Name: Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: למדו ליצור ננו סיבים ומבנים מורכבים מחלבוני מטריצה חוץ-תאית באמצעות הרכבה מונעת פני שטח. השיטה מאפשרת שליטה בתכונות החומר להנדסת רקמות וביוטכנולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

העניקה תמיכה כספית לJMS מיומכניקה NIH בתכנית רפואת רגנרטיבית T32 הדרכה (2T32EB003392), לQJ ממלגת דאוד-ICES וAWF מפרס ממציא ניו המנהל של NIH (1DP2HL117750).

1. ייצור של עובש מאסטר באמצעות photolithography <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nanofibers חלבון ECM, nanofabrics וננו להיות מפוברק נועדו ראשון באמצעות תכנון בעזרת מחשב תוכנה (CAD). קובץ CAD זה הוא הועבר לאחר מכן לphotomask. הסוג של photomask יהיה תלוי ברזולוציה של התכונות; עם photomask מבוסס שקיפות נאותה לגדלי תכונה עד ~ 10 מיקרומטר. תכונות קטנות &lt;10 מיקרומטר ידרשו כרום על photomask זכוכית. כל nanofibers וננו שהוצג כאן היו מפוברק באמצעות photomask מבוסס שקיפות, וכך היו בקנה מידה ננומטרי בעובי אבל ממדים לא לרוחב. הערה: חשוב להבחין אילו אזורים של photomask יהיו כהים (למנוע אור UV לעבור) ושיהיה שקוף (מאפשר אור UV לעבור) כמו זה, יחד עם הסוג של photoresist (חיובי או שלילי) , יכתיב את הטופוגרפיה הסופית של עובש האב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל ייצור של עובש האב, מייבש את פרוסות סיליקון 4 &quot;על ידי הצבתו על פלטה חמה להגדיר ל-C ° 150 ל15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז את רקיק על צ&#39;אק הוואקום של ספין coater. יוצקים SU8-2015 photoresist השלילי על אמצע רקיק ותמשיך לשפוך במעגלים קונצנטריים, עד כשני שליש מהפרוסות מכוסה. הערה: שמור את בקבוק קרוב SU8 לרקיק כאשר לשפוך כדי למזער את היווצרותן של בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת את spincoater כדלקמן: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור התפשטות: סל&quot;ד 500 עם האצת 100 סל&quot;ד / שניות ל10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סחיטה: 4,000 סל&quot;ד עם האצת 100 סל&quot;ד / שניות ל30 שניות. </li></ul> הערה: מתכון spincoating זה יהווה שכבת photoresist שהיא ~ 10 מיקרומטר בעובי. על ידי שינוי מהירות ספינינג או ניסוח SU8, ניתן להתאים את העובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רך לאפות את רקיק על ידי הצבתו על פלטה חמה שנקבעה ל95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את רקיק עם אור האולטרה סגול דרךphotomask למינון כולל של 140 mJ / 2 סנטימטר. הערה: SU8 הוא photoresist שלילי ולכן האזורים בהם אור UV הוא מסוגל לעבור photomask יישארו לאחר הפיתוח ולהפוך לתכונות שהועלו על תבנית האב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חשיפה לאפות את רקיק על ידי הצבתו על פלטה חמה להגדיר ל-C ° 95 למשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את רקיק על ידי הצבתו במפתח SU8 במשך 3 דקות. לאחר 3 דקות, לשטוף את רקיק עם אלכוהול איזופרופיל. אם סרט לבן מופק במהלך השטיפה, רקיק אינו מפותח באופן מלא וזה צריך להיות ממוקם בגב המפתח ל30 שניות אחרת. לשטוף שוב עם אלכוהול איזופרופיל. חזור על תהליך זה עד שסרט לבן לא הטופס במהלך שטיפת אלכוהול איזופרופיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את רקיק בזרם של חנקן ומניחים בצלחת פטרי 150 מ&quot;מ כדי להגן מפני אבק. </li></ol> 2. ביצוע בולים PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את prepolymer PDMS על ידי שילוב של בסיס אלסטומר וסוכן הריפוי ב10:01 יחס w / w. בדרך כלל 80 גרם של בסיס ו8 גרם של סוכן ריפוי נמצא בשימוש על מנת להבטיח שיש PDMS מספיק כדי לכסות את התבנית השנייה בשכבה בעובי 1 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים ודגת PDMS בעזרת מערבל הצנטריפטלי מוגדר הבא: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים: 2,000 סל&quot;ד 2 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגה: 2,000 סל&quot;ד במשך 2 דקות. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מערבל אינו זמין לערבב PDMS ביד עבור 10 דקות באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מיליליטר. דגה את התערובת על ידי הצבתו בייבוש ואקום ל30 דקות כדי להסיר בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים prepolymer PDMS מספיק על עובש האב (פרוסות סיליקון בדוגמת) כדי ליצור שכבה בעובי 1 סנטימטר. Cure PDMS על ידי אפייה ב65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או בטמפרטורת חדר למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שנרפא, ניתן לחתוך את האזורים המכילים את התבניות כדי ליצור את חותמות PDMS. כדי להבדיל בין צד התכונה מהישבן של חותמת PDMS, לחתוך חריץ מאחת הפינות בצד האחורי של הבול. </li></ol> 3. Microcontact Printing של דפוסי ECM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips זכוכית קוטר 25 מ&quot;מ נקי על ידי sonication ב95% אתנול עבור שעה 1 ולאחר מכן יבשה בתנור 65 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון PIPAAm ידי המסת PIPAAm ב1-butanol בריכוז של 10% (w / v, 1 גרם בדרך כלל ב10 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז coverslip זכוכית על צ&#39;אק הוואקום של spincoater ופיפטה 200 μl של פתרון PIPAAm כך שכל משטח הזכוכית מכוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spincoat coverslip ב6,000 סל&quot;ד דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את בולי PDMS על ידי sonication ב50% אתנול ל30 דקות ולאחר מכן יבשה תחת זרם של חנקן. הערה: ייבוש והשלבים הבאים צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי כדי לשמור על סטריליות ליישומים שבם ננו ECM ישמש בתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעייל את פני השטח בדוגמתו של כל PDMS להחתים עם 200 μl של פתרון החלבון, בדרך כלל 50 מיקרוגרם / מיליליטר במים מזוקקים סטריליים לFN. דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. הערה: ההוא ציפוי הנפח הוא לחותמת PDMS 1.5 2 סנטימטר וצריכה להיות מותאם בהתאם לגודל של בול PDMS, חלבון ECM משמש ואת הריכוז של חלבון ECM בתמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את בולי PDMS במים מזוקקים כדי להסיר חלבון ויבש עודפים ביסודיות תחת זרם של חנקן. הערה: כל מים שנשארו על החותמת יפעילו את הפירוק המוקדם של ציפוי PIPAAm על coverslip ולמנוע העברת חלבון תקינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ייצור סטרילי, הנח את coverslips מצופה PIPAAm בתוך צלחת פטרי סגורה ולעקר באמצעות חשיפה לקרינת UV, 45 דקות תחת אור UV בארון בטיחות ביולוגי הוא מספיק. אם אין צורך בסטריליות ניתן להשמיט את הצעד הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדפסת microcontact על ידי הצבת בצד התכונה של חותמת PDMS במגע עם coverslip מצופה PIPAAm. במידת צורך, להשתמש במלקחיים כדי לנצל באורח קל בצד האחורי של הבולים כדי להסיר כל בועות אוויר ולהבטיח מגע אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 ק&quot;מn, לקלף את חותמת PDMS מcoverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, ניתן בדוגמת חלבוני ECM נוספים כדי ליצור מבנים מורכבים יותר וmulticomponent. עד 3 הדפסות אומתו לעבוד עם תהליך זה, ועוד יכול להיות ריאלי. </li></ol> 4. שחרור ECM Nanofibers וננו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslip PIPAAm הדוגמת המצופה בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ ולבדוק את נאמנות הדפוס באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. בהתאם לדגם, מצלמת CCD עשויה להיות נחוצה כדי לפתור את התכונות של הדפוס. גם מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לשמש כדי לבדוק את הדפוס סיפק את חלבוני ECM שכותרתו fluorescently. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר של מים 40 ° C מזוקקים לצלחת פטרי ולאפשר למים קרירים בהדרגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירוקה של שכבת PIPAAm ושחרורו של דפוסי חלבון ECM ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. אם היישום אינו מאפשר השימוש בטק האופטיhniques, השחרור יכול להיות במעקב על ידי מדידת טמפרטורת הפתרון. בדרך כלל, המים מקוררים לטמפרטורת חדר, גם מתחת לLCST של PIPAAm (32 מעלות צלזיוס), כדי להבטיח את ננו חלבון ECM כבר פורסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שחרורו, nanofibers, nanofabrics וננו האחר צפים במים. כדי להשתמש בם ליישומים נוספים שהם צריכים לטפל. הגישה המדויקת תהיה תלויה במטרה הניסיונית ועשויה לכלול צעדים כגון לשתק על משטח אחר, נעו עם מערכת micromanipulator או ההטבעה בהידרוג&#39;ל. </li></ol>

<ol><li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Teo, W. E., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+electrospinning+design+and+nanofibre+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">A review on electrospinning design and nanofibre assemblies.</a> Nanotechnology. 17, (2006).</li>
<li>Reneker, D. H., Chun, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometre+diameter+fibres+of+polymer%2C+produced+by+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning.</a> Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).</li>
<li>Ma, P. X., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+nano-scale+fibrous+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).</li>
<li>Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biodegradable+nanofiber+scaffold+by+electrospinning+and+its+potential+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).</li>
<li>Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+structure%3A+a+novel+scaffold+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).</li>
<li>Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).</li>
<li>Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+and+mechanical+characterization+of+gelatin+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers.</a> Polymer. 45, 5361-5368 (2004).</li>
<li>Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).</li>
<li>Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+chitosan-based+nanofibers+and+their+cellular+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility.</a> Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).</li>
<li>Jin, H. -J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+marrow+stromal+cell+responses+on+electrospun+silk+fibroin+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats.</a> Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).</li>
<li>Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+fibronectin+matrix+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of fibronectin matrix assembly.</a> Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).</li>
<li>Mosher, D. F., Johnson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+formation+of+disulfide-bonded+fibronectin+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers.</a> Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).</li>
<li>Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+to+mechanically+tune+and+optically+probe+fibrillar+fibronectin+conformations+from+fully+relaxed+to+breakage%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage.</a> Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).</li>
<li>Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-induced+fibronectin+fibrillogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro.</a> Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).</li>
<li>Klotzsch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+forms+the+most+extensible+biological+fibers+displaying+switchable+force-exposed+cryptic+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).</li>
<li>Feinberg, A. W., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Initiated+Assembly+of+Protein+Nanofabrics%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics.</a> Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).</li>
<li>Deravi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Contributions+of+Conformation+Extension+and+Domain+Unfolding+to+Properties+of+Fibronectin+Nanotextiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles.</a> Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).</li>
<li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+Proteins+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology.</a> J Vis Exp. , 1065(2008).</li>
<li>Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+Involving+Multimodular+Proteins%3A+Converting+Force+into+Biochemical+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שיטת SIA מוצגת כאן מחקה הרכבה מטריצת תא בתיווך ומאפשרת להנדסה של nanofibers חלבון ECM וננו עם גודל מתכונן, ארגון וקומפוזיציה. אמנם לא זהה לECM-תא שנוצר, SIA יוצר ECM מורכב מסיבי חלבון ננו 20 שעוברים קיפול הפיך / התגלגלות במהלך מאמץ מכאני 21 ויכולים להיקשר לתאים 20. זה מספק יכולת ייחודית לבנות חומרי חלבון ECM כי לשחזר מאפיינים רבים של ECM מצאו in vivo. לדוגמא, יכול להיות מפוברק nanofibers ECM באורכים ספציפיים עם רמת השליטה מעשית עם טכניקות ...

המטריצה ​​תאית (ECM) ברקמות מורכבת מחלבונים רב תכליתיים המעורבים בויסות פיסיקלית וכימית של תהליכים בתא מרובים, כולל הידבקות, התפשטות, התמיינות, ואפופטוזיס 1-3. ECM הוא מסונתז, התאסף, ומאורגן על ידי תאים ויש להם את סיבי החלבון המרכיבים את יצירות ייחודיות, גודל סיבים, גיאומטריות וארכיטקטורות המחוברים ביניהם משתנות עם סוג רקמה ושלב התפתחותי. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי ECM יכול לספק מאלפות רמזים שינחה את התאים ליצירת רקמות מהונדסות 4, המצביעה על כך משחזר ECM במונחים של הרכב ומבנה עשוי לאפשר הפיתוח של חומרי biomimetic עבור יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות. מספר שיטות ייצור פותחו כדי להנדס פיגומים פולימריים שיכול לחקות היבטים של ECM ברקמות. לדוגמא, electrospinning ומפריד, שלבation שניהם הפגין היכולת ליצור מטריצות נקבוביות של סיבים בקטרים ​​הנעים בין עשרות מיקרומטר עד עשרות ננומטרים 5-7. גם שני הטכניקות הראו כי מטריצות נקבוביות ביותר של nanofibers יכולות לתמוך הידבקות תא וחדיר לפיגום 8. עם זאת, גישות אלו מוגבלות בגיאומטריות סיבים, אוריינטציות ו3D הארכיטקטורות אפשריות שיכול להיות שנוצרו. Electrospinning בדרך כלל מייצר פיגומים בסיבים או בכיוון או מיושרים מאוד באופן אקראי ואילו הפרדת פאזות מייצרת פיגומים עם סיבים בכיוון באופן אקראי. יש גם מגבלות על החומרים, עם חוקרים בדרך כלל משתמשים בפולימרים סינטטיים, כגון פולי (ε-caprolactone) 8 ופולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) 9, כי הם מצופים לאחר מכן עם חלבוני ECM לקדם הידבקות תא. biopolymers הטבעית משמשות גם, לרבות סוג קולגן אני 10, ג&#39;לטין 11, פיברינוגן 12,chitosan 13, ומשי 14, אבל מייצגים קבוצה קטנה בלבד של החלבונים הנמצאים ברקמות מקומיות. רוב הרקמות מכילות סביבה גדולה יותר של חלבוני ECM וסוכרים כוללים פיברונקטין (FN), laminin (LN), סוג IV קולגן וחומצה היאלורונית שקשים או בלתי אפשריים לפברק nanofibers תוך שימוש בשיטות קיימות. כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו מתמקדים מאמצי המחקר שלנו במחקו את הדרך בה תאים לסנתז, להרכיב ולארגן את סיבי חלבון ECM בסביבתם. בעוד תהליך fibrillogenesis הספציפי משתנה לחלבוני ECM שונים, בדרך כלל שינוי קונפורמציה במולקולת חלבון ECM מופעל על ידי האנזימטית או אינטראקציה קולטן בתיווך, אשר חושף אתרי הרכבה עצמית נסתרים. כאן אנו משתמשים FN כמערכת מודל להבין את תהליך fibrillogenesis טוב יותר. בקצרה, homodimers FN להיקשר לקולטנים integrin על פני התא באמצעות רצף חומצות אמינו RGD בסוג 10th השניאני חוזר ליחידה. ברגע שחייב, integrins לנוע בנפרד באמצעות התכווצות actomyosin ולהתפתח הדימרים FN לחשוף אתרי הרכבה עצמית נסתרים. החשיפה של האתרים הללו FN-FN המחייבים מאפשרת הדימרים FN להרכיב ליפון מסיס תקין על פני תא 15. עבודה במערכות תא ללא הוכיחה שיכולים להתגלות אתרי FN-FN נסתרים מחייבים דרך התגלגלות באמצעות denaturants 16 או מתח פנים בנוזל מוצק אוויר ממשק 17-19. עם זאת, סיבי FN נוצרו על ידי טכניקות אלה מוגבלים לגדלי סיבים ספציפיים וגיאומטריות ומחויבות בדרך כלל למשטח. כאן אנו מתארים הרכבה גישה שמכונה ביוזמת פני השטח (SIA) 20 שמתגברת על מגבלות אלה על ידי ניצול אינטראקציות חלבון פני השטח כדי ליצור nanofibers חופשי עומד מסיס, nanofabrics (גיליונות 2D) ואחרים ננו מורכב מחלבוני ECM בודדים או מרובים (איור 1 ). בעמ &#39;זהrocess, חלבוני ECM הם adsorbed מקונפורמציה קומפקטית, כדורית בפתרון ומפוגל באופן חלקי (פרש) על גבי חותמת בדוגמת, polydimethylsiloxane הידרופובי (PDMS). אז חלבוני ECM מועברים במצב זה על פולי תרמית מגיבים (N-isopropylacrylamide) פני השטח (PIPAAm) באמצעות הדפסת microcontact 22. כאשר hydrated עם מים 40 ° C PIPAAm נותר מוצק, אבל כאשר התקררו 32 מעלות צלזיוס הוא עובר דרך טמפרטורה קריטית נמוך פתרון (LCST) שבו הוא הופך להיות הידרופילי, מתנפח עם מים ולאחר מכן מתמוסס, משחרר ננו ECM התאסף הנחה של על פני השטח. שיטת SIA מספקת שליטה על הממדים עם דיוק בקנה מידה ננומטרי. על ידי שליטה בפרמטרים מרכזיים כמו הרכב, גיאומטריה סיבים, ואדריכלות, אפשר לשחזר מאפיינים רבים של ECM מצאו in vivo ולפתח פיגומים מתקדמים עבור יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.

<table><tbody><tr><td>פולי (N-isopropylacrylamide) / PIPAAm</td><td>Polysciences</td><td>21458-10</td><td>40,000 Mw</td></tr><tr><td>Sylgard 184 ערכת סיליקון (PDMS)</td> <td>Dow Corning</td><td></td><td>Mix 10 חלקים בסיס עם חומר ריפוי חלק אחד.&nbsp;</td></tr><tr><td>בוטנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>BD מדעי הביולוגיה</td><td>354008</td><td>האדם, 1 מ"ג</td></tr><tr><td>למינין</td><td>BD מדעי הביולוגיה</td><td>354239</td><td>אולטרה-טהור, עכבר, 1 מ"ג</td></tr><tr><td>שלילי פוטו-רזיסט</td><td>Microchem</td><td>SU8-2015</td><td></td></tr><tr><td>SU8 מפתח</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator ברנסון M3510</td><td>ברנסון אולטרסאונד קורפוריישן</td><td>CPN-952-318</td><td></td></tr><tr><td>Thinky ARE-250 מיקסר</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spincoater</td><td>מערכות ציפוי מיוחדות</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית בקוטר 25 מ"מ, מס' 1.5</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-545-86</td><td></td></tr></tbody></table>

nanofibers חלבון ecm ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

המטריצה ​​תאית (ECM) ברקמות היא מסונתזת ונאספה על ידי תאים ליצירת סיבי 3D, רשת חלבון עם מוסדר היטב בקוטר סיבים, קומפוזיציה וארגון. בנוסף למתן תמיכה מבנית, התכונות הפיסיקליות וכימיות של ECM לשחק תפקיד חשוב בתהליכים תאיים רבים, כולל הידבקות, בידול, ואפופטוזיס. בvivo, ECM מורכב על ידי חשיפת הרכבה עצמית הנסתרת אתרים (fibrillogenesis) בתוך חלבונים . תהליך זה משתנה לחלבונים שונים, אבל fibrillogenesis פיברונקטין (FN) מאופיין היטב ומשמש כמערכת מודל להרכבת ECM תא בתיווך. באופן ספציפי, תאים משתמשים בקולטנים integrin על קרום התא כדי לאגד הדימרים FN וכוחות התכווצות-actomyosin נוצר כדי להתפתח ולחשוף את אתרי קישור להרכבה לסיבים לא מסיסים. תהליך בתיווך קולטן זה מאפשר לתאים כדי להרכיב ולארגן ECM מהסלולרי לSCA רקמהles. כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה מכונה ביוזמת פני השטח (SIA), אשר משחזרת הרכבה מטריצת תא בתיווך באמצעות אינטראקציות חלבון פני השטח כדי להתפתח חלבוני ECM ולהרכיב אותם לסיבים לא מסיסים. ראשית, חלבוני ECM הם על adsorbed polydimethylsiloxane הידרופובי פני השטח (PDMS) שבו הם לפגל באופן חלקי (unfold) ולחשוף תחומים המחייבים נסתרים. אז חלבוני פרש מועברים במייקרו וnanopatterns המוגדרים היטב באמצעות הדפסת microcontact על פולי תרמית מגיבים (N-isopropylacrylamide) פני השטח (PIPAAm). פירוק תרמי-מופעל של PIPAAm מוביל להרכבה ושחרורו של nanofibers מסיס חלבון ECM וננו בגיאומטריות מוגדרות היטב סופיים. ארכיטקטורות מורכבות אפשריות על ידי דפוסים הנדסיים מוגדר על בולי PDMS המשמשים להדפסת microcontact. בנוסף לFN, תהליך SIA ניתן להשתמש עם laminin, פיברינוגן וcollagens להקליד אני ורביעי כדי ליצור nanostruc ECM מרובה רכיביםטורס. לפיכך, SIA יכול לשמש מהנדס חומרים מבוסס חלבון ECM עם שליטה מדויקת על הרכב חלבון, סיבי הגיאומטריה ואדריכלות פיגום על מנת לשחזר את המבנה והרכב של ECM in vivo.

SIA מסוגל nanofibers חלבון ECM ההנדסה עם שליטה מדויקת ממדי סיבים. כדי להמחיש זאת, מערכים של nanofibers FN עם ממדים מישוריים של 50 x 20 מיקרומטר היו בדוגמת על coverslip PIPAAm המצופה (איור 2 א). עם השחרור, הסיבים התכווצו בגלל שהם היו מתחת לפני מתח טבוע כאשר בדוגמת על פני השטח PIPAAm (איור 2). ניתוח של nanofibers FN גילה הם היו טרום שחרור monodisperse עם אורך ממוצע של 50.19 ± 0.49 מיקרומטר ורוחב של 19.98 ± 0.17 מיקרומטר (איור 2 ג). ...

שיטה להשיג nanofibers וננו המורכב מחלבונים מטריצת חוץ תאיים בודדים או מרובים מתוארת. שיטה זו משתמשת באינטראקציות חלבון פני השטח כדי ליצור חומרים המבוססים על חלבונים חופשיים עומדים עם הרכב מתכונן וארכיטקטורה לשימוש במגוון רחב של יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.

Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להנדס ננו-סיבים עצמאיים, ננו-מבנים ומטריצות דו-ממדיות (2D) מחלבון בודד או ממספר חלבונים של המטריצה החוץ-תאית באמצעות הרכבה שמתחילה מהפני השטח. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת חותמות פולי-דימתילסילוקסן (PDMS), באמצעות מזיגה של פרה-פולימר PDMS על תבנית מאסטר בעלת דפוס טופוגרפי והמתנה להקשחתו. השלב השני הוא גזירת חותמות ה-PDMS המוקשחות וציפוין בתמיסה המכילה את חלבוני המטריצה החוץ-תאית הרצויים.בשלב הבא, שוטפים ומייבשים את החותמות, ומבצעים הדפסת מיקרו-מגע (micro contact printing) על זכוכית מצופה poly N iso propyl acrylamide, או pNIPAM. השלב הסופי הוא הידרציה של הזכוכית באמצעות מים דה-יוניים חמים בטמפרטורה של 40 °C, תוך מתן אפשרות לקירור הדרגתי של התמיסה. ירידת הטמפרטורה אל מתחת לכ-32 °C גורמת להמסה של שכבת ה-pNIPAM הרגישה תרמית ולשחרור של ננו-סיבי חלבון או ננו-מבנים שהורכבו.בסופו של דבר, הננו-סיבים והננו-מבנים המורכבים הם עצמאיים (freestanding) בתמיסה, כפי שאושר באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה ו/או פלואורסצנציה, וניתן להשתמש בהם ביישומים נוספים כגון פיגומים להנדסת רקמות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון הפרדת פנים או אלקטרו-ספינינג, הוא היכולת להנדס ננו-סיבים של חלבוני ECM באמצעות טכניקה המדמה נאמנה את האופן שבו תאים בונים בדרך כלל סיב

ecm-protein-nanofibers-nanostructures-engineered-using-surface

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

גישה יעילה להכנת nanofibers מעוטר בקבוצות המסוגלים אינטראקציה ספציפית עם חלבונים תפקודיות מתוארת. הגישה דורשת 1 הכנת פולימרים פונקציונליים עם הקבוצה הפונקציונלית המתאימה. הפולימרים הפונקציונליים הם מפוברקים לnanofibers ידי electrospinning. היעילות של הכריכה של nanofibers עם חלבון ונלמדת על ידי מיקרוסקופיה confocal.

הליך לבודת Nanofibers Biofunctional

מאמר זה מתאר את היווצרותם של מבנים מבוססי פפטיד הורה מאוד על ידי התהליך הספונטני של הרכבה עצמית. השיטה מנצלת פפטידים זמינים מסחרי וציוד מעבדה משותפת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של פפטידים ועשויה להוביל לגילוי של מכלולים המבוסס על פפטיד חדשים.

היווצרות של מבני Biomolecular הוזמנו על ידי ההרכבה העצמית של פפטידים קצרים

משטחי אי ים ננומטריים המורכבים מקופולימרים בלוקים מגיבים תרמית יוצרו בשיטת Langmuir-Schaefer לבקרת הידבקות וניתוק ספונטניים של תאים. הודגמו הן הכנת המשטח והן הידבקות וניתוק התאים על פני השטח.

הכנת Thermoresponsive Nanostructured משטחי הנדסת רקמות

העבודה הנוכחית מתאר שיטה כדי לפברק nanocrystals micellar, שיעור העיקריים המתעוררים של nanobiomaterials. שיטה זו משלבת ספקטרומטריית electrospray מלמעלה, מלמטה למעלה הרכבה עצמית, ובקרת מבנה ממס מבוסס. שיטת ייצור רציפה במידה רבה, יכול לייצר מוצרים באיכות גבוהה, הנו אמצעי זול של מבנה השליטה.

ייצור של כדוריות, בצורת תולעת Nanocrystals Micellar על-ידי שילוב ספקטרומטריית Electrospray, הרכבה עצמית ובקרת מבנה ממס מבוסס

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה מפורט כדי להכין מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) עבור תפוקה גבוהה מניפולציה גופנית, כימית רמזים היה שווה ויוו הסלולר microenvironments וכדי זיהוי הסביבה התאית אופטימלית עבור תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) עם פרופיל תא בודד.

ייצור של מערך מרובבת MicroEnvironment הסלולר מלאכותי

הציג היא שיטה קלה ליצור ננו-micro מבני multiscale, תפקודי משטחים, על-ידי צבירה nanofibers מפוברק באמצעות מסנן אנודי אלומיניום אוקסיד.

מבנים multiscale המצטברים על-ידי Nanofibers המוטבע על תפקודי משטחים

בממשק של ממיסים אורגניים ומימית, מותאם המותאם לאלסטין וחלבונים בעלי מבנה מולקולרי מורכבים כגון שלפוחיות, סיבים ומדבקות מופעלות על ידי פרמטרים סביבתיים. פרוטוקולי ההרכבה המתוארים מניבים תאים מבוססי חלבון ממברנה (PMBCs) עם מאפיינים שניתן לסמוך עליהם, המאפשרים כימוס של מטענים שונים.

בימוי האסיפה של אלסטין כמו חלבונים לתוך הגדרת מבנים Supraולקולריים מוגדרים מחוץ לגופית

מטרת פרוטוקול זה היא להראות את ההרכבה של ננומטריקס ביומימטי (NM) עם צינוריות בסיס יאנוס (JBNTs) ו fibronectin (FN). כאשר הם מתרבים במשותף עם תאי גזע mesenchymal אנושי (hMSCs), NMs להפגין ביואקטיביות מעולה בעידוד הידבקות hMSCs.

ייצור ננו-מטריקס ביומימטי עם צינורות בסיס יאנוס ופיברונקטין להדבקת תאי גזע

פרוטוקול זה נועד להעריך פפטידים ביו-פונקציונליים להרכבה עצמית עבור הידבקות תאים, מורפולוגיה אורגנואידית וביטוי גנים על ידי אימונוסטיין. אנו נשתמש בקו תאי סרטן המעי הגס כדי לספק דרך חסכונית להשגת אורגנואידים לבדיקות אינטנסיביות.

ייצור ואפיון אורגנואידים מסרטן המעי הגס SW1222 בקו תאים במטריצת פפטיד אולטרה-קצרה להרכבה עצמית

תוספות תרבית רקמה עם ממברנות פלסטיק הן תקן הזהב במעבדות תרביות תאים כתומכות חדירות לביסוס שכבות תאים ומודלים של רקמות מחסום. במאמר זה אנו מציגים שיטה פשוטה להחלפת קרום הפלסטיק בקרום רלוונטי יותר מבחינה ביולוגית העשוי מחלבון משי עכביש רקומביננטי מתפקד.

חיקוי קרום מרתף ננופיברילרי עשוי ממשי עכביש פונקציונלי רקומביננטי בתוספות תרבית רקמה בהתאמה אישית

הפרוטוקול הבא מציג שיטת שחול מבוססת גזירה לייצור הידרוג'לים של קולגן עם סיבים בדוגמת ננומטר, הניתנת ליישום במגוון רחב של יישומי הנדסת רקמות.

ייצור קולגן בדוגמת ננו-פיברילר להנדסת רקמות

למדו ליצור ננו סיבים ומבנים מורכבים מחלבוני מטריצה חוץ-תאית באמצעות הרכבה מונעת פני שטח. השיטה מאפשרת שליטה בתכונות החומר להנדסת רקמות וביוטכנולוגיה.

Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

גלה סרטונים נוספים