הסתיידות של לתאי השריר החלק בכלי הדם והדמיה של אבי העורקים הסתיידות ודלקת

המטרה הכללית של הליך זה היא להדמות ויזואלית הסתיידויות של כלי הדם באבי העורקים ex vivo ולמדל הסתיידויות כלי דם in vivo באמצעות תאי שריר חלק ראשוניים של אבי העורקים של עכברים שהוצמחו בתרבית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של מחלות כלי דם על ידי אספקת מודל in vitro לחקר המנגנונים המולקולריים של הסתיידויות כלי דם, ומאפשרת הערכה של הסתיידויות כלי דם ודלקת של מקרופאגים in vivo. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות רגיש ומיקום משותף (co-localization) של פעילות מקרופאגים עם משקעי סידן בנגעים אתרוסקלרוטיים, אפילו בשלבים מוקדמים של המחלה.

בנוסף לקייטלין ולמדריך, את ההליך זה יעגים רוברט טיינש, טכנאי במעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך, חטה את הזנב באמצעות תחבושת אלכוהול ואתר את ורידי הזנב באופן צדי. לאחר מכן, הפעל לחץ קל קדימה על המזרק בזמן שהמחט מדגם 30 מוכנסת לתוך הזנב ללא התנגדות.

לאחר מכן, מזריקים 100 µL של calcium NIR ו/או 100 µL של cathepsin NIR בקצב קבוע. מוציאים את המחט לאחר חמש שניות, וקוטפים את אבי העורקים 3 עד 24 שעות לאחר ההזרקה. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מסירים את הפריתנאום כדי לחשוף את איברי הבטן.

לאחר מכן, הסר את איברי מערכת העיכול תוך הקפדה שלא לחתור את האורטה. לאחר מכן, בצע חתך צידי בסרעת הקדמית והמשך בחיתוך לאורך הבטן. בעזרת מספרי ניתוח, שחרר את כלוב הצלעות על ידי חיתוך דפנות הצלעות והסרת הרקמה הרכה הדבוקה לחלק העליון של עצם החזה.

לאחר מכן הסר את כלוב הצלעות וחשוף את הריאות. הסר את הריאות בזהירות. לאחר מכן הסר בזהירות את הקנה ואת הוושט, תוך הבטחה שהאאורטה תישאר שלמה.

לאחר מכן, הסירו את הרקמות הרכות המקיפות את האורטה, מהפיצול האילי (iliac bifurcation) ועד לקשת האורטה. היזהרו בעת הסרת השומן הפרי-אורטלי. לאחר מכן, הסירו את השומן ושאריות הרקמות הרכות המקיפות את האורטה התורקית ואת הענפים הגדולים של קשת האורטה.

בשלב הבא, הסר את הבלוטה התימוסית. כעת הסר את הלב מחלל החזה על ידי ניתוק זהיר מהאורטה הפרוקסימלית. לאחר מכן, בצע חיתוך של האורטה הדיסטלית בפיצול האיליאקי.

באמצעות מחט אינסולין, הזרק תמיסת סליין נורמלית לאורטה, מקשת האורטה, כדי לשטוף את תאי הדם שנותרו. נתק את האורטה יחד עם כלי הדם של קשת האורטה והוצא אותה לחלוטין מהגוף. הנח את האורטה בתמיסת סליין נורמלית על קרח עד למועד הדימוי.

בשלב זה, העבירו את אבי העורקים ל-HBSS קר עד לסיום הדיסקציות. בתוך מנדף סטרילי לתרביות רקמה, העבירו את אבי העורקים לתמיסת העיכול של אבי העורקים בצלחות תרבית רקמה בגודל 35 X 10 millimeter. לאחר מכן, דגרו אותם בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך 30 דקות תוך כדי נדנוד עדין לסירוגין.

לאחר העיכול, האורטות צריכות להציג מראה נמתח או פרום. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסר את שכבת ה-adventitia החיצונית של האורטה תוך שמירה על השכבה המדיאלית שלמה. לשם כך, קלף את השכבה החיצונית של האורטה מקצה אחד והסר אותה מהשכבה המדיאלית שמתחתיה בדומה להסרת גרב.

לאחר הסרת השכבה החיצונית (adventitious layer), דגרו את האורטה שנותרה בצלחת תרבית חדשה עם מצע גידול לתאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר מכן, חתכו את האורטה לטבעות ברוחב של 1 עד 2 מילימטר. העבירו את הטבעות לצלחת תרבית רקמה חדשה עם תמיסת עיכול לאורטה ודגרו בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור עדין לסירוגין למשך 120 דקות.

במהלך הדגירה, שאבו את התמיסה מעלה ומטה מספר פעמים כדי להחזיר את התאים לסמיכה. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטר של מצע תרבית תאים חם לתמיסת העיכול והעבירו אותה לפרועת קונית של 15 מיליליטר. סבבו את הפרועת בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-200 G. לאחר מכן, שאבו את המצע והחזירו את התאים לסמיכה בנפח הרצוי של מצע תרבית תאים.

כדי להשרות הסתייכות בתאי שריר חלקים של כלי דם, העבירו את התאים לפלטת תרבית בעלת שישה בארות והמתינו להיצמדותם. לאחר מכן, האכילו שוב את התאים במצע הסתייכות. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שבעה ימים לפחות.

לאחר מכן, שאבו את המצע מלוח תרבית התאים. שטפו את התאים פעם אחת במים מיוננים. קבעו את התאים על ידי הנחתם ב-1 ml של פורמלין 10% בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

לאחר מכן, הסירו את הפורמלין ושטפו את התאים המקובעים במים מזוקקים למשך חמש דקות. לאחר מכן, דגרו את התאים במילליטר אחד של תמיסת silver nitrate בריכוז 5% תחת נורה של 60 עד 100 וואט למשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן, שאבו את תמיסת ה-silver nitrate ושטפו במים מזוקקים למשך חמש דקות.

לאחר חמש דקות, הסירו את הכסף שלא הגיב על ידי הנחת התאים בתוך מיליליטר אחד של תמיסת 5% sodium thiosulphate במים מזוקקים למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים במים מזוקקים למשך חמש דקות. התאים שנצבעו בשיטת von Kossa מוכנים כעת לדימות באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך סטנדרטי.

באיור זה, עכברים מסוג wild type, עכברי MGP knockout ועכברי LDLR knockout קיבלו הזרקות של calcium NIR ו-Cathepsin NIR דרך וריד הזנב, והאורטות נאספו 24 שעות לאחר מכן ונבחנו באמצעות דימוי פלואורסצנציית NIR. עכברי wild type כמעט ואינם מראים הסמכה של האורטה או נוכחות של מקרופגים. האורטות מעכברי LDLR knockout מראות הסמכה נרחבת הממוקמת יחד עם הצטברות של מקרופגים.

לעומת זאת, לעכברי knockout של MGP יש הסמכה של אבי העורקים המתרחשת בהיעדר חדירה של מקרופאגים. בניסוי זה, VSMCs של אבי העורקים שגודלו בתרבית בודדו מעכברי knockout של MGP והודבקו באדנו-וירוס המבטא GFP או MGP. VSMCs של אבי העורקים שבודדו מעכברי wild type עברו טרנספקציה עם siRNA scrambled של בקרה או siRNA המכוון ל-MGP.

תאים גודלו במצע השכרה A למשך שבעה ימים, ולאחר מכן קובעו ונצבעו בשיטת von Kossa. צביעת הסידן נכוונתה כמותית באמצעות תוכנת ImageJ לאחר חיסור הרקע. לאחר פיתוחן, טכניקות אלו אפשרו למדענים לצלם תמונות של טרשת עורקים והסתייכות כלי דם ex vivo.

וכדי למדל הסתיידות כלי דם in vitro. דבר זה פותח את האפשרות לבדיקת ההשפעות של טיפולים תרופתיים חדשניים על מחלות כלי דם. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן בידוד אביונים לצורך הפקת תאי שריר חלקם של כלי דם אאורטליים ראשוניים מעכברים, ויזואליזציה של פלאקים אתרוסקלרוטיים באמצעות גששים של דימות פלואורסצנטי בבסמיות ערוך-אינפרא-אדום, וויזואליזציה של שרירים חלקים של כלי דם מסתיידים in vitro.