Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

המטרה הכוללת של הליך זה היא להנדס סיבי ננו, ננו-מבנים ומטריצות דו-ממדיות עצמאיות מחלבוני מטריצה חוץ-תאיים בודדים או מרובים באמצעות הרכבה יזומה על פני השטח. זה מושג על ידי הכנת חותמות פולי דימתיל סואן או PDMS על ידי יציקת הפולימר הקדם-PDMS על תבנית מאסטר בדוגמה טופוגרפית ומתן אפשרות להתרפא. השלב השני הוא לגזור את חותמות ה-PDMS שנרפאו ולצפות אותן בתמיסה המכילה את חלבוני המטריצה החוץ-תאיים הרצויים.

לאחר מכן, החותמות נשטפות, מיובשות ומודפסות מיקרו מגע על פולי N איזו פרופיל אקרילאמיד, או תלוש כיסוי זכוכית מצופה PAM בצינור. השלב האחרון הוא להרטיב את החלקת הכיסוי במים חמים נטולי יונים של 40 מעלות צלזיוס ולאפשר לו להתקרר בהדרגה, הפחתת התמיסה. טמפרטורה מתחת לכ-32 מעלות צלזיוס מפעילה את פירוק שכבת ה-PAM של הצינור הרגיש תרמית ושחרור של סיבי ננו חלבון מורכבים או מבני ננו.

בסופו של דבר, סיבי הננו המורכבים ומבני הננו עומדים בפני עצמם בתמיסה כפי שאושר על ידי ניגודיות פאזה ו/או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, וניתן להשתמש בהם ביישומים נוספים כגון פיגומי הנדסת רקמות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון הפרדת פנים או ספינינג אלקטרו, הוא היכולת להנדס ננו סיבי חלבון ECM באמצעות טכניקה שבאמת מחקה את האופן שבו תאים בדרך כלל בונים סיבי ECM in vivo. לטכניקת ההרכבה היזומה על פני השטח יש מספר יתרונות ייחודיים, כולל היכולת לשלוט בהרכב החלבון, מורפולוגיה של סיבים וארכיטקטורת פיגומים.

יתר על כן, אנו יכולים להנדס ננו-סיבי חלבון ECM מחלבוני מטריצה חוץ-תאיים כגון למינציה של סיבים נין וקולגן מסוג ארבע, שהוכח כקשה בסוגים אחרים של שיטות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת הרקמות בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לפתח מבנים עם רמזים פיזיקליים וכימיים ספציפיים ומוגדרים היטב כדי לכוון מגוון התנהגויות תאים כגון הידבקות והתמיינות. אם אתה חדש בטכניקה זו, עליך לזכור לבדוק באופן רציף את איכות הגבעולים שלך כמו גם את הנאמנות של הדפוסים המודפסים במיקרו מגע.

זה חיוני כדי להשיג הרכבה נכונה של סיבי הננו והננו-מבנים של ECM. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את הפולי דימתיל סואן או הפולימר הקדם-פולימרי PDMS על ידי שילוב של בסיס האלסטומר וחומר הריפוי ביחס של 10 למשקל למשקל, בדרך כלל משתמשים ב-80 גרם בסיס ושמונה גרם של חומר ריפוי כדי להבטיח שיש מספיק PDMS כדי לכסות את תבנית המאסטר בתערובת שכבות בעובי סנטימטר אחד ו-DGAs את ה-PDMS באמצעות מערבל צנטריפטלי המוגדר לתערובת הבאה ב 2000 סל"ד לשתי דקות, DGAs ב-2000 סל"ד לשתי דקות. גרוע מספיק.

PDMS מראש פולימר מעל תבנית המאסטר ליצירת שכבה בעובי סנטימטר אחד כאן, ה-PDMS על ידי אפייה ב-65 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר הריפוי, השתמש באזמל כדי לחתוך את האזור המכיל את התבנית ליצירת חותמת PDMS. כדי להבחין בין צד התכונה לבין הצד האחורי של חותמת ה-PDMS.

חותכים חריץ מאחת הפינות בצד האחורי של הבול. התחל הליך זה על ידי ניקוי החלקות כיסוי הזכוכית בקוטר 25 מילימטר, סוניקציה של החלקות הכיסוי באתנול 95% למשך שעה, ולאחר מכן יבש אותן בתנור של 65 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הפולי והאיזופרופיל אקרילאמיד או פיאם ממיסים פיאם בבוטנול אחד בריכוז של 10% מרכז כיסוי זכוכית נקי מחליק על צ'אק הוואקום של הסיבוב ופיפטה 200 מיקרוליטר של תמיסת הצינור פאם על משטח הזכוכית כדי לכסות את פני השטח לחלוטין.

סובב את החלקת הכיסוי ב-6,000 סל"ד למשך דקה אחת. נקה את חותמות ה-PDMS על ידי סוניקציה באתנול 50% למשך 30 דקות, ולאחר מכן ייבוש תחת זרם של ייבוש חנקן ויש לבצע את כל השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על סטריליות ליישומים שבהם המטריצה החוץ-תאית או מבני ננו ECM ישמשו עם תאים. שלב הדפסת המיקרו מגע הוא ההיבט הקשה ביותר בהליך זה.

חשוב לבדוק את חותמות ה-PDMS לאיתור פגמים גלויים לפני השימוש. כמו כן, אל תשתמש בתמיסת חלבון שגילם עולה על שבועיים מקום. הכיסוי המצופה PIAM מחליק לתוך צלחת פטרי סגורה ועובר סטריליזציה באמצעות חשיפה לקרינת UV.

45 דקות מתחת לאור ה-UV בארון בטיחות ביולוגית מספיקות. מצפים את משטח התבנית של כל חותמת PDMS ב-200 מיקרוליטר של תמיסת החלבון. פיברונקטין או FN משמשים כאן בריכוז של 50 מיקרוגרם למיליליטר במים מזוקקים סטריליים.

יש לדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר לאחר שעה לשטוף את חותמות ה-PDMS והמים המזוקקים כדי להסיר עודפי חלבון ולייבש היטב תחת זרם חנקן. חשוב להסיר את המים לחלוטין כדי למנוע פירוק מוקדם של הצינור. ציפוי פאם על החלקת הכיסוי והעברת חלבון לא תקינה.

בצע הדפסת מיקרו-מגע על ידי הנחת צד התכונה של חותמת ה-PDMS במגע עם פתק הכיסוי המצופה PAM של הצינור במידת הצורך. השתמש במלקחיים כדי להקיש קלות על גב החותמות כדי להסיר בועות אוויר ולהבטיח מגע אחיד לאחר חמש דקות. קלף את חותמת ה-PDMS מתלוש הכיסוי.

בשלב זה. בהתאם למחקר, ניתן לעצב חלבוני ECM נוספים ליצירת מבנים מורכבים ורב-רכיביים יותר. לאחר הדפסת דפוס ה-ECM, הנח את החלקת הכיסוי המצופה PAM של הצינור המעוצב בצלחת פטרי של 35 מילימטר ובדוק את נאמנות התבנית באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.

בהתאם לתבנית, ייתכן שיהיה צורך במצלמת CCD כדי לפתור את תכונות התבנית. ניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי גם כדי לבדוק את הדפוס בתנאי שחלבוני ה-ECM מסומנים באופן פלואורסצנטי. לאחר אימות נאמנות הדפוס, הוסף שלושה מיליליטר של 40 מעלות צלזיוס מים מזוקקים לצלחת הפטרי ואפשר למים לקרר בהדרגה את פירוק הצינור.

ניתן לנטר את שכבת ה-PAM ואת שחרור דפוסי החלבון ECM באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. בדרך כלל כדי להבטיח את שחרור ננו-מבני חלבון ה-ECM, המים מקוררים לטמפרטורת החדר הרבה מתחת לטמפרטורת התמיסה הקריטית הנמוכה יותר של הצינור, pam, שהיא 32 מעלות צלזיוס. אם היישום אינו מאפשר שימוש בטכניקות אופטיות, ניתן לעקוב אחר השחרור על ידי מדידת טמפרטורת התמיסה.

סיבי ננו ומבני ננו אחרים יצופו במים לאחר שחרור שכבת ה-PAM של הצינור. ליישומים נוספים, יש לתפעל את בדי הננו ומבני ננו אחרים, אך הגישה המדויקת תהיה תלויה במטרת הניסוי. תוצאות מייצגות מוצגות כאן כדי להוכיח כי הרכבה יזומה על פני השטח או SIA מסוגלת להנדס ננו-סיבי חלבון ECM עם שליטה מדויקת על מידות הסיבים.

מערך של מלבני פיברונקטין באורך 50 מיקרומטר ורוחב 20 מיקרומטר עוצבו על גבי תוספת החלקה של 40 מעלות צלזיוס DI וקירור לאחר מכן מתחת לתמיסה הקריטית התחתונה. טמפרטורת הפיאם גרמה לפירוק הפיאם ולשחרור סיבי הננו פיברואין עם השחרור. הסיבים התכווצו מכיוון שהם היו תחת לחץ מולד.

כאשר דפוס על פני השטח של פיאם, ניתוח אליס של ממדי הננו-סיבים של פיברונקטין לפני השחרור גילה שהם היו פיזור מונו עם אורך ממוצע של 50.19 פלוס מינוס 0.49 מיקרומטר ורוחב ממוצע של 19.98 פלוס מינוס 0.17 מיקרומטר. עם השחרור סיבי הננו התכווצו במידה ניכרת אך נותרו מפוזרים מונו עם אורך ממוצע של 14.15 פלוס מינוס 0.92 מיקרומטר ורוחב ממוצע של 2.65 פלוס מינוס 0.32 מיקרומטר. מיקרוסקופ כוח אטומי סיפק פרספקטיבה ברזולוציה גבוהה יותר של השינויים בממדי הסיבים הקשורים לתהליך שחרור ה-SIA.

יש לציין כי לסיבים לפני השחרור היה עובי אחיד של כחמישה ננומטרים, בעוד שלסיבים לאחר השחרור היה עובי בסדר גודל של כמה מאות ננומטר בעוד שהאורך והרוחב פחתו. באמצעות תהליך SIA, ניתן להנדס מגוון של ננו-מבנים של חלבון ECM עם גודל, צורה והרכב ניתנים לכוונון. לדוגמה, סיבי ננו פיברונקטין בתחילה ברוחב של 20 מיקרומטר ואורך של סנטימטר אחד עוצבו על גבי צינור.

כיסוי מצופה PAM מחליק בעת הקירור והצינור. פירוק פאם, סיבי הננו שוחררו ויצרו חוטים ארוכים ברוחב מופחת של כשלושה מיקרומטרים. יתר על כן, מכיוון שהתבנית מוגדרת על ידי טופוגרפיית פני השטח של חותמת ה-PDMS המשמשת להדפסת מיקרו-מגע, ניתן להנדס ננו-מבנים מורכבים של חלבון ECM כהוכחת רעיון.

נוצרו כוכבי פיברואין מרובי זרועות. שחרור תרמי הביא להתכווצות הזרועות, אך לא לאזור המרכזי של הכוכב שבו הזרועות התחברו זו לזו. SIA עובד גם עם חלבוני ECM אחרים כגון למינציה או LN, וניתן לשלב מספר חלבוני ECM באותו מבנה.

בדוגמה זו, קווים אורתוגונליים מחוברים זה לזה, ברוחב 20 מיקרומטר של פיברונקטין המוצגים באדום וקווי למינין ברוחב 50 מיקרומטר המוצגים בירוק משולבים בבד ננו דו-ממדי עוצבו ולאחר מכן שוחררו עם השחרור שני סוגי סיבי הננו התכווצו, אך הקישוריות הכוללת ומבנה הסריג המרובע נשמרו. תוצאות אלה מדגימות כי ניתן להשתמש ב-SIA כדי להנדס חומרי ECM עם מגוון הרכבים ומבנים. לבסוף, מוצגים כמה מקרים של SIA כושל של סיבי ננו ECM.

סיבה אחת היא שחרור לא תקין של דפוס לא שלם עקב העברה לקויה של חלבון ECM למשטח הפיאם. במהלך הדפסת מיקרו מגע, נוכחותם של חורים, קצוות לא סדירים ופגמים אחרים תיצור ננו-סיבים וננו-מבנים שאינם שלמים ונוטים לשבירה ופיצול עם שחרורם. פירוק מהיר של צינור PAM יכול גם לגרום לנאמנות דפוס ירודה לאחר השחרור.

לדוגמה, שימוש במים של 20 מעלות צלזיוס, טמפרטורה שכבר נמוכה מהתמיסה הקריטית התחתונה. טמפרטורת הפיאם תגרום לפיאם להתנפח במהירות ולהתמוסס. זה יכול לגרום לסיבי הננו להיצמד לאחור ולהישבר כפי שמוצג בתמונה ה-32 וליצור תצורות אקראיות לא מאורגנות כפי שמוצג בתמונה של 52 שניות.

לפני שמתחילים בהליך זה, מצב ה- PDMS נובע מפגמים וגם לוודא שכל המשטחים נקיים מאבק. אחרת, זה ימנע העברת חלבון תקינה ויוביל להרכבה לקויה של מבני A CM. אז בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בסיבי ננו או ננו-מבנים לשחרור כדי לבצע מספר דברים כגון ניתוח תכונות מכניות של סיבי החלבון, או להשתמש בהם כפיגומים להנדסת רקמות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להנדס ננו-סיבים וננו-מבנים של חלבון ECM עם הרכב, גיאומטריה וארכיטקטורה הניתנים לכוונון. באופן ספציפי, תבין כיצד ליצור דפוסי הדפסה מיקרו-מגעים של חלבוני ECM על החלקות כיסוי זכוכית מצופות פיתון, ולאחר מכן להפעיל תרמית את פירוק המשטח כדי להרכיב את מבני ה-ECM.