Name: ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: למדו לכמת אירועי איחוי תאים מלכודת-SNARE באמצעות ביטוי מופעל של β-galactosidase בתאי COS-7. השיטה מאפשרת ניתוח שילובי חלבונים מרובים ומספקת יתרון משמעותי על פני שיטות מיקרוסקופיות מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי קרני הפעלה מהאוניברסיטה לואיוויל וCA135123 מהמכונים הלאומיים לבריאות (לCH).

1. תא תרבות וTransfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> COS-7 תאים בתרבית הבינונית של Dulbecco שינוי הנשר (DMEM) בתוספת 4.5 גר &#39;/ הליטר וגלוקוז בסרום שור עוברי (10% FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transfection פלסמיד נעשה עם Lipofectamine על פי הוראות היצרן (Invitrogen). </li></ol> 2. ניתוח מיקרוסקופי קרינה של ביטוי מלכודת תא שטח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני transfection, 3 × 10 4 COS-7 תאי הזרע בcoverslips סטריליים 12-מ&quot;מ הזכוכית (הפישר סיינטיפיק) הכלול בצלחות 24 כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לV-תאים בכל אחד, 0.25 מיקרוגרם היטב של פלסמיד המקודד tta (pTet-Off, CLONTECH) הוא cotransfected עם 0.25 מיקרוגרם של פלסמיד שהתהפך VAMPs מפורש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאי ה-T בכל באר, 0.25 מיקרוגרם של קידוד פלסמיד TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) הוא cotransfected עם 0.25 מיקרוגרם כל אחד מפלסמידים שהתהפכו מפורשים SNAP-25 וsyntaxins 1 או 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר transfection, תאים קבועים עם paraformaldehyde 4% ב PBS + + (PBS בתוספת 0.1 גר &#39;/ ליטר CaCl 2 ו -0.1 ג&#39;/ ליטר MgCl 2) למשך 10 דקות, ולאחר מכן חסם ב10% FBS ב PBS + + למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מודגרת עבור 1.5 שעות עם 9E10 נוגדנים אנטי-myc (supernatant תרבות היברידומה המסודר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי ארבע כביסות עם PBS + +, התאים מודגרת לשעה 1 עם נוגדני FITC-מצומדות משניים (מעבדות ג&#39;קסון Immunoresearch) בדילול של 1:500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי ארבע כביסות עם PBS + +, תאי שהכותרת הם רכובים בהארכה מגיבה antifade זהב (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות confocal נאספות על מיקרוסקופ confocal סריקת ליזר אולימפוס. הדימויים מעובדים בתוכנת Photoshop Adobe. </li></ol> 3. ניתוח FACS של ביטוי מלכודת תא שטח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני transfection, 2 × 10 5 COS-7 תאי זרע בכל באר של צלחות 6-כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר transfection עם התהפך מלכודת, pTet-Off ופלסמידים PBI-G, תאים קבועים עם paraformaldehyde 1% בPBS + + במשך 15 דקות, ולאחר מכן חסמו ב10% FBS ב PBS + + במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מודגרת עם 9E10 הנוגדנים אנטי-myc עבור 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלוש כביסות עם PBS + +, התאים מסומנים עם נוגדנים משניים FITC-מצומדות (1:200 דילול) עבור 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלוש כביסות עם PBS + +, התאים לגרד את הצלחות עם מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15,000 תאים מנותחים באמצעות cytometer זרימת FACSCalibur (BD Biosciences). עוצמת הקרינה הממוצעת של כל דגימה מתקבלת באמצעות תוכנת Pro CellQuest. </li></ol> 4. Assay איחוי תאים האנזימטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני transfection, 1.2 × 10 6 COS-7 התאים זרע בכל צלחת תרבית רקמה 100-מ&quot;מ, ו2 × 10 5 COS-7 תאי זרע בכל באר של צלחות 6-כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור v-תאים, 0.5-5 ק&quot;ג כל אחד מflippעורך נצלן פלסמיד הוא cotransfected עם 5 מיקרוגרם של-Off pTet לתוך התאים בכל מנת התרבות 100-מ&quot;מ. תאי בקרה cotransfected עם pcDNA3.1 הריק וקטור (+) וpTet-Off. כדי למנוע את N-glycosylation של 1 VAMPs, 4, 5, 7 ו 8, tunicamycin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) כלול במדיום תרבות תא במהלך transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור T-תאים בכל באר של הצלחות 6-כן, מיקרוגרם 1 מתוך התהפך SNAP-25 פלסמיד וPBI-G הוא cotransfected עם 0.5 מיקרוגרם של התהפך מיקרוגרם syntaxin1 פלסמיד או 0.05 של התהפך syntaxin4 פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר transfection, V-תאים מנותקים ממנות התרבות עם תא דיסוציאציה מאגר אנזימים חינם (Invitrogen). תאים משפחתיים נספרים עם hemacytometer וresuspended בHEPES-נאגר DMEM בתוספת 10% FBS, 6.7 מיקרוגרם / המ&quot;ל tunicamycin וDTT mM 0.67. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4.8 × 10 5 resuspended V-תאים נוספים לכל גם כבר מכיל את תאי ה-T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חולדת 6, 12 או 24 שעות 37 מעלות צלזיוס בCO 2 5% </sub&gt;, הביטוי של β-גלקטוזידאז נמדד באמצעות מערכת Assay אנזים β-גלקטוזידאז במאגר תמוגה כתב בהתאם להוראות היצרן (Promega). בקצרה, התאים נשטפו פעמים עם PBS, ולאחר מכן lysed במאגר תמוגה הכתב. lysates הסלולרי מעורבב עם נפח שווה של חיץ × Assay 2. כשלט ריק, מאגר תמוגה הכתב מעורבב עם הצפת Assay × 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 90 דקות, תגובת colorimetric הוא נעצר על ידי הוספת סודיום קרבונט M 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספיגה ב420 ננומטר נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר 100-40 HITACHI. </li></ol>

<ol><li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+intracellular+protein+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li>
<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs--engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li>
<li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREpins%3A+minimal+machinery+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li>
<li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li>
<li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li>
<li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+%28VAMPs%29+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238(2010).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li>
<li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+%5Bsee+comments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li>
<li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li>
<li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+synaptobrevin%2FVAMP+homologous+protein+%28VAMP5%29+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li>
<li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li>
<li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endobrevin%2C+a+novel+synaptobrevin%2FVAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Assay איחוי התאים המקורי 6 קובע אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאן אנו מתארים assay חדשני המכמת אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז ומדידת spectrometric. שימוש assay זה, אנו שגרתי לנתח 15-20-V ו-T-Snare שילובים יחיד בניסוי. באמצעות cytometry זרימה למדוד ביטוי מלכודת בתא השטח, אנו כיל את רמות הביטוי של VAMPs ולהשוות יכולות האיחוי שלהם (איורים 2, 4). יתר על כן, באמצעות איחוי התאים assay אנזימטי, קבע את התלות של פ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של מגיב וציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> COS-7 תאים </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td> tunicamycin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> T7765-5mg </td></tr><tr><td> pTet-Off </td><td> Clontech </td><td> K1620- </td></tr><tr><td> PBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6150-1 </td></tr><tr><td> lipofectamine </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> פתרון דיסוציאציה תא אנזים חינם </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> ארנב נוגדן אנטי polyclonal ט repressor </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> אנטי עכבר FITC מצומדות החמור IgG (H + L) </td><td> JacImmunoResearch kson </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> confocal מיקרוסקופ סריקת ליזר </td><td> אולימפוס </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> cytometer הזרימה FACSCalibur </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> מערכת Assay אנזים β-גלקטוזידאז במאגר תמוגה כתב </td><td> Promega </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> הדגם 100-40 ספקטרופוטומטר UV-VIS </td><td> היטאצ&#39;י </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות assay איחוי תאים אנזימתי

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

האינטראקציות של מלכודת (גורם oluble N-ethylmaleimide רגיש ceptor מחדש חלבון ttachment ים) חלבונים על שלפוחית ​​(V-מלכודות) ועל קרומי היעד (t-מלכודות) לזרז איחוי שלפוחית ​​תאית 1-4. מבחנים הם חיוניים לכינון מחדש לנתח את מנגנון הוויסות של איחוי המלכודת בתיווך 5. בבדיקת איחוי תאי 6,7, חלבוני מלכודת מתבטאים ectopically בתא השטח. אלה &quot;התהפכו&quot; איחוי כונן מלכודת חלבוני תאי תאים, הוכחה כי מלכודות מספיקות לאיחוי קרום תא. בגלל assay איחוי התאים מתבסס על ניתוח מיקרוסקופי, הוא פחות יעיל כאשר משתמשים בו כדי לנתח מרובה v-ואינטראקציות t-Snare כמותית. כאן אנו מתארים בדיקה חדשה 8 שמכמתת אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז. שניםמרכיבים של מערכת ביטוי גני ט הכבויה 9 משמשים כמערכת readout: טטרציקלין המבוקר transactivator (tta) וכתב פלסמיד שמקודד גן LacZ תחת שליטה של אלמנט טטרציקלין-התגובה (TRE-LacZ). אנו transfect tta לCOS-7 תאים שהתהפכו מפורשים חלבוני v-Snare בתא השטח (V-תאים) וtransfect TRE-LacZ לCOS-7 תאים שהתהפכו מפורשים חלבוני t-Snare בתא השטח (T-תאים) . היתוך מלכודת תלויה של V-והתוצאות מתאי T בכריכה של tta לTRE, הפעלת התעתיק של LacZ והביטוי של β-גלקטוזידאז. הפעילות של β-גלקטוזידאז היא לכמת בשיטת colorimetric על ידי ספיגה ב420 ננומטר. חלבוני קרום שלפוחית ​​הקשורים (VAMPs) הם V-מלכודות שנמצאות בתאים שונים לאחר Golgi שלפוחי 10-15. על ידי בעת 1 VAMPs, 3, 4, 5, 7 ו 8 באותה הרמה, אנו משווים איחויםפעילות באמצעות assay איחוי התאים האנזימטית. מבוסס על מדידת spectrometric, assay זה מציע גישה כמותית לניתוח איחוי מלכודת בתיווך ועל מחקרי תפוקה גבוהה.

לפתח assay איחוי תאי כמותיים, אנו מנצלים את הפעלת השעתוק החזקה על ידי הכריכה של tta לTRE. בהעדר tta, השעתוק של גן LacZ בTRE-LacZ שותק. כאשר tta קיים, הוא נקשר לTRE ומפעיל את השעתוק של LacZ. איור 1 מציג תרשים זרימה של assay איחוי התאים האנזימטית. tta הוא transfected לתוך V-תאים שחלבונים המפורש v-מוקש בתא השטח, וTRE-LacZ הם transfected לתוך תאי T שחלבונים מפורשים t-מוקש בתא השטח. היתוך של V-והתוצאות מתאי T בכריכה של tta לTRE, הפעלת התעתיק ...

פתחנו assay איחוי תאים שמכמת אירועי איחוי המלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז.

ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

האינטראקציות של חלבוני SNARE (קולטנים של חלבון התקשרות רגיש ל-N-ethylmaleimide מסיס) על וסיקולות (v-SNAREs) ועל קרומי מטרה...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת אירועי היתוך תאים המתווכים על ידי snare באמצעות ביטוי מופעל של beta galacto. דבר זה מושג תחילה על ידי ביטוי אקטופי של חלבוני v ו-t snare על פני תאי cost seven. השלב הבא של ההליך הוא שילוב התאים המבטאים חלבוני V snare עם תאים המבטאים חלבוני T snare.תהליך זה מוביל למיתוך תאים המתווך על ידי snare ולהבעה פעילה של beta galacto. בסופו של דבר, נמדד את פעילות ה-beta galacto שהושרה על ידי מיתוך התאים באמצעות ספקטרופוטומטר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת אזור SAL מיקרוסקופית, הוא היכולת לנתח שילובי snare מרובים.מבחינה כמותית, אף שניתן להחיל שיטה זו כדי להבין את המנגנון והוויסות של היתוך ממברנות המתווך על ידי snare, ניתן להשתמש בה גם למחקרי תפוקה גבוהה (throughput). את הפרוצדורה ידגימו ד"ר Na Hassan, פוסט-דוקטורנט, ו-David Humphrey, טכנאי מהמעבדה שלי, ביום שלפני טעינת הטרנספקציה.הכינו פלטות של 24 בארות עם כיסויי זכוכית (cover slips) בקוטר 12 מילימטר; הכינו שתי בארות עבור כל שילוב של תאים המבטאים פלסמידים ייחודיים בניסוי על גבי כיסויים אלו. זרעו 30,000 תאי cost seven שגודלו ב-DMEM עם תוספת של 4.5 grams per liter גלוקוז ו-10% FBS לצורך טרנספקציה. עבור תאי ה-V, הוסיפו לכל בארה רבע מיקרוגרם של פלסמיד TTA וסט אחד של פלסמידים לביטוי.העבירו את החלבונים הרצויים, ובמקרה זה vamps, כדי לבצע טרנספקציה לתאי T; הוסיפו רבע מיקרוגרם של הפלסמיד המקודד ל-TRE lacks Z, ואת מערכת הפלסמידים המשלימה המקודדת לחלבונים הרצויים. במקרה זה, snap 25, syntaxin one ו-syntaxin four. כעת בצעו טרנספקציה ל-cost seven באמצעות lipectomy בהתאם להוראות היצרן, וגדלו את התאים למשך 24 שעות. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, קבעו את התאים ב-paraformaldehyde מועשר למשך 10 דקות. לאחר הקיבוע, שטפו את התאים שלוש פעמים עם ++PBS, ולאחר מכן חסמו את התאים עם FBS מועשר למשך 30 דקות.לאחר החסימה, דגרו את התאים עם הנוגדן המוניקלואלי anti-mic Nine E 10 למשך 30 דקות. לאחר ארבעה שטיפות עם PBS++, דגרו את התאים למשך שעה עם נוגדנים משניים המשומשעים ב-FITC בדילול של 1:500. לאחר ארבע שטיפות נוספות עם PBS++, העבירו את התאים המסומנים למסבך באמצעות ריאגנט anti-fade זמין מסחרית.התאים מוכנים כעת למיקרוסקופיה קונפוקלית. ביום שלפני הטרנספקציה, זרעו 1.2 מיליון תאי costs seven בכל צלח תרבית רקמה של 100 מילימטר, ו-200,000 תאי costs seven בכל באער של פלטות בעלות שישה באערים עבור כל שילוב פלסמידים המיועד לניתוח. הכינו באער אחד, וגדלו את התאים במשך 24 שעות. למחרת, הוסיפו את הפלסמידים לטרנספקציה. עבור תאי V, טרנספקציה של פלסמיד המבטא את חלבון ה-flipped המבוקש ו-5 מיקרוגרם של p tet off לתאים בכל תרבית של 100 מילימטר.בצע cot transfect לתאי ביקורת בצלחת תרבית של 100 מילימטר עם וקטור ריק ו-P te off באותן ריכוזים יחסיים כמו בתאי ה-V. לאחר שכל הפלסמידים הוספו לתאי ה-V ולתאי הביקורת, הוסף tcom mycin לבארים אלו כדי למנוע N glycosylation של vamps. בכל באר בלוחות שש הבארים, בצע cot transfect לתאי ה-T עם מיקרוגרם אחד של PBIG יחד עם הפלסמידים המשלימים המבטאים את החלבונים הרלוונטיים.כעת בצעו טרנספקציה לתאי ה-cost seven באמצעות ליפוזומים בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, תרבתו את התאים למשך 24 שעות. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, הפרדו את תאי ה-V מהצלחות התרבית באמצעות בופר לפירוק תאים ללא אנזימים. התחילו בשטיפה חד-פעמית של התאים עם 20 milliliters של PBS.לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטרים של תמיסת הפרדה (dissociation buffer) נטולת אנזימים. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, התאים ישתחררו על ידי הקשה חזקה על הפלטה; ודאו תחת המיקרוסקופ שהם התנתקו. אם פחות ממחצית מהתאים התנתקו, המתינו חמש דקות נוספות והקישו שוב על הפלטה.המשך את הדגירה בבופר ניתוק עד שיותר מחצי מהתאים יסרקו. לאחר מכן, ספור את תאי ה-V באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, השהה את תאי ה-V בריכוז של כ-480,000 תאים למילליליטר בבופר DMEM מועשר.כעת הוסיפו מיליליטר אחד של תאי V שהושחאו מחדש לכל באער המכיל את תאי ה-T והחזירו את הפלטות לאינקובטור. לאחר שש, 12 או 24 שעות של תרבית משותפת של התאים, שטפו אותם ב-PBS והוסיפו בופר ליזיס. לאחר מכן, גרדו את התאים מהבבארים והעבירו אותם למבחנות לצורך סבב צנטריפוגה.לאחר צנטריפוגציה, העבירו את תמיסת העל למבחנה חדשה ומדדו את הביטוי של beta galacto באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן; במהלך פרוטוקול זה, הקפידו לעצור את תגובת ה-cholera metric לאחר 90 דקות על ידי הוספת sodium carbonate בריכוז one molar כדי להעריך את התוצאות. מדדו את הבליעה ב-420 nanometers באמצעות spectrophotometer. כאשר תאי CO seven עברו טרנספקציה עם פלסמידים של flipped snare, חלבוני flipped snare בוטאו על פני השטח של התא.נעשה שימוש בציטומטריית זרימה כדי למדוד את רמות הביטוי של חלבוני snare על פני השטח של התא. על מנת להשוות את יכולות היתוך הממברנה שלהם, היה צורך לבטא את ה-vamps ברמה זהה. לפיכך, ריכוזו של כל פלסמיד snare הפוך ששימש בטרנספקציה תותמר ואופטימי עבור הטרנספקציה.תחת תנאים אלו, vamps 1, 3, 4, 5, 7, ו-eight וכן syntaxin one ו-four בוטאו באותה רמה על פני התא בהתאמה; ה-snares הנוירונליים המתווכים אקסוציטוזה סינפטית שימשו לבדיקת היתכנותה של הבדיקה. ואכן, כאשר שולבו תאי V המבטאים vamp two ותאי T המבטאים SYNTAXIN one snap 25, זוהה ביטוי חזק של beta galacto. עם זאת, כאשר vamp two או SNAP 25 לא בוטאו, זוהלה רק פעילות בסיסית של beta galacto sase, דבר המצביע על כך שאיחוי תאים וביטוי של beta galacto sase תלויים באינטראקציות של v-snares ו-t-snares; באופן כללי, ל-SYNTAXIN one, snap 25, vamp one, vamp three, ו-vamp eight הייתה פעילות איחוי דומה והגבוהה ביותר.לעומת זאת, פעילות הבסיס של beta GAL מרמזת כי שילוב החלבונים אינו מניע היתוך ממברנות, בדומה למקרה שבין vamp five ל-SYNTAXIN one ו-Snap 25. בעת ביצוע בדיקת ההיתוך האנזימטית, חשוב לזכור להוסיף unica mycin כדי למנוע גליקוזילציה של חלבוני esna, ולהוסיף DTT כדי למנוע היווצרות קשרי דיסולפיד בין חלבוני esna.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן ביצוע בדיקת היתוך תאים.

analysis-snare-mediated-membrane-fusion-using-an-enzymatic-cell

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

בסרטון הזה אנחנו מדגימים electrofusion יעילה של...

Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

היתוך מיטוכונדריאלי נמדד על ידי מעקב אחר איזון של ה-GFP מטריקס במיקוד photoconverted ברשת המיטוכונדריה לאורך זמן. עד כה, רק תא אחד יכול להיות חשוף ניתוח שעה ארוכה קינטית בכל פעם. אנו מציגים שיטה מודד בו זמנית מספר תאים, ובכך להאיץ את תהליך איסוף הנתונים.

מהר יותר, ברזולוציה גבוהה, mtpa-GFP מבוססי Fusion Assay מיטוכונדריאלי רכישת נתונים הקינטית של מספר תאים במקביל באמצעות מיקרוסקופ Confocal

טכניקות מיקרוסקופ אור בשילוב עם מבחנים ביוכימיים מבהירים את המעורבות של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים תלויי נטרין. שילוב טכניקות זה מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים השולטים בהסתעפות האקסון ובשינוי צורת התא.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזהות אירועי היתוך אחד, בתיווך מלכודת בין ליפוזומים bilayers נתמך ערוצי microfluidic באמצעות TIRFM המקוטב, עם רגישות מולקולה בודדת ~ 15 ברזולוצית זמן msec. ליפידים ושחרור מטען מסיס ניתן לאתר בו זמנית. Liposome גודל, diffusivity שומנים, ואת הנקבוביות היתוך מאפיינים נמדדים.

מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ומאפשר הפריט החזותי כמותית של היווצרות מורכבות של חלבונים מוקש, המבוססת על העברת האנרגיה תהודה פורסטר, ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה במיקרוסקופ.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

כאן, אנו מציגים את ההליך מפורט של פלטפורמה assay פרוטאז שפותחו לאחרונה ניצול N-מסוף hexahistidine/מלטוז-מחייב חלבון ותערובות פלורסנט התמזגו חלבון רקומביננטי המחובר למשטח של ניקל-nitrilotriacetic חומצה agarose מגנטי חרוזים. גם מוצג ניתוח בג'ל עוקבות של הדגימות assay המופרדות על-ידי נתרן גופרתי-לזיהוי dodecyl בג'ל.

השימוש פיוז'ן רקומביננטי חלבונים פלטפורמה Assay פרוטאז פלורסנט, Renaturation שלהם בג'ל

היתוך ממברנה ביולוגי מזרז על ידי חלבונים היתוך מיוחדים. מדידת תכונות fusogenic של חלבונים ניתן להשיג על ידי ערבוב שומנים בעלי. אנו מציגים שיטה לטיהור רקומביננטי דרוסוילה אטלסטין, חלבון המרפא הומוטיפקס של המיון, ממנה את המבנה ליפוזומים מראש ובדיקת קיבולת היתוך.

כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה קונפוקלית לזיהוי שלושה מצבי איחוי בתאי כרומפין של יותרת הכליה בקר. מצבי היתוך אלה כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבוביות שנפתחו, ו-3) היתוך-כיווץ, הכולל התכווצות שלפוחית מתמזגת.

מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה

למדו לכמת אירועי איחוי תאים מלכודת-SNARE באמצעות ביטוי מופעל של β-galactosidase בתאי COS-7. השיטה מאפשרת ניתוח שילובי חלבונים מרובים ומספקת יתרון משמעותי על פני שיטות מיקרוסקופיות מסורתיות.

ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

גלה סרטונים נוספים