הרחבת טכניקת תפר באמצעות מצעי nanopatterned עבור Nanotopographical אפנון של התנהגות תא

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר שטח גדול של מצע בעל תבנית ננומטרית מתוך תבניות ננומטריות קטנות, וזאת באמצעות טכניקת תפירה (stitch) פשוטה, משתלמת ורב-גונית. שיטה זו יכולה לסייע בחקר השפעת המודולציה של ננו-טופוגרפיית המצע על הפנוטיפ ותפקוד התאים ברמות התאיות והמולקולריות, כגון ביטוי של חלבוני היצמדות מוקדית (focal adhesion proteins). היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה וחסכונית.

בתחילה, הכינו את תבנית הסיליקון שעברה סילניזציה בתוך הפרה-פולימר של ה-PDMS, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הניחו את תבנית הסיליקון שעברה סילניזציה בתוך צלחת פטרי של 60 millimeter. שפכו את הפרה-פולימר של ה-PDMS על תבנית הסיליקון שבצלחת הפטרי.

הניחו את צלחת הפטרי בתוך דסיקטור פלסטי ובצעו ניקוון אוויר (degas) למשך כ-10 דקות, עד להיעלמות כל הבועות. העבירו את צלחת הפטרי לפלטה מחממת והקשו את הפרה-פולימר של ה-PDMS בטמפרטורה של 70 °C למשך ארבע שעות. קלפו בזהירות את תבנית ה-PDMS מתבנית הסיליקון באמצעות פינצטה.

קבע את הכיוון של תבניות הננו של PDMS אניזוטרופיות, כגון nanogratings, תחת מיקרוסקופ אופטי, וסמן אותו על הצד האחורי של תבניות ה-PDMS באמצעות טוש סימון. נקה את מצע הסיליקון באתנול בתוך מabilis, ולאחר מכן ייבש אותו בעזרת אוויר דחוס. גזור את האזורים ללא התבנית מכל תבנית PDMS באמצעות להב.

יש ליישר את תבניות ה-PDMS קרוב ככל האפשר, אך מבלי שייגעו בתבנית המקיפה אותן, כדי למזער את השטח שאינו תבניתי ולמנוע מגע שעלול לגרום לעיוות של הננו-תבנית בעת הפעלת כוח הדחיסה. מקמו את תבנית ה-PDMS הגזוזה כאשר פני הננו-תבנית פונים כלפי מטה על הצד המראה של מצע הסיליקון, ולאחר מכן יישרו תבניות אחרות קרוב אך מבלי שייגעו בתבניות הסובבות. קריטי לדאוג להשלמת הפולימריזציה (cure) של ה-PDMS בשכבה הבסיסית, כיוון ש-PDMS שלא עבר פולימריזציה עלול לזרום דרך המרווח שבין התבניות השונות ולפגוע בננו-תבניות.

עם זאת, PDMS שהגיע לריפוי מלא אינו יכול להדביק בין מספר תבניות. כדי להכין שכבת דבק PDMS, יש למזוג גרם אחד של פולימר מקדים של PDMS שעבר ניקוז גזים על תגית זכוכית נקייה ליצירת שכבה בעובי 0.5 millimeter. יש לחמם את שכבת ה-PDMS בטמפרטורה של 100 degrees Celsius על פלטה חימום למשך שלוש עד חמש דקות.

השתמשו במחט כדי לגעת בשכבה ולוודאו שהשכבה התקשתה באופן חלקי אך לא מלא. הניחו את שכבת ה-PDMS על הצד האחורי של תבניות ה-PDMS המיושרות, הפכו במהירות את המבנה הזה, והעבירו אותו לפלטה החימום. הפילו כוח לחיצה באמצעות בלוק מתכת שיונח מעל המבנה כדי להבטיח מגע טוב בין שכבת הדבק של ה-PDMS לבין הצד האחורי של תבניות ה-PDMS.

בצע פולימריזציה (Cure) של שכבת הדבק PDMS בטמפרטורה של 100 °C למשך שעה אחת. כבה את הפלטה החימומית, הסר את גוש המתכת, וקלף את תבנית ה-PDMS בעלת התפר הבודד מהמצע הסיליקוני. כדי לבצע הדפסת ננו (nanoimprint) של תבנית ה-PDMS עם התפרים אל תוך לוח ה-PS, הנח את לוח ה-PS במרווח אלומיניום המונח על פרוסת סיליקון של 3 אינץ'.

חממו את פלטת ה-PS על פלטה מחממת בטמפרטורה של 250 degrees Celsius למשך 30 דקות. לאחר מכן, הניחו את תבנית ה-PDMS התפורה, כאשר הננו-תבניות פונות כלפי מטה, על פלטת ה-PS המותכת. לאחר מכן, הניחו פלטת אלומיניום על תגית הזכוכית של תבנית ה-PDMS התפורה.

הפעל לחץ דחיסה באמצעות בלוקים של מתכת על לוח האלומיניום, והמתן שלוש דקות. הרם והסר את בלוק המתכת מלוח האלומיניום, והעלה את לחץ הדחיסה ל-25 kilopascals. לאחר מכן, חזור על שלב זה כאשר הלחץ מועלה ל-50 kilopascals.

שמרו על טמפרטורת הפלטה החמה בין 240 ל-250 מעלות צלזיוס תחת לחץ עקבי של 50 kilopascals למשך 15 דקות. כבו את הפלטה החמה וקררו את כל המערך. הסירו את הבלוקים המתכתיים לאחר שהטמפרטורה ירדה מתחת ל-50 מעלות צלזיוס, וקלפו בזהירות את תבנית ה-PDMS התפורה מלוח ה-PS.

כדי לבצע ננו-הדפסה (nanoimprint) של תבנית ה-PDMS על סרט דק של PS, הניחו את תבנית ה-PDMS המחוברת עם פני הננו-טופוגרפיה כלפי מטה על סרט ה-PS הדק, המונח על פלטה חמה. הפילו לחץ דחיסה של 12 kilopascals על תבנית ה-PDMS באמצעות בלוקים של מתכת על גבי למסלול הזכוכית של תבנית ה-PDMS. הגבירו את טמפרטורת הפלטה החמה ל-180 degrees Celsius, והמתינו במצב זה במשך 15 דקות.

כבו את הפלטה החימומית וקררו את כל המערך. הסירו את הבלוקים המתכתיים לאחר שהטמפרטורה ירדה מתחת ל-50 °C, וקלפו בזהירות את תבנית ה-PDMS התפורה מסרט ה-PS. בעזרת מחורר קשת מפלל חלול, חתכו את מצעי ה-PDMS בעלי הננו-תבנית לעיגולים שיתאימו לתצורה של פלטת ריבוי בארות ספציפית.

לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להניח את דיסקיות ה-PDMS לתוך הבארות של פלטת הרב-בארות. סטריליזו את תשתיות ה-PDMS באמצעות ethanol 70% למשך 30 דקות. לאחר מכן, שאבו את ה-ethanol, ובעקבות זאת בצעו חשיפה ל-UV למשך 30 דקות.

שטפו את תשבתי ה-PDMS עם 1X sterile phosphate-buffered saline שלוש פעמים. לאחר מכן, גרעו את תשבתי ה-PDMS בחלבון מטריצה חוץ-תאית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את תשבתי ה-PDMS שלוש פעמים עם sterile PBS, למשך חמש דקות בכל פעם.

שעו את תאי סרטן ריאה אנושיים מסוג A549 בתווך Dulbecco's Modified Eagle Medium עם 10% fetal bovine serum, וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. זרעו את התאים בצפיפות זריעה של 2,000 תאים לסנטימטר רבוע על מצעי ה-PDMS. תרבתו את התאים בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה המכילה 5% carbon dioxide למשך יום אחד, ובחנו אותם לאחר מכן.

הננו-דפוס שנוצר על לוח ה-PS והסרט הדק מוצגים כאן. החיצים מצביעים על בליטת הפולימר במרווחים שבין תפרי התבניות של ה-PDMS. תמונות SEM אלו מדגימות כי מצעי עבודה של PDMS מועברים בנאמנות מהננו-דפוס שנכתב באמצעות ליטוגרפיה של אלומת אלקטרונים על ידי יישום טכניקת התפר.

תמונות SEM מייצגות של תאי A549 שגודלו על ננו-סריגים (nanogratings) ועל ננו-עמודים (nanopillars) מוצגות כאן. התאים מראים מורפולוגיה תאית מיושרת על הננו-סריגים, בעוד שהתאים מתפשטים באופן אקראי על הננו-עמודים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לייצר שטח גדול של מצע בעל תבנית ננומטרית באמצעות תפירה (stitching) של מספר תבניות ננומטריות קטנות ומוגדרות.

אל תשכחו שעבודה עם טולואן ופראפורמאלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להשתמש תמיד בציוד מגן אישי מתאים בעת ביצוע הפרוטוקולים.