משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור ספריות ריצוף לרזולוציית זוגות בסיסים D-N-A-C-P-G, ניתוח מתילציה המבוסס על עיכול אנזים הגבלה בשילוב עם ציטוזין על ידי המרת סולפיט. זה מושג על ידי ביצוע תחילה של עיכול אנזים הגבלה אחד של MSP של DNA באיכות גבוהה, ולאחר מכן תיקון קצה, זנב וקשירה של מתאמים שעברו מתילציה. השלב הבא הוא לבצע על ידי המרת סולפיט בגודל שברים נבחרים לאחר מכן על ידי המרת סולפיט.

השברים מוגברים באמצעות PCR. השלב האחרון הוא ביצוע בקרת איכות ורצף, ולאחר מכן הדמיה וניתוח נתונים. בסופו של דבר, ייצוג מופחת משופר של ריצוף דו סולפיט מזהה רזולוציה כמותית של זוג בסיסים של דפוסי מתילציה של ציטידין במיקומים גנומיים עשירים ב-CG.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות מתילציה אחרות של DNA, כגון מיקרו-מערכים, הוא שהיא יכולה להשתמש בכמויות קטנות של חומרי קלט כדי ליצור נתוני מתילציה של D-N-A-C-P-G בכיסוי גבוה ברזולוציית זוגות בסיסים ובאתרים רלוונטיים מבחינה ביולוגית. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר התענייננו בחקר דפוסים אפיגנטיים מעבר לאזורים המכוסים במבחנים מסורתיים. היינו מעוניינים לפתח טכניקה זו כדי לעבור ממיקרו-מערכים ליצירת נתוני מתילציה של DNA ברזולוציית זוגות בסיסים שניתן לשלב עם נתונים שנוצרו מטכניקות אחרות של הדור הבא.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה. לדוגמה, דפוסים אפיגנטיים והטרוגניות בדגימות ביולוגיות בהשוואה לבקרות רגילות או מצבי מחלה אחרים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ימצאו אותה מאתגרת בשל אורך ההליך, הדרישות הספציפיות הרבות ומאפייני הריצוף הייחודיים של הספריות שנוצרו בנפילת מאמי.

מומחה מחקר במעבדה שלנו יסייע בהדגמת ההליך כדי להתחיל בפרוטוקול זה. ראשית, הכינו מנות מטוהרות של דגימות DNA גנומיות שעברו עיכול אנזים הגבלה אחד של MSP, תגובת תיקון קצה קהה, ותוספת נוקלאוטיד בודדת בשלושת הקצוות העיקריים. בשלב זה, מוצרי ה-DNA יהיו מוכנים לקשירת מתאם כדי להתחיל להעביר 10 מיקרוליטר של דגימת A-A-L-D-N-A לתוך צינור PCR של 0.2 מיליליטר, ולהניח את הצינור על קרח.

בנוסף, הנח מנה של מולקולות המתאם על קרח. לאחר מכן, הכינו את תערובת ריאגנט הקשירה על קרח. הוסף גם את מגיב הקשירה וגם את מולקולות המתאם לדגימת ה-DNA ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב.

הנח צינור PCR לתוך מחזורי תרמי ואפשר לתגובת הקשירה להמשיך למשך הלילה ב-16 מעלות צלזיוס למחרת. טהר את מוצרי הקשירה באמצעות ערכת מיצוי DNA בשלב מוצק מבוססת חרוז מגנטי או עמוד סיליקה. בשלב האחרון של תהליך הטיהור.

מסלק את ה-DNA על ידי הוספת 30 מיקרוליטר של מים ללא DNA. ניתן לאחסן את מוצר ה-DNA המטוהר בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד שיהיה צורך בדגימות, שהתחילו עם ה-DNA הכולל של 25 ננוגרם ומעלה. השתמש במנגנון מיצוי ג'ל אוטומטי כגון PI והכנה כדי לבחור מוצרים קשורים באורכים שבין 150 זוגות בסיסים ל-400 זוגות בסיסים.

הקפד לא לכלול צבעי הדמיית DNA כגון Ethereum bromide או Cyber Green מקלטת האגרוס מכיוון שהם יכולים לשנות את תכונות נדידת ה-DNA של השברים הקשורים למתאם המזלג. ניתן להשתמש בפרוטוקולי בחירת גודל סטנדרטיים מבוססי ג'ל אגרוס לשלב זה של הפרוטוקול כדי להגדיר אלקטרופורזה של DNA על קלטת ארוס נטולת צבע של פיפין 2%. צור פרוטוקול חדש במסוף Pippin Prep ובחר באפשרות 2%DF סמן L כקלטת הנבחרת.

לאחר מכן הפעל את האפשרות השתמש בתקנים פנימיים וודא שמספר נתיב הייחוס תואם למספרי הנתיב לבידוד מקטעי DNA הנעים בין 150 זוגות בסיסים ו-400 זוגות בסיסים. בחר באפשרות הטווח כמצב האיסוף והזן את פרמטרי הגבול הבאים: 135 עבור התחלת זוג בסיס, 410 עבור קצה זוג הבסיסים ו-240 עבור כפות זוג בסיסים. זה מורה למנגנון ליישר את השדה האלקטרופורטי ליציאת הפלט האלקטרו-פליטה.

כאשר מקטעי DNA בטווח זה נעים בקרבת היציאה. לאחר שמירת הפרוטוקול file, הכן את קלטת הג'ל ואת בארות טעינת הדגימה של המכשיר על ידי ביצוע נהלי ההפעלה הסטנדרטיים מ-Pippen Prep עם הגדרת המכשיר. הכן את דגימות ה-DNA לאלקטרופורזה על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של סמן ה-DNA ל-30 מיקרוליטר של דגימה נתונה לאחר קשירה כדי להעמיס את התערובות על קלטת הג'ל.

ראשית, הסר 40 מיקרוליטר ממאגר האלקטרופורזה מכל דגימה. ובכן, החלף את הנפח על ידי פיפטינג של כל תערובת סמני דגימה של 40 מיקרוליטר לבארות בודדות. בחזרה לקונסולה, טען את הפרוטוקול השמור ולחץ על התחל כדי להתחיל באלקטרופורזה.

כאשר התוכנית מגיעה לזוג הבסיסים 240, שלב ההשהיה אסוף ידנית 40 מיקרוליטר של הפלט מכל יציאת פלט עם פיפטה. סמן שברים אלה כשבר הספרייה התחתון. לאחר איסוף שברי הספרייה התחתונים, שטפו מיד את יציאות היציאה על ידי הוספת 40 מיקרוליטר של מאגר אלקטרופורזה טרי.

מלטף את המאגר למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים, ואז שואף את הרשת. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות כדי להסיר את כל העקבות של מיני DNA באורך קצר מהשקעים. כעת הוסף 40 מיקרוליטר של מאגר אלקטרופורזה לדגימה.

אטום היטב את יציאות האלוסיאן ולחץ על כפתור ההפעלה כדי לחדש את תהליך האלוסיאן. עם השלמת תוכנית Ellucian בהגדרת 410 זוגות בסיסים, אסוף את 40 המיקרוליטרים של אינואיט מכל יציאות היציאה ותייג את השברים הללו כשבר הספרייה העליון. בשלב זה, שני חלקי הספרייה מטוהרים בג'ל וכבר להמרת בי סולפיט.

באמצעות ערכה זמינה מסחרית, בצע את בדיקת ההמרה של בי סולפיט בשני חלקי הספרייה. בשלב האחרון של תהליך ההמרה, יש להוציא את דגימות ה-DNA ב-40 מיקרוליטר של מים ללא DNA. לאחר המרת בי סולפיט, מקטעי ספריית ה-DNA המתקבלים יעברו הגברת PCR להעשרה באמצעות פריימרים שעוברים הכלאה בקצות המתאם של כל מולקולת DNA.

כדי להתכונן להעשרה PCR תחילה, הוסף 160 מיקרוליטר של תערובת המאסטר PCR לכל 40 מיקרוליטר של דגימה שהוסבה על ידי סולפיד. לאחר מכן מחלקים את תערובת 200 המיקרוליטר המתקבלת לארבע מנות של 50 מיקרוליטר. בצינורות PCR נפרדים.

הנח את הצינורות במחזור תרמי והגביר את תבנית ה-DNA שהומרה. לאחר ההעשרה, משוך את ארבעת מוצרי ה-PCR לתוך צינור יחיד של 1.5 מיליליטר וטהר את ה-DNA עם ערכת ניקוי PCR מסחרית. אם נעשה שימוש בערכת מיצוי פאזה מוצקה של חרוז מגנטי לטיהור מוצרי ה-PCR, שנה את נהלי ההפעלה הסטנדרטיים על ידי ערבוב תחילה של מוצרי ה-PCR המשולבים של הספרייה התחתונה עם פי 1.7 מהנפח הכולל שלהם בחרוזים.

לאחר מכן מערבבים את מוצרי ה-PCR המשולבים של הספרייה העליונה עם פי 1.1 מהנפח הכולל שלהם בחרוזים. לאחר מכן עקוב אחר פרוטוקול היצרן עד לשלבי שטיפת האתנול של 70% שבהם יש לשנות כל אחד מנפחי הכביסה ל-800 מיקרוליטר בשלב האחרון של תהליך הטיהור. יש להוציא את ה-DNA עם 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה ללא DNA.

אחסן את הספריות המטוהרות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד שיהיה צורך בהן באמצעות בדיקה מבוססת פלואורסצנטי סלקטיבית עבור DNA דו-גדילי לכמת את כמות תוכן ה-DNA לאחר ההעשרה עבור כל שבר ספרייה. יתר על כן, הערך את גודל ואיכות הספרייה לאחר ההעשרה באמצעות ביואנלייזר. חשב את המולריות האפקטיבית של ה-DNA של חלק ספרייה מסוים באמצעות אורך ה-DNA הממוצע המתבטא בזוגות בסיסים.

לאחר שהמולריות ידועה, השתמש במים החופשיים של ה-DNA כדי לדלל כל חלק ספרייה עליון ותחתון מתאים לריכוז סופי של שני ננו-מולרים. שלב את זוגות הספרייה התחתונה והעליונה לצינור יחיד כדי ליצור תערובת ספריית חורים ננו-מולרית של 20 מיקרוליטר כל אחת. הדגימה המאוגדת מוכנה כעת לריצת רצף.

במבחנים הקשורים לריצוף, כולל E-R-R-B-S, התפלגות האיכות והגודל של מולקולות הספרייה העליונה והתחתונה הם גורמי מפתח בקביעת איכות נתוני הריצוף הסופיים. בהשוואה לפרוטוקולי מיצוי ג'ל ידניים מסורתיים, מנגנון מיצוי הג'ל האוטומטי המשמש בפרוטוקול E-R-R-B-S יפיק התפלגות גודל עקבית וימזער את הפוטנציאל לזיהום צולב של דגימה. לאחר מכן, עם שליחת מולקולות הספרייה המומרות של BIS sulfite לריצוף הנתונים הגולמיים מכל גדילי ה-DNA מראים כי עבור כל גדיל נתון, איכות הנתונים עבור כל מיקום נוקלאוטיד עולה באופן דרמטי מיד לאחר שלושת הנוקלאוטידים הראשונים.

מכיוון שרצף הקונצנזוס עבור שלושת הנוקלאוטידים הללו נקבע עם CGG עבור הרוב המכריע של מולקולות הספרייה, הנתונים מצביעים על כך שפרוטוקול E-R-R-B-S ייצר אוסף ספרייה המכיל קבוצה רצויה של מקטעים גנומיים המוקפים בעיקר. עם MSP תקציר הגבלה אחד מסתיים ממעוף הציפור. פרוטוקול E-R-R-B-S יכול להניב נתוני רזולוציה של זוגות בסיסים של אתרי מתילציה של ציטידין על פני כל הגנום.

לדוגמה, כרומוזום 12 מוצג כאן. הפרוטוקול מכסה ייצוג מופחת של CPG ברחבי הגנום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ספריות E-R-R-B-S ליצירת נתוני מתילציה ברזולוציית בסיס D-N-A-C-P-G לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך ארבעה ימים אם מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להתחיל עם DNA באיכות גבוהה, לכלול את כל השלבים המתוארים, לאמת את היעילות של המרת בי סולפט ורצף באמצעות הפרמטרים המומלצים. אל תשכח שעבודה עם פניל וכלורופורם יכולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות נפוצים, כגון עבודה במכסה מנוע כימי וסילוק פסולת נכון בעת ביצוע הליך זה.

בצע הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ריצוף ספיירו או אפיטיפ מערך מסה כדי לאמת את הממצאים. יתר על כן, ניתן לבצע פרופיל ביטוי גנים כדי לקבוע את המשמעות הביולוגית של דפוסי המתילציה של ה-DNA שזוהו.

היכולת לייצר DNA ברזולוציה של זוגות בסיסים, דפוסי מתילציה מכמויות מוגבלות של חומרי קלט אפשרה פרופיל של אוכלוסיות תאים נדירות שמעולם לא התאפשרו בעבר. זה גם איפשר את הפרופיל של קבוצות גדולות של דגימות קליניות לחקר ויסות מתווך אפיגנטי והטרוגניות של מחלות.