Biofunctionalized הכחול פרוסים חלקיקים ליישומי הדמיה מולקולריים Multimodal

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסנתז ננו-חלקיקים כחולים פרוסיים מתפקדים ביולוגית לשימוש בחומרי הדמיה מולקולרית רב-מודאליים. זה מושג על ידי סינתזה תחילה של ננו-חלקיקים כחולים פרוסיים המכילים יוני גדוליניום או מנגן, המשפרים את אות ה-MRI. השלב השני הוא הצמדת אבדון פלואורסצנטי על פני הננו-חלקיקים, מה שמעניק יכולת הדמיה פלואורסצנטית.

לאחר מכן, הננו-חלקיקים המצופים avadon מתפקדים ביולוגית עם התא הרצוי המכוון לנוגדנים ביוטיניים. שלב אחרון הוא ביצוע בדיקת בקרת איכות על הננו-חלקיקים הביו-פונקציונליים על ידי מדידת גודלם, פוטנציאל הזטה ויציבותם הזמנית. בסופו של דבר, הננו-חלקיקים הביו-פונקציונליים משמשים ביישומי הדמיה מולקולרית רב-מודאלית כדי לדמיין אוכלוסייה ממוקדת ספציפית של תאים בתוך תערובת באמצעות הדמיה פלואורסצנטית ו-MRI.

סוכני הדמיה מסחריים נוכחיים הם בדרך כלל במצב יחיד ומציעים רזולוציה רק ברמה האנטומית. ננו-חלקיקים כחולים פרוסיים משלבים שני מצבי הדמיה משלימים, MRI ופלואורסצנטי, ומאפשרים הדמיה מולקולרית ורמות תת-תאיות. היישומים של ננו-חלקיקים רב-מודאליים משתרעים לקראת אבחון סרטן ומחלות דלקתיות בנוסף לניטור תגובות הטיפול שלהם.

הסיבה לכך היא שננו-חלקיקים ביו-פונקציונליים יכולים למקד ולהיקשר לאוכלוסיית תאים באזור מוגדר בגוף. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אבחון סרטן ומחלות דלקתיות ותגובה לטיפול, ניתן ליישם אותה גם על מצבים פתולוגיים אחרים שיפיקו תועלת מהרגישות והספציפיות של הדמיה מולקולרית. באמצעות פלואורסצנטיות ו-MRI, עלה לראשונה הרעיון לייצר את הננו-חלקיקים הללו כאשר קבענו שניתן לסנתז ביציבות את הכחול הפרוסי וחומר מאושר על ידי ה-FDA לצריכה אוראלית אנושית באמצעות סכימת סינתזה של חלק אחד ופונקציונליזציה ביולוגית חזקה באמצעות טכניקות ביו-מצומדות סטנדרטיות.

כדי להתחיל, הכינו תמיסה מולרית של 5 מיליון אשלגן hexa sano ferrate שניים מתוך חמישה מיליליטר של מים נטולי יונים כדי ליצור פתרון A פתרון תיקון הבא B המכיל 2.5 מילי-מולרי ברזל שלושה כלוריד ו -2.5 מילי-מולרי מנגן. שני כלורידים ב -10 מיליליטר של מים נטולי יונים לסינתזה של ננו-חלקיקים כחולים פרוסיים מנגן. ניתן לסנתז ננו-חלקיקים אחרים כפי שמצוין בפתרון העברת פרוטוקול הטקסט B ל-A בקבוק תחתון עגול ולערבב את התמיסה ב-1000 סל"ד בטמפרטורת החדר.

בעזרת משאבה פריסטלטית הוסף תמיסה, טיפה לתוך הכלי בקצב של 10 מיליליטר לשעה. לאחר השלמת הוספת תמיסה A, מערבבים את התערובת בחום של 1000 סל"ד למשך 30 דקות נוספות. לאחר מכן העבירו מיליליטר אחד של התערובת לצינורות מיקרו צנטריפוגה והוסיפו 0.2 מיליליטר של חמישה מיליליטר נתרן כלורי לכל צינור.

צנטריפוגה את הצינורות ב 20, 000 פעמים G למשך 10 דקות לפחות, ואז הסר בזהירות את הסופנט והשאיר את גלולת הננו-חלקיקים. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מים נטולי יונים לכל גלולה. השתמש בקצה מיקרו כדי להשעות את הננו-חלקיקים באופן שווה בתמיסה על ידי סוניקציה.

שטפו את הננו-חלקיקים לפחות שלוש פעמים נוספות כדי להסיר את רכיבי התגובה הראשונית מהתרחיף לאחר הסיבוב הסופי, השעו מחדש את הננו-חלקיקים במיליליטר אחד של מים נטולי יונים לאחר ציפוי הננו-חלקיקים במאורת פלואורסצנט כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הסירו את מלאי הנוגדנים הביוטיניליים מהמקרר. הנה. השתמש באנטי נוירון גליה אנטיגן 2 ואנטי אנושי אאוטקסין 3. העבירו את הנוגדן הביוטיני למסנן מיקרו פוגה של 0.2 מיקרו ניילון, ולאחר מכן צנטריפוגה את הצינור ב-14,000 פעמים G למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו פחות או שווה ל-0.05 מיליגרם של הנוגדן למיליגרם של ננו-חלקיקים מצופים עדן וכסו את הצינורות בנייר אלומיניום כדי להגן עליהם מפני אור. דגרו את הצינורות בניעור עדין במשך שעתיים עד ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצמדת הנוגדנים, הוסף 10 מיקרוליטר של מיליגרם אחד לכל דגימת ננו-חלקיקים של מיליליטר ל-990 מיקרוליטר של מים נטולי יונים במכסה פלסטיק חד פעמי של ה-vete ו-V אותו לערבוב.

ובכן, קבעו את הגודל הממוצע של הננו-חלקיקים באמצעות מערכת פיזור אור דינמית עם זווית מדידה של 173 מעלות. התחל בהכנת תרחיפי 10 מיליליטר של תאים ב-PBS בריכוז של כ-100,000 תאים למיליליטר עבור תרביות מעורבות יש להכין צינורות המכילים יחסים משתנים של כל קו תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט בשני מיליליטר של 5% BS, A לכל צינור כדי לחסום את התאים ולמזער קשירה לא ספציפית. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מיליגרם אחד למיליליטר, פונקציונליזציה ביולוגית של ננו-חלקיקים לכל צינור, ודגירה על התערובת למשך שעה.

לאחר מכן, שטפו את התאים ללא ננו-חלקיקים לא קשורים על ידי סיבוב הצינורות ב-1000 פעמים G למשך חמש דקות וכיפוף מחדש של הכדורים במיליליטר אחד של PBS. חזור על תהליך זה לפחות פעמיים נוספות. תקן את התאים באמצעות 10% פורמלדהיד ב-PBS ולאחר מכן הוסף 10 מיקרוגרם למיליליטר, שבעה אמינו אקטין ומיצין D ב-PBS כדי לצבוע את התאים, דגר את הצינור על קרח למשך 30 דקות ולאחר מכן שטוף את התאים ב-PBS.

לאחר מכן, טען את הדגימה לתוך ציטומטר הזרימה ונתח 10,000 תאים מגודרים מכל דגימה. הליך דומה לתאי הדמיה הקשורים לננו-חלקיקים פלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי מתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל, יש ללבוש את התאים בצלוחיות T 75 עד למפגש של כ-80%, ולאחר מכן לשטוף את התאים ללא מדיום עם חמישה מיליליטר PBS.

הוסף חמישה מיליליטר של 1% BSA ב-PBS וחסום את התאים למשך שעה. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיליליטר של 0.5 מיליגרם למיליליטר ננו-חלקיקים מצופים נוגדנים לבקבוק ודגרו על התאים למשך שעה כדי לאפשר לננו-חלקיקים להיקשר. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר PBS כדי להסיר ננו-חלקיקים לא קשורים.

לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של 0.25% טריפסין בתמיסת EDTA, ודגרו על התאים למשך חמש דקות כדי לנתק את התאים מהבקבוק. הוסף שמונה מיליליטר של DMEM כדי להרוות את הניסיון ולאחר מכן העביר את תרחיף התא לצינורות צנטריפוגה. סובב אותם ב-1000 פעמים G למשך חמש דקות כדי לגלול את התאים.

לאחר מכן, שאפו את הסופינט והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS. הוסף מיליליטר אחד של 10% פורמלדהיד ב-PBS כדי לתקן את התאים ולאחר מכן להעביר 100 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות נפרדות של צלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות. הוסף 100 מיקרוליטר של 1% מותך במים נטולי יונים לכל באר וערבב על ידי צנרת למעלה ולמטה.

הניחו לג'ל להתמצק בארבע מעלות צלזיוס למשך 12 שעות כדי להניב פנטום. לאחר שהג'ל מתמצק, הנח את הפנטום במגנט קליני אופקי של שלושה T ליד גוש קובייה מוצק של 150 סנטימטר של 2% אגר. לאחר מכן אבטח את הפנטום ואת גוש האגר במרכז סליל מוח HD בעל שמונה ערוצים כדי למדוד את זמני ההרפיה השתמש בפרוסות קורונליות בעובי 0.5 מילימטר שצולמו בגובה הבינוני של צלחת 96 הבאר מבחני פיזור אור דינמי שימשו לקביעת הקוטר ההידרודינמי של יציבות הננו-חלקיקים שנוצרו מחקרים אימתו את היציבות ארוכת הטווח של הננו-חלקיקים משמשים הן בניסויים מבוססי מים והן בניסויים מבוססי מדיה תאית.

מיקרוסקופיה קונפוקלית בלייזר הראתה ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים עמוסים בנוגדנים ל-EOT 3 שנמצאו במיוחד על פני השטח של תאי EOL one. כאשר משתמשים בנוגדנים ל-NG 2, הם נקשרים באופן ספציפי לפני השטח של הנוירוספרות של BSG. הננו-חלקיקים הביו-פונקציונליים הצליחו לתייג בהצלחה פלואורסצנטית אוכלוסייה של תאים ממוקדים כפי שנמדד על ידי ציטומטריית זרימה.

בנוסף, הננו-חלקיקים הצליחו לכוון לתת-אוכלוסייה ספציפית של תאים בתערובת אפילו ביחסי תאים נמוכים של תאי מטרה. לבסוף, ננו-חלקיקים ביו-פונקציונליים הגדילו את ניגודיות ה-MRI של תאים ממוקדים, תאים שטופלו בננו-חלקיקים טעונים ב-nng. שני נוגדנים הראו עוצמת יתר ברצפים המשוקללים של T בהשוואה לתאים שטופלו בחלקיקי בקרה.

לעומת זאת, שני הננו-חלקיקים A NNG העניקו עוצמת היפו ב-T שני רצפים משוקללים בהשוואה לחלקיקי הבקרה. פעם אדונים. ניתן להשלים את הסינתזה של ננו-חלקיקים כחולים בעלי תפקוד ביולוגי תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי.

בדומה להליך זה, הננו-חלקיקים יכולים להיות פונקציונליים ביולוגית עם ביופולימרים שונים ולכוון ליגנד כדי לחקור מחלות חדשות ומצבים חדשים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנתז ננו-חלקיקים כחולים פרוסיים ליישומי פלואורסצנציה והדמיה כדי לתייג אוכלוסיית תאים. אל תשכח לעקוב בקפדנות אחר הנחיות הבטיחות ונהלי ההפעלה הסטנדרטיים לביצוע המחקרים במגנט ה-MRI הקליני.