ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

המטרה הכללית של הליך זה היא לכמת אירועי היתוך תאים המתווכים על ידי snare באמצעות ביטוי מופעל של beta galacto. זאת מושג תחילה על ידי ביטוי אקטופי של חלבוני v ו-t snare על פני תאי cost seven. השלב הבא בהליך הוא שילוב של התאים המבטאים חלבוני V snare עם תאים המבטאים חלבוני T snare.

תהליך זה מוביל למיתוך תאים המתווך על ידי snare ולהבעיה פעילה של beta galacto. בסופו של דבר, נמדדת פעילות beta galacto שהושראה על ידי מיתוך התאים באמצעות ספקטרופוטומטר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת אזור ה-SAL המיקרוסקופית, הוא היכולת לנתח שילובי snare מרובים.

מבחינה כמותית, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להבין את המנגנון והוויסות של היתוך ממברנות המתווך על ידי snare. כמו כן, ניתן להשתמש בה למחקרי סריקה רחבה (throughput). את הפרוצדורה ידגימו ד"ר נא חסן, פוסט-דוקטורנט, ודייוויד המפרי, טכנאי מהמעבדה שלי, ביום שלפני טעינת הטרנספקציה.

הכינו פלטות בעלות 24 בארות עם כיסויי זכוכית (cover slips) בקוטר 12 מילימטר; הכינו שתי בארות לכל שילוב של תאים המבטאים פלסמידים ייחודיים בניסוי על גבי כיסויים אלו. זרעו 30,000 תאי cost seven שגודלו ב-DMEM המועשר ב-4.5 גרם לליטר גלוקוז ו-10% FBS לצורך טרנספקציה. עבור תאי V, הוסיפו לכל בארה רבע מיקרוגרם של פלסמיד TTA וסט אחד של פלסמידי ביטוי.

חלבונים מהופכים (flipped proteins) בעלי עניין, ובמקרה זה vamps מהופכים, כדי להחדיר לתאי T, הוסיפו רבע מיקרוגרם של הפלסמיד המקודד ל-TRE lacking Z, ואת קבוצת הפלסמידים המשלימה המקודדת לחלבונים המהופכים בעלי העניין. במקרה זה, snap 25, syntaxin 1 ו-syntaxin 4. כעת בצעו טרנספקציה לתאי cos7 באמצעות lipectomy בהתאם להנחיות היצרן, וגדלו את התאים למשך 24 שעות. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, קבעו את התאים ב-paraformaldehyde מועשר למשך 10 דקות. לאחר הקיבוע, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS++, ולאחר מכן חסמו את התאים באמצעות FBS מועשר למשך 30 דקות.

לאחר החסימה, דגרו את התאים עם הנוגדן המונוקלונלי anti mic Nine E 10 למשך 30 דקות. לאחר ארבעה שטיפות עם PBS++, דגרו את התאים למשך שעה עם נוגדים שניים מצומדים ל-fitzy בדילול של 1:500. לאחר ארבע שטיפות נוספות עם PBS++, קבעו את התאים המסומנים במגיש anti-fade זמין מסחרית.

התאים מוכנים כעת למיקרוסקופיה קונפוקלית. ביום שלפני הטרנספקציה, זרעו 1.2 מיליון תאי Cos-7 בכל צלחת תרבית רקמה של 100 מילימטר, ו-200,000 תאי Cos-7 בכל באר של פלטות בעלות שש בארים, עבור כל שילוב פלסמידים המיועד לניתוח. הכינו באר אחת, וגדלו את התאים למשך 24 שעות. למחרת, הוסיפו את הפלסמידים לטרנספקציה; עבור תאי V, טרנספקציו לתאים בכל תרבית של 100 מילימטר פלסמיד המבטא את חלבון ה-FLP רצוי ו-5 µg של pTet-Off.

בצע טרנספקציה של תאי בקרה בצלחת תרבית של 100 מילימטר באמצעות וקטור ריק ו-P te off בריכוזים יחסיים זהים לאלו של תאי V. לאחר הוספת כל הפלסמידים לתאי V ולתאי הבקרה, הוסף tcom mycin לבארים אלו כדי למנוע N glycosylation של vamps. בכל באר בלוחיות שש-הבארים, בצע טרנספקציה של תאי T עם מיקרוגרם אחד של PBIG יחד עם הפלסמידים המשלימים המבטאים את החלבונים הנחקרים.

כעת בצעו טרנספקציה לתאי ה-cost seven באמצעות lip בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, גדלו את התאים למשך 24 שעות; 24 שעות לאחר הטרנספקציה, נתקו את תאי ה-V מצלחות התרבית באמצעות תמיסה לפירוק תאים ללא אנזימים. התחילו בשטיפת התאים פעם אחת עם 20 milliliters של PBS.

לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטרים של בופר דיסוציאציה נקי מאנזימים. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, התאים ישתחררו על ידי טפיחה חזקה על הפלטה; יש לוודא תחת המיקרוסקופ שהם אכן התנתקו. אם פחות ממחצית מהתאים התנתקו, המתינו חמש דקות נוספות והקישו שוב על הפלטה.

המשיכו בדגירה בבופר ניתוק (detachment buffer) עד שמעל למחצית מהתאים יdetached. לאחר מכן, ספרו את תאי ה-V באמצעות המוציטומטר (hemocytometer). לאחר מכן, בצעו רסוזפנזיה (resuspend) לתאי ה-V בריכוז של כ-480,000 תאים למילליטר בבופר DMEM מועשר.

כעת הוסיפו מיליליטר אחד של תאי V שהושעו מחדש לכל באר המכילה את תאי ה-T והחזירו את הפלטות למדגרה. לאחר שש, 12 או 24 שעות של תרבית משותפת של התאים, שטפו אותם ב-PBS והוסיפו באפר ליזיס. לאחר מכן, גרדו את התאים מהבאערים והעבירו אותם למבחנות לצורך צנטריפוגה.

לאחר צנטריפוגה, העבירו את העילוי למבחנה חדשה ומדדו את הביטוי של beta galacto באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן; במהלך פרוטוקול זה, הקפידו לעצור את התגובה הכולרית לאחר 90 דקות על ידי הוספת נתרן פחמתי בריכוז one molar כדי להעריך את התוצאות. מדדו את הבליעה ב-420 nanometers בספקטרופוטומטר. כאשר תאי CO seven עברו טרנספקציה עם פלסמידים של flipped snare, חלקיבי flipped snare בוטאו על פני התא.

נעשה שימוש בציטומטריה של זרימה (Flow cytometry) כדי למדוד את רמות הביטוי של חלבוני snare על פני השטח של התא. כדי להשוות את יכולות ההיתוך של הממברנות, היה צורך לבטא את ה-vamps ברמה זהה. לפיכך, ריכוזה של כל פלסמיד snare הפוך ששימש בטרנספקציה תותירן ועבר אופטימיזציה עבור הטרנספקציה.

בתנאים אלה, vamps 1, 3, 4, 5, 7 ו-eight וכן syntaxin one ו-four בוטאו באותה רמה על פני השטח של התאים בהתאמה; ה-snares העצביים המתווכים אקסוציטוזה סינפטית שימשו לבחינת ההיתכנות של הבדיקה. ואכן, כאשר שולבו תאי V המבטאים vamp two ותאי T המבטאים SYNTAXIN one ו-snap 25, נצפה ביטוי חזק של beta galacto. עם זאת, כאשר vamp two או SNAP 25 לא בוטאו, נצפתה רק פעילות בסיס של beta galacto sase, מה שמעיד כי איחוי תאים והביטוי של beta galacto sase תלויים באינטראקציות בין v-snares ל-t-snares; באופן כללי, ל-SYNTAXIN one, snap 25, vamp one, vamp three ו-vamp eight הייתה פעילות איחוי דומה והיא הגבוהה ביותר.

לעומת זאת, פעילות הבסיס של beta GAL מעידה כי שילוב החלבונים אינו מניע היתוך ממברנות, כפי שקורה במקרה של vamp five ו-SYNTAXIN one. Snap 25. בעת ביצוע בדיקת ההיתוך האנזימטית, חשוב לזכור להוסיף unica mycin כדי למנוע גליקוזילציה של חלבוני esna ולהוסיף DTT כדי למנוע היווצרות קשרי דיסולפיד בין חלבוני esna.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של אופן ביצוע בדיקת היתוך תאים (cell fusion assay).