הרחבת טכניקת תפר באמצעות מצעי nanopatterned עבור Nanotopographical אפנון של התנהגות תא
8 בדצמבר 2016
מוצג פרוטוקול לייצור שטח גדול של מצע ננו-דפוסי מתבניות ננו-דפוסיות קטנות לחקר אפנון ננוטופוגרפי של התנהגות התא.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר שטח גדול של מצע ננו-דפוס מתבניות ננומטריות קטנות על ידי שימוש בטכניקת תפרים פשוטה ומשתלמת אך רב-תכליתית. שיטה זו יכולה לסייע בחקר אפנון ננוטופוגרפיה של סובסטרט של פנוטיפ התא ותפקודו ברמה התאית והמולקולרית, כגון ביטוי של חלבוני הידבקות מוקדיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה וחסכונית.
כדי להתחיל, הכן את תבנית הסיליקון הסילנית בפרה-פולימר PDMS, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכניסו את תבנית הסיליקון הסילנית לצלחת פטרי בגודל 60 מילימטר. יוצקים את הקדם-פולימר PDMS על תבנית הסיליקון בצלחת הפטרי.
מניחים את צלחת הפטרי במייבש פלסטיק ומסירים כ -10 דקות, עד שכל הבועות נעלמות. מעבירים את צלחת הפטרי לצלחת חמה ומרפאים את ה-PDMS prepolymer ב-70 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. מקלפים בזהירות את תבנית ה-PDMS מתבנית הסיליקון באמצעות פינצטה.
קבע את הכיוון של ננו-תבניות PDMS אנזוטרופיות, כגון ננו-סורגים, תחת מיקרוסקופ אופטי, וסמן אותו בצד האחורי של תבניות ה-PDMS עם עט טוש. נקה את מצע הסיליקון עם אתנול במכסה אדים, ולאחר מכן יבש אותו באוויר דחוס. חתוך את האזורים הלא מעוצבים של כל תבנית PDMS בעזרת להב.
יש ליישר את תבניות ה-PDMS קרוב ככל האפשר, אך לא לגעת בתבנית שמסביב, כדי למזער את האזור הלא מעוצב וכדי להימנע מנגיעה בעיוות הננו-דפוס בעת הפעלת כוח המדחס. הנח את תבנית ה-PDMS הגזומה עם הננו-דפוס עם הפנים כלפי מטה על צד המראה של מצע הסיליקון, ולאחר מכן יישר תבניות אחרות קרוב אך לא נוגע בתבניות שמסביב. זה קריטי לנסות לרפא את ה-PDMS בשכבת הבסיס מכיוון ש-PDMS לא נרפא עלול לזרום דרך הפער בין התבניות המרובות ולפגוע בננו-תבניות.
עם זאת, ה-PDMS שנרפא לחלוטין אינו יכול לחבר את התבניות המרובות יחד. להכנת שכבת דבק PDMS, יצוק גרם אחד של פרה-פולימר PDMS נטול גז על שקופית זכוכית נקייה ליצירת שכבה בעובי 0.5 מילימטר. אופים את שכבת ה-PDMS בחום של 100 מעלות צלזיוס על פלטה חמה במשך שלוש עד חמש דקות.
השתמש במחט כדי לגעת בשכבה ולוודא שהשכבה נרפאה חלקית אך לא לחלוטין. הנח את שכבת ה-PDMS בצד האחורי של תבניות ה-PDMS המיושרות, הפוך במהירות את המכלול הזה והעביר אותו לפלטה החמה. הפעל כוח דחיסה באמצעות בלוק מתכת על גבי המכלול כדי להבטיח מגע טוב בין שכבת הדבק PDMS לבין הצד האחורי של תבניות ה-PDMS.
רפאו את שכבת הדבק PDMS ב-100 מעלות צלזיוס למשך שעה. כבה את הפלטה החמה, הסר את גוש המתכת וקילף את תבנית ה-PDMS החד-ממדית ממצע הסיליקון. כדי להטביע את תבנית ה-PDMS התפורה לתוך לוחית ה-PS, הנח את לוחית ה-PS במרווח אלומיניום המוגדר על פרוסת סיליקון בגודל 3 אינץ'.
מחממים את צלחת ה-PS על פלטה חמה בחום של 250 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, הנח את תבנית ה-PDMS התפורה, עם ננו-דפוסים עם הפנים כלפי מטה, על צלחת ה-PS המותכת. לאחר מכן, הנח לוחית אלומיניום על שקופית הזכוכית של תבנית ה-PDMS התפורה.
הפעל לחץ דחיסה באמצעות קוביות מתכת על לוחית האלומיניום, והמתן שלוש דקות. הרם והחלף את גוש המתכת מלוח האלומיניום, והגביר את לחץ הדחיסה ל -25 קילופסקל. לאחר מכן, חזור על שלב זה כשהלחץ מוגבר ל -50 קילופסקל.
שמור על טמפרטורת הפלטה החמה בין 240 ל-250 מעלות צלזיוס בלחץ קבוע של 50 קילופסקל למשך 15 דקות. כבה את הפלטה החמה וקרר את כל ההגדרה. הסר את גושי המתכת לאחר שהטמפרטורה נמוכה מ-50 מעלות צלזיוס, וקילף בזהירות את תבנית ה-PDMS התפורה מלוח ה-PS.
כדי להטביע את תבנית ה-PDMS על סרט דק PS, הנח את תבנית ה-PDMS התפורה עם ננוטופוגרפיה עם הפנים כלפי מטה על הסרט הדק PS, המונח על פלטה חמה. הפעל לחץ דחיסה של 12 קילופסקל על תבנית ה-PDMS באמצעות קוביות מתכת על מגלשת הזכוכית של תבנית ה-PDMS. העלו את טמפרטורת הפלטה החמה ל -180 מעלות צלזיוס, ושמרו עליה למשך 15 דקות.
כבה את הפלטה החמה וקרר את כל ההגדרה. הסר את גושי המתכת לאחר שהטמפרטורה יורדת מתחת ל-50 מעלות צלזיוס, וקילף בזהירות את תבנית ה-PDMS התפורה מסרט ה-PS. בעזרת אגרוף קשת פלדה חלול, חותכים את מצעי ה-PDMS הננו-דפוסיים לדיסקים כדי להתאים לתצורה של לוח ספציפי מרובה בארות.
לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי למקם את דיסקי ה-PDMS לבארות של הצלחת מרובת הבארות. עקר את מצעי ה-PDMS על ידי שימוש באתנול 70% למשך 30 דקות. לאחר מכן, שאפו את האתנול, ולאחר מכן חשפו ל-UV למשך 30 דקות.
שטפו את מצעי ה-PDMS עם תמיסת מלח סטרילית פי 1 עם חוצץ פוספט שלוש פעמים. לאחר מכן, צפו את מצעי ה-PDMS בחלבון מטריצה חוץ-תאית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את מצעי ה-PDMS שלוש פעמים עם PBS סטרילי, כל אחת למשך חמש דקות.
השעו תאי סרטן ריאות אנושיים A549 במדיום הנשר המותאם של Dulbecco עם סרום בקר עוברי של 10%, וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. צלחת את התאים בצפיפות זריעה של 2,000 תאים לסנטימטר רבוע על מצעי ה-PDMS. תרבו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 5% פחמן דו חמצני למשך יום אחד, והתבוננו בהם לאחר מכן.
הננו-דפוס שנוצר על לוחית ה-PS והסרט הדק מוצגים כאן. החצים מציינים את העלאת הפולימר במרווחים של תבניות ה-PDMS התפורות. תמונות SEM אלה מדגימות כי מצעים הפועלים ב-PDMS מועברים נאמנה מתבנית הננו-דפוס שנכתבה על ידי ליתוגרפיה של קרן אלקטרונים על ידי יישום טכניקת התפר.
תמונות SEM מייצגות של תאי A549 הגדלים על ננו-סורגים וננו-עמודים מוצגות כאן. התאים מראים מורפולוגיה של תאים מיושרים על הננו-סורגים, בעוד שהתאים מתפשטים באופן אקראי על הננו-עמודים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור שטח גדול של מצע ננו-דפוסי על ידי תפירת תבניות ננומטריות מוגדרות מרובות וקטנות.
אל תשכח שעבודה עם טולואן ופרפורמלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בזמן ביצוע ההליכים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול לייצור שטח גדול של מצע ננו-מעוצב מעובשים ננו-מעוצבים קטנים. השיטה מתמקדת בחקר המודולציה הננו-טופוגרפית של התנהגות תאים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- התנהגות תאים
- ננו-טופוגרפיה
- הנדסת מצעים
רקע
- מצעים ננו-מעוצבים משפיעים על פנוטיפ ותפקוד התא.
- חלבוני הידבקות פוקאליים הם מפתח להבנת האינטראקציות של התאים עם משטחים.
- שיטות עכשוויות עשויות להיות מורכבות או יקרות.
- יש צורך בטכניקה פשוטה ובמחיר סביר ליישום רחב יותר.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה חסכונית ליצירת שטחים ננו-מעוצבים גדולים.
- להקל על מחקרים כיצד הננו-טופוגרפיה משפיעה על התנהגות תאית.
- לשפר את ההבנה של התגובות התאיות והמולקולריות לשינויים במצע.
שיטות בשימוש
- הכנת תבניות סיליקון מסולפניות.
- שימוש ב-PDMS פרה-פולימר ליצירת מצעים.
- יישום טכניקת תפרים להעברת דפוסים.
- שימוש בצלחות פטרי להצבת התבניות.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של מצעים ננו-מעוצבים גדולים.
- מודולציה מודגמת של התנהגות תאים על בסיס טופוגרפיה של המצע.
- הדגשת הפשטות והחסכון בשיטה.
- מתן בסיס למחקרים נוספים על אינטראקציות תא-מצע.
מסקנות
- השיטה המוצגת היא גישה קיימא ליצירת מצעים ננו-מעוצבים.
- היא פותחת דרכים חדשות למחקר בנושא מודולציה של התנהגות תאים.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל את הטכניקה הזו כדי לחקור תגובות תאיות שונות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Generating large-area, well-defined nanopatterned substrates enables robust phenotypic screening and mechanistic de-risking in early discovery. This approach supports target validation by providing reproducible, scalable models to assess how nanotopography influences cell spreading, adhesion, and signaling—key phenotypes in oncology and fibrosis research. The method’s affordability and versatility allow integration into multi-well formats, facilitating cross-functional collaboration between bioengineering, assay development, and translational teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how nanotopography modulates focal adhesion protein expression and cell morphology, supporting hypothesis testing in mechanotransduction pathways.
- Operational Value: Provides standardized, large-area substrates for consistent cell seeding and imaging across replicates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces reproducible nanotopographical cues that can be used to screen compounds or genetic perturbations affecting cell adhesion and spreading.
- Operational Value: Compatible with multi-well plate formats, enabling high-throughput preparation of PDMS discs for standardized assay conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling using cell lines like A549 to study how substrate topography influences cancer cell behavior, informing preclinical target confidence.
- Operational Value: Allows extrapolation from discovery to preclinical workflows via reusable, sterilizable PDMS working substrates.
Pipeline & Workflow Integration
The stitch technique bridges nanofabrication and cell-based assays, positioning nanopattern generation as an enabling capability in the discovery-to-preclinical continuum for mechanobiology-focused targets.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven testing of how topographical cues alter cell phenotype, supporting pathway clarification in integrin and FAK signaling.
- Screening: Yields quantifiable, topography-modulated cell spreading metrics that serve as phenotypic readouts for compound or target modulation.
- Analytics: Enables measurement of cell alignment, spreading area, and morphology as outputs for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Uses cancer cell models (e.g., A549) to link nanotopography to phenotypic responses with potential relevance to tumor microenvironment modeling.
- Enterprise Reuse: The PDMS mold stitching and nanoimprinting workflow is reusable across projects, reducing redundant nanofabrication efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing variability in nanotopographical inputs across experiments.
- Operational Value: Enables low-cost, in-house generation of large-area nanopatterns without reliance on specialized nanofab facilities.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions in target validation by providing mechanistic insights into how physical cues modulate cell behavior.
- Portfolio Impact: De-risks early-stage targets by clarifying whether observed phenotypes are target-dependent or influenced by substrate artifacts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in soft lithography, PDMS handling, and nanoimprinting techniques.
- Depends on access to hot plates, vacuum desiccators, metal blocks for compression, and optical/SEM imaging for mold alignment and validation.
- Necessitates standardization of mold trimming, alignment, and adhesive layer curing to prevent nanopattern deformation.
- Adaptation to different polystyrene formats (thin film vs. plate) requires pressure and temperature optimization.
- Practical limitations include alignment precision at mold edges and potential interstice artifacts if compressive force is uneven.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Stitching of Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Molds into a Large, Single Mold
3:51
Generation of a Master Mold on Polystyrene (PS) Substrates
6:01
Nanotopographical Modulation of Cell Behavior
7:33
Results: Generated PS Nanopatterns and Nanotopography Modulation of Cell Morphology
8:26
Conclusion
