בקצה 5'.

כל נתיב מכיל סובסטרט מסומן רדיואקטיבית, RNA לאחר אינקובציה עם חלבון ca six כפי שצוין על ידי סימני הפלוס, או עם בופר כביקורת שלילית כפי שצוין על ידי סימני המינוס, סובסטרטים ארוכים או סובסטרטים קצרים עם או בלי הוספה של דאוקסי-ריבונוקלאוטיד במיקום מינוס תשע, אשר שימשו להקל על תגובת האנדונוקלאז. שימו לב להיעדר השברים בסובסטרטים הקצרים כאשר הדאוקסי-ריבונוקלאוטיד נכלל במולקולת ה-RNA בעקבות הליך זה.

ניתן להשתמש גם בנוקליאזות Cas 6 ככלי להפקת RNAs בוגים ומדויקים. ניתן לשלב RNAs אלו בתוך קומפלקסי cascade כדי להשיג תובנות לגבי מעורבותם בהפרעה להתקפות ויראליות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן התכנון וההפקה של סובסטרטים של CRISPR עבור נוקליאזות Cas.

מצעים שונים אלו יעילים למתן מענה לשאלות הנוגעות להבשלה ולניצול של crispr Es.