Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להנדס ננו-סיבים עצמאיים, ננו-מבנים ומטריצות דו-ממדיות (2D) מחלבון בודד או ממספר חלבונים של המטריצה החוץ-תאית באמצעות הרכבה שמתחילה מהפני השטח. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת חותמות פולי-דימתילסילוקסן (PDMS), באמצעות מזיגה של פרה-פולימר PDMS על תבנית מאסטר בעלת דפוס טופוגרפי והמתנה להקשחתו. השלב השני הוא גזירת חותמות ה-PDMS המוקשחות וציפוין בתמיסה המכילה את חלבוני המטריצה החוץ-תאית הרצויים.

בשלב הבא, שוטפים ומייבשים את החותמות, ומבצעים הדפסת מיקרו-מגע (micro contact printing) על זכוכית מצופה poly N iso propyl acrylamide, או pNIPAM. השלב הסופי הוא הידרציה של הזכוכית באמצעות מים דה-יוניים חמים בטמפרטורה של 40 °C, תוך מתן אפשרות לקירור הדרגתי של התמיסה. ירידת הטמפרטורה אל מתחת לכ-32 °C גורמת להמסה של שכבת ה-pNIPAM הרגישה תרמית ולשחרור של ננו-סיבי חלבון או ננו-מבנים שהורכבו.

בסופו של דבר, הננו-סיבים והננו-מבנים המורכבים הם עצמאיים (freestanding) בתמיסה, כפי שאושר באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה ו/או פלואורסצנציה, וניתן להשתמש בהם ביישומים נוספים כגון פיגומים להנדסת רקמות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון הפרדת פנים או אלקטרו-ספינינג, הוא היכולת להנדס ננו-סיבים של חלבוני ECM באמצעות טכניקה המדמה נאמנה את האופן שבו תאים בונים בדרך כלל סיבי ECM in vivo. לטכניקת ההרכבה ביוזמה מהשטח יש מספר יתרונות ייחודיים, כולל היכולת לשלוט בהרכב החלבונים, במורפולוגיית הסיבים ובארכיטקטורת הפיגום.

בנוסף, ניתן להנדס ננו-סיבים של חלבוני ECM מחלבוני מטריצה חוץ-תאית כגון פיברנקטין, למינאן וקולגן מסוג IV, דבר שהוכיח את עצמו כקשה לביצוע באמצעות סוגים אחרים של שיטות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנדסת הרקמות על ידי מתן אפשרות לחוקרים לפתח מבנים בעלי רמזים פיזיקליים וכימיים ספציפיים ומוגדרים היטב, כדי להנחות מגוון של התנהגויות תאיות כגון היצמדות ודיפרנציאציה. אם אתם חדשים בטכניקה זו, עליכם לזכור לבדוק באופן רציף את איכות השבב שלכם ואת הדיוק של תבניות ההדפסה במיקרו-מגע (micro contact printed patterns).

שלב זה חיוני כדי להשיג הרכבה נאותה של ננו-סיבי ומבני ננו של ה-ECM. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את הפולי-דימתילסילוקסאן או PDMS pre-polymer על ידי ערבוב בסיס האלסטומר וחומר המקשה ביחס משקלי של 10 ל-1; בדרך כלל נעשה שימוש ב-80 גרם בסיס ושמונה גרם חומר מקשה כדי להבטיח שיהיה מספיק PDMS לכיסוי תבנית המאסטר בשכבה בעובי של 1 סנטימטר. ערבבו ובצעו Degassing ל-PDMS באמצעות מיקסר צנטריפוגלי המוגדר לערבוב ב-2000 RPM למשך שתי דקות, ולאחר מכן Degassing ב-2000 RPM למשך שתי דקות. שפכו בזהירות.

שופכים PDMS pre polymer על תבנית המאסטר כדי ליצור שכבה בעובי של סנטימטר אחד; לאחר מכן מקבעים את ה-PDMS על ידי אפייה בטמפרטורה של 65 °C למשך ארבע שעות. לאחר ההקשחה, משתמשים בסכין מנתח (scalpel) כדי לחתוך את האזור המכיל את התבנית ליצירת חותמת ה-PDMS. זאת כדי להבדיל בין צד התבנית לבין הצד האחורי של חותמת ה-PDMS.

גזרו חריץ מאחת הפינות בחלקו האחורי של הבול. התחילו את ההליך בניקוי של לביבות זכוכית בקוטר 25 מילימטר, בצעו סוניקציה ללביבות ב-95% ethanol למשך שעה אחת, ולאחר מכן ייבשו אותן בתנור בטמפרטורה של 65 degrees celsius. לאחר מכן, הכינו את תמיסת ה-poly and isopropyl acrylamide או piam על ידי המסת piam ב-1-butanol בריכוז של 10%. מרכזו לביבת זכוכית נקייה על ידיקת הוואקום של ה-spin coater והעבירו בפיפט 200 microliters של תמיסת ה-piam אל פני השטח של הזכוכית כדי לכסות את כל השטח.

בצעו ציפוי ספין (Spin coat) לזכוכית הכיסוי במהירות של 6,000 RPM למשך דקה אחת. נקו את חותמות ה-PDMS באמצעות סוניקציה ב-50% ethanol למשך 30 דקות, ולאחר מכן ייבשו תחת זרם של חנקן; את שלב הייבוש וכל השלבים הבאים יש לבצע בתוך מabilis בטיחות ביולוגית כדי לשמור על סטריליות ביישומים שבהם מבני ננו של המטריצה החוץ-תאית או ה-ECM ישמשו עם תאים. שלב ההדפסה במיקרו-מגע (micro contact printing) הוא ההיבט המאתגר ביותר של פרוצדורה זו.

חשוב לבחון את חותמות ה-PDMS לאיתור פגמים גלויים לפני השימוש. כמו כן, אין להשתמש בתמיסת חלבון שגילה עולה על שבועיים. הנח את הלוחיות המכוסות ב-PIAM בתוך צלחת פטרי סגורה ועקר אותן באמצעות חשיפה ל-UV.

45 דקות תחת אור UV בתוך קבלית בטיחות ביולוגית מספיקות. יש לצפות את משטח התבנית של כל חותמת PDMS ב-200 µL של תמיסת החלבון. כאן נעשה שימוש ב-Fibronectin או FN בריכוז של 50 µg/mL במים מזוקקים סטריליים.

דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר; לאחר שעה, שטפו את חותמות ה-PDMS במים מזוקקים כדי להסיר עודפי חלבון ויבשו ביסודיות תחת זרם חנקן. חשוב להסיר את המים לחלוטין כדי למנוע התמוססות מוקדמת של הצינור. ציפוי Pam על לבישוב (cover slip) והעברה לא תקינה של חלבון.

בצעו הדפסה במיקרו-מגע (micro contact printing) על ידי הצמדת הצד הפעיל של חותמת ה-PDMS ללוחית כיסוי מצופה ב-PAM של צינור, במידת הצורך. השתמשו בפינצטה כדי להקיש קלות על גב החותמות להסרת בועות אוויר ולהבטחת מגע אחיד לאחר חמש דקות. קלפו את חותמת ה-PDMS מלוחית הכיסוי.

בשלב זה, בהתאם למחקר, ניתן להדפיס תבניות של חלבוני ECM נוספים כדי ליצור מבנים מורכבים ורב-מרכיביים יותר. לאחר הדפסת תבנית ה-ECM, הנח את לבישת הזכוכית המצופה ב-PAM עם תבנית הצינור בתוך צלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר ובדוק את נאמנות התבנית באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.

בהתאם לתבנית, ייתכן שיהיה צורך במצלמת CCD כדי להבחין במאפייני התבנית. ניתן להשתמש גם במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לבדיקת התבנית, בתנאי שחלבוני ה-ECM מסומנים פלואורסצנטית. לאחר אימות נאמנות התבנית, הוסיפו שלוש מיליליטר של מים מזוקקים בטמפרטורה של 40 °C לצלחת הפטרי והניחו למים לקרר בהדרגה את המסה של הצינור.

ניתן לנטר את שכבת ה-PAM ואת שחרור תבניות חלבוני ה-ECM באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (phase contrast microscopy). בדרך כלל, כדי להבטיח שמיקרו-מבני חלבוני ה-ECM שוחררו, מקרירים את המים לטמפרטורת החדר, שהיא נמוכה משמעותית מטמפרטורת התמיסה הקריטית התחתונה (LCST) של pam, שהיא 32 °C. אם היישום אינו מאפשר שימוש בטכניקות אופטיות, ניתן לנטר את השחרור על ידי מדידת טמפרטורת התמיסה.

סיבי ננו ומבני ננו אחרים יצופו במים לאחר שחרור שכבת ה-PAM של הצינור. עבור יישומים נוספים, יש צורך במניפולציה של בדי ננו ומבני ננו אחרים, אך הגישה המדויקת תלויה במטרת הניסוי. תוצאות מייצגות מוצגות כאן כדי להדגים שהרכבה שיוקרה מהפני השטח (SIA) מסוגלת להנדס סיבי ננו של חלבוני ECM תוך שליטה מדויקת בממדי הסיבים.

מערך של מלבני פיברונקטין, באורך 50 micrometers וברוחב 20 micrometers, דוגם על לבישת כיסוי מצופה piam; הוספה של מים מזוקקים (DI water) בטמפרטורה של 40 degrees Celsius וקירור עוקב מתחת לטמפרטורת התמיסה הקריטית הנמוכה של piam הובילו להמסה של ה-piam ולשחרור של ננו-סיבי פיברואין. הסיבים התכווצו כיוון שהיו תחת מאמץ מוקדם (prestress) טבעי.

ניתוח של ממדי ננו-סיבי הפיברונקטין כאשר הם תבניתיים על פני השטח של ה-piam לפני השחרור, גילה שהם היו מונו-דיספרסיביים עם אורך ממוצע של 50.19 ± 0.49 µm ורוחב ממוצע של 19.98 ± 0.17 µm. עם השחרור, הננו-סיבים התכווצו באופן ניכר אך נותרו מונו-דיספרסיביים עם אורך ממוצע של 14.15 ± 0.92 µm ורוחב ממוצע של 2.65 ± 0.32 µm. מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) סיפקה פרספקטיבה ברזולוציה גבוהה יותר של השינויים הממדיים בסיבים הקשורים לתהליך השחרור של ה-SIA.

ראוי לציין כי לסיבים טרם השחרור היה עובי אחיד של כ-five nanometers, בעוד שלסיבים לאחר השחרור היה עובי בסדר גודל של כמה מאות nanometers, בעוד שהאורך והרוחב פחתו. באמצעות תהליך ה-SIA, ניתן להנדס מגוון של ננו-מבני חלבוני ECM בעלי גודל, צורה והרכב הניתנים לכיוונון. לדוגמה, ננו-סיבי fibronectin שבמקור היו ברוחב 20 micrometers ובאורך one centimeter, תוכננו בתבנית על גבי צינור.

לוחית כיסוי מצופה ב-PAM לאחר קירור ושטיפה. עם התמוססות ה-Pam, השחררו הסיבים הננומטריים ויצרו חוטים ארוכים ברוחב מצומצם של כ-three micrometers. יתרה מכך, מכיוון שהתבנית מוגדרת על ידי טופוגרפיית הפני surface של חותמת ה-PDMS ששימשה להדפסת מיקרו-מגע (micro contact printing), ניתן להנדס ננו-מבנים מורכבים של חלבוני ECM כהוכחה לקונספט.

נוצרו כוכבי פיברואין רב-זרועות. שחרור תרמי הוביל להתכווצות הזרועות, אך לא של האזור המרכזי של הכוכב שבו הזרועות התחברו זו לזו. SIA פועל גם עם חלבוני ECM אחרים כגון למינאן או LN, וניתן לשלב מספר חלבוני ECM באותו מבנה.

בדוגמה זו, קווים ניצבים ומקושרים של פיברונקטין ברוחב 20 מיקרומטר המוצגים באדום וקווים של למינין ברוחב 50 מיקרומטר המוצגים בירוק ששולבו בתוך בד ננו-דו-ממדי (2D nano fabric) תוכננו ואז שוחררו; עם השחרור, שני סוגי הננו-סיבים התכווצו, אך הקישוריות הכללית ומבנה הסריג הריבועי נשמרו. תוצאות אלו מדגימות כי ניתן להשתמש ב-SIA כדי להנדס חומרי ECM במגוון הרכבים ומבנים. לבסוף, מוצגים מספר מקרים של SIA שנכשל של ננו-סיבי ECM.

סיבה אחת היא שחרור לא תקין של תבנית חלקית עקב העברה לקויה של חלבון ECM למשטח ה-piam. במהלך הדפסה במגע מיקרוסקופי (micro contact printing), נוכחות של חורים, קצוות לא סדירים ופגמים אחרים תגרום ליצירת סיבי ננו ומבני ננו שאינם שלמים ונוטים לשבירה ולפרגמנטציה בעת השחרור. המסה מהירה של pipe PAM עלולה לגרום גם היא לנאמנות תבנית (pattern fidelity) לקויה לאחר השחרור.

לדוגמה, שימוש במים בטמפרטורה של 20 degrees Celsius, טמפרטורה הנמוכה כבר מהטמפרטורה הקריטית התחתונה של התמיסה. טמפרטורה של piam תגרום ל-piam להתנפח ולהימס במהירות. דבר זה עלול לגרום לננו-סיבים להיסוג בבת אחת ולהישבר כפי שמוצג בתמונה ה-32, וליצור תצורות אקראיות ובלתי מאורגנות כפי שמוצג בתמונה של השנייה ה-52.

לפני תחילת הליך זה, יש לבדוק את תקינות גבעולי ה-PDMS לאיתור פגמים וכן לוודא שכל המשטחים נקיים מאבק. אחרת, הדבר ימנע העברה תקינה של חלבונים ויוביל להרכבה לקויה של מבני ה-A CM. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להשתמש בננו-סיבים או בננו-מבנים ששוחררו למספר מטרות, כגון ניתוח תכונות מכניות של סיבי החלבון, או כפיגומים להנדסת רקמות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן הנדסת ננו-סיבים וננו-מבנים של חלבוני ECM בעלי הרכב, גאומטריה וארכיטקטורה ניתנים לכיוונון. באופן ספציפי, תבינו כיצד לבצע הדפסת מיקרו-מגע (micro contact print) של תבניות חלבוני ECM על לבישי זכוכית מצופים בפיתון, ולאחר מכן להפעיל טריגר תרמי להמסת השטח כדי להרכיב את מבני ה-ECM.