Biofunctionalized הכחול פרוסים חלקיקים ליישומי הדמיה מולקולריים Multimodal

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסנתז ננו-חלקיקי כחול פרוסיה (Prussian blue) עם פונקציונליות ביולוגית לשימוש כחומרים המדמים דימות מולקולרי רב-ממדי. זאת מושגים תחילה על ידי סינתזה של ננו-חלקיקי כחול פרוסיה המכילים יוני גדולניום או מנגן, המגבירים את אות ה-MRI. השלב השני הוא הצמדת אוואדון (avadon) פלואורסצנטי לפני השטח של הננו-חלקיקים, דבר המקנה יכולת דימות פלואורסצנטית.

בשלב הבא, הננו-חלקיקים המצופים באבדוֹן עוברים פונקציונליזציה ביולוגית באמצעות נוגדנים ביוטינילים המכוונים לתאים הרצויים. השלב הסופי הוא ביצוע בדיקת בקרת איכות לננו-חלקיקים שעברו פונקציונליזציה ביולוגית, על ידי מדידת הגודל, פוטנציאל הזטא והיציבות הזמנית שלהם. לבסוף, הננו-חלקיקים שעברו פונקציונליזציה ביולוגית מיושמים באפליקציות של דימות מולקולרי רב-מודאלי, כדי להדמיות של אוכלוסיית תאים ספציפית ומכוונת בתוך תערובת, תוך שימוש בדימות פלואורסצנציה ו-MRI.

חומרי הדמיה מסחריים נפוצים הם בדרך כלל בעלי מצב הדמיה יחיד ומספקים רזולוציה רק ברמה האנטומית. ננו-חלקיקי Prussian blue משלבים שני מצבי הדמיה משלימים, MRI ופלוורסצנציה, ומאפשרים הדמיה מולקולרית וברמות תת-תאיות. היישומים של ננו-חלקיקים רב-מודאליים מתרחבים לאבחון סרטן ומחלות דלקתיות, בנוסף לניטור תגובות הטיפול בהן.

זאת מכיוון שננו-חלקיקים בעלי פונקציונליזציה ביולוגית יכולים להתמקד ולהיקשר לאוכלוסיית תאים באזור מסוים בגוף. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אבחון סרטן ומחלות דלקתיות ותגובה לטיפול, היא יכולה להיות מיושמת גם במצבים פתולוגיים אחרים אשר יפיקו תועלת מהרגישות והספציפיות של דימוי מולקולרי. תוך שימוש בפלואורסצנציה ו-MRI, הרעיון הראשוני לייצור ננו-חלקיקים אלו עלה כאשר קבענו שניתן לסנתז באופן יציב פרוסיה כחולה (Prussian blue), חומר המאושר על ידי ה-FDA לצריכה פה אנושית, באמצעות תכנית סינתזה של שלב אחד, ולבצע לו פונקציונליזציה ביולוגית חסונה באמצעות טכניקות סטנדרטיות של קשירת ביו-קונג'וגטים.

כדי להתחיל, הכין תמיסה של 5 mM של potassium hexacyanoferrate(II) ב-5 מיליליטר של מים דה-יוניים כדי להכין את תמיסה A; לאחר מכן הכין את תמיסה B המכילה 2.5 mM של iron(III) chloride ו-2.5 mM של manganese(II) chloride ב-10 מיליליטר של מים דה-יוניים עבור סינתזה של ננו-חלקיקי manganese Prussian blue. ניתן לסנתז ננו-חלקיקים אחרים כפי שצוין בפרוטוקול הטקסט. העבר את תמיסה B לבקבוק תחתית עגולה וערבב את התמיסה במהירות של 1000 RPM בטמפרטורת החדר.

באמצעות משאבה פריסטלטית, הוסיפו את תמיסה A בטפטוף אל הכלי בקצב של 10 milliliters לשעה. לאחר השלמת הוספת תמיסה A, ערבבו את התערובת ב-1000 RPM למשך 30 דקות נוספות. לאחר מכן, העבירו אליקוטות של מיליליטר אחד מהתערובת למבחנות מיקרו-צנטריפוגה והוסיפו 0.2 milliliters של חמישה מילי sodium chloride לכל מבחנה.

סובבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-20,000 ×g למשך 10 דקות לפחות, ולאחר מכן הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant), כך שיישאר משקע של ננוחלקיקים. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של מים דה-יוניים לכל משקע. השתמשו בטיפ מיקרו כדי לתלות את הננוחלקיקים באופן אחיד בתמיסה באמצעות סוניקציה.

שטפו את הננו-חלקיקים לפחות שלוש פעמים נוספות כדי להסיר מרכיבים מהתגובה הראשונית מהסספנסיה לאחר הסבב האחרון, השעיקו מחדש את הננו-חלקיקים ב-1 mL של מים דאיוניים לאחר ציפוי הננו-חלקיקים ב-fluorescent den כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוציאו את מלאי הנוגמים הביוטינליים מהמקרר. השתמשו ב-anti neuron glial antigen two וב-anti-human eotaxin three. העבירו את הנוגדן הביוטינלי למסנן מיקרו-צנטריפוגה מניילון של 0.2 µm, ולאחר מכן צנטריפוגו את המבחנה ב-14,000 ×g למשך 10 דקות.

בשלב הבא, הוסיפו כמות שאינה עולה על 0.05 milligram של הנוגדן לכל milligram של ננו-חלקיקים מצופים ב-Aden, וכסו את המבחנות בנייר אלומיניום כדי להגן עליהן מאור. הדגרימו את המבחנות תחת ניעור עדין למשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הצמדת הנוגדים, הוסיפו 10 µL של דגימת ננו-חלקיקים בריכוז של 1 mg/mL ל-990 µL של מים דאיוניים במבחנה מפלסטיק חד-פעמית, סגרו את המבחנה וערבבו אותה.

לאחר מכן, קבעו את הגודל הממוצע של הננו-חלקיקים באמצעות מערכת פיזור אור דינמי (dynamic light scattering) עם זווית מדידה של 173 מעלות. התחילו בהכנת תרחיפי תאים בנפח של 10 מיליליטר ב-PBS בריכוז של כ-100,000 תאים למיליליטר; עבור מבחנות של תרביות מעורבות, יש להכין יחסים משתנים של כל סוג תא כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, ולהוסיף 2 מיליליטר של 5% BSA לכל מבחנה כדי לחסום את התאים ולמזער קישור לא ספציפי. לאחר מכן, הוסיפו לכל מבחנה מיליליטר אחד של ננו-חלקיקים עם פונקציונליזציה ביולוגית בריכוז של 1 מיליגרם למיליליטר, והד기로 את התערובת למשך שעה אחת.

בשלב הבא, שטפו את התאים כדי להסיר ננו-חלקיקים שאינם קשורים על ידי צנטריפוגציה של המבחנות במהירות של 1000 ×g למשך חמש דקות וסספנסיה מחדש של המשקעים ב-1 ml של PBS. חזרו על תהליך זה לפחות פעמיים נוספות. קבעו את התאים באמצעות פורמלהיד 10% ב-PBS, ולאחר מכן הוסיפו לתוך ה-PBS מיקרוגרמים של 10 µg/mL של 7-aminoactinomycin D כדי לצבוע את התאים. דגרו את המבחנה על קרח למשך 30 דקות ולאחר מכן שטפו את התאים ב-PBS.

בשלב הבא, העמיסו את הדגימה לתוך ציטומטר הזרימה ונתחו 10,000 תאים שנבחרו (gated) מכל דגימה. פרוצדורה דומה לדימוי תאים הקשורים לננו-חלקיקים פלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בלייזר מתוארת בפרוטוקול הטקסט. לתחילתו, גדלו את התאים בבקבוקי T 75 עד להגעה לכ-80% confluence, ולאחר מכן שטפו את התאים כדי להסיר את המדיום באמצעות 5 milliliters של PBS.

הוסיפו חמישה מיליליטר של 1% BSA ב-PBS וחסמו את התאים למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו לבקבוק חמישה מיליליטר של ננו-חלקיקים מצופים בנוגדנים בריכוז של 0.5 מיליגרם למוליליטר והדגירו את התאים למשך שעה אחת כדי לאפשר לננו-חלקיקים להיקשר. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של PBS כדי להסיר ננו-חלקיקים שלא נקשרו.

לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של תמיסת 0.25% trypsin EDTA, והדגירו את התאים למשך חמש דקות כדי לנתק אותם מהבקבוק. הוסיפו שמונה מיליליטר של DMEM כדי לעצור את פעולת ה-trypsin, ולאחר מכן העבירו את סספנסיית התאים למבחנות צנטריפוגה. סבבו אותן ב-1000 ×g למשך חמש דקות כדי לשקע את התאים.

בשלב הבא, שאבו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את התאים ב-1 mL של PBS. הוסיפו 1 mL של 10% formaldehyde ב-PBS כדי לקבע את התאים, ולאחר מכן העבירו 100 µL מכל דגימה לבארות נפרדות בלוחית 96 באערים בעלת תחתית שטוחה. הוסיפו 100 µL של 1% aros מומס במים דה-יוניים לכל באר וערבבו באמצעות פיפטינג למעלה ולמטה.

יש להניח לג'ל להתמצק בטמפרטורה של 4 °C למשך 12 שעות כדי להפיק פנטום. לאחר התמצקות הג'ל, יש להניח את הפנטום במגנט קליני אופקי בעוצמה של 3 T לצד בלוק קוביה מוצק של 2% agar בגודל 150 סנטימטר. לאחר מכן, יש לקבע את הפנטום ואת בלוק ה-agar במרכז סליל HD brain בעל שמונה ערוצים; כדי למדוד את זמני הרפיעה, יש להשתמש בחתכים קורונליים בעובי 0.5 מילימטר שנלקחו בגובה האמצעי של פלטת 96 בארות. בדיקות dynamic light scattering שימשו לקביעת הקוטר ההידרודינמי של הננו-חלקיקים שנוצרו. מחקרי יציבות אישרו את היציבות לטווח ארוך של הננו-חלקיקים בשימוש הן בניסויים מבוססי מים והן בניסויים מבוססי מצע תרבית תאים.

מיקרוסקופיה קונפוקלית בלייזר הראתה ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים הטוענים נוגדנים ל-EOT three הקשורים באופן ספציפי לפני השטח של תאי EOL one. כאשר נעשה שימוש בנוגדנים ל-NG two, הם נקשרו באופן ספציפי לפני השטח של neurospheres של BSG. הננו-חלקיקים הביו-פונקציונליים הצליחו לסמן פלואורסצנטית אוכלוסייה של תאים ממוקדים, כפי שנמדד באמצעות ציטומטריית זרימה.

בנוסף, הננו-חלקיקים היו מסוגלים להתמקד בתת-אוכלוסייה ספציפית של תאים בתוך תערובת, אפילו ביחסי תאי מטרה לתאי בקרה נמוכים. לבסוף, ננו-חלקיקים עם פונקציונליזציה ביולוגית הגבירו את ניגודיות ה-MRI של התאים המותקפים; תאים שטופלו בננו-חלקיקים הטוענים nng ושני נוגדנים הראו היפר-אינטנסיביות ברצפי T one weighted בהשוואה לתאים שטופלו בחלקיקי בקרה.

בניגוד לכך, שתי הננו-חלקיקים של A NNG הראו היפואינטנסיביות (hypo intensity) ברצפים בעלי משקל T2 בהשוואה לחלקיקי הביקורת. ברגע שהשיטה נשלטת. ניתן להשלים את הסינתזה של ננו-חלקיקי כחול פרוסיה (Prussian blue) ביו-פונקציונליים תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי.

בדומה להליך זה, ניתן לבצע פונקציונליזציה ביולוגית של הננו-חלקיקים באמצעות ביופולימרים שונים וליגנדים למטרה, כדי לחקור מחלות ומצבים רפואיים חדשים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הסינתזה של ננו-חלקיקי Prussian blue עבור יישומים של פלואורסצנציה והדמיה לסמימון אוכלוסיות של תאים. אל תשכחו להקפיד על הנחיות הבטיחות ועל נהלי העבודה הסטנדרטיים לביצוע מחקרים במגנט MRI קליני.