האסיפה והיישום של 'טבעות Shear': מודל האנדותל חדשני Orbital, חד-כיוונית תקופתית נוזלי זרימת מתח שאר
31 באוקטובר 2016
ידוע כי רמות ודפוסים שונים של גזירה נוזלית מווסתים את ביטוי הגנים האנדותליים, הפנוטיפ והרגישות למחלות. אנו דנים בהרכבה ושימוש ב'טבעות גזירה': מודל המייצר דפוסי מתח גזירה חד-כיווניים ותקופתיים. טבעות גזירה פשוטות להרכבה, חסכוניות ויכולות לייצר תשואות תאים גבוהות.
המטרה הכללית של מודל זה היא ליצור שיטה פשוטה וכלכלית למחקרי זרימה מחזורית של נוזלים ומאמץ גזירה In Vitro על תאי אנדותל. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה של תאי אנדותל, כגון כיצד גזירה מחזורית משפיעה על צורתם, מבנהם ותפקודם של תאי אנדותל.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת במכשיר לתרבית רקמות המורכב באופן פשוט, המספק שטחי פנים גדולים יחסית להערכת תגובות תאיות. מר לוק וייט, סטודנט לרפואה במעבדתי, ידגים הליך זה. התחילו את הפרוצדורה באמצעות תוכנת מצגות ליצירת תבנית לבניית טבעת גזירה (shear ring), עם קווי מתאר חיצוניים של 150 millimeter וקוטר פנימי של 100 millimeter הממוקם במרכז המעגל של 150 millimeter.
הדפיסו את התבנית על דף נייר לבן בגודל A4. בעבודה תחת מסיס עם אוורור נאות ובמספר כפפות, העבירו בעזרת פ pipette 10 millimeter של methylene chloride לתוך Petri dish מזכוכית בנפח 150 millimeter. קריטי להשתמש בצלחת מזכוכית מכיוון ש-methylene chloride ממיס את רוב סוגי הפלסטיק.
יש להניח צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 150 מילימטר על תבנית הגזירה החיצונית. השתמש בכלי רוטטרי כדי לקדוח חור בקוטר 3 מילימטר במרכז צלחת של 100 מילימטר. הסר את כל נשורי הפלסטיק שנוצרו במהלך הקידוח.
בעודכם מחזיקים את צלחת הפטרי בגודל 100 millimeter ביד עם כפפה, הפכו אותה וטבלו את הקצה העליון של הצלחת בתוך שלולית של methylene chloride למשך כשלושה שניות. הניחו ל-methylene chloride עודף לטפטף מהצלחת בגודל 100 millimeter, ולאחר מכן העבירו במהירות את קצה הצלחת הרטוב למרכז הצלחת בגודל 150 millimeter. יישרו בזהירות את הצלחת בגודל 100 millimeter על גבי התבנית המסומנת.
סובב בעדינות את הצלחת בקוטר 100 millimeter עם השעון ונגד השעון מספר פעמים כדי להבטיח היצמדות טובה לצלחת בקוטר 150 millimeter. לאחר שה-methylene chloride התייבש, הפוך את צלחות הפטרי המחוברות ובדוק בזהירות את נקודות המגע. אם לא נוצר אטם הדוק לחלוטין, הזרק 0.5 milliliters של methylene chloride דרך החור בקוטר 3 millimeter באמצעות פיפטה להעברה.
הרימו את הצלחת וסובבו אותה בעדינות כדי לאפשר למתילן כלוריד להגיע לקצה. לאחר שווידאתם שנוצר אטם הדוק בין שתי צלחות הפטרי, אטמו את החור בצלחת של 100 מילימטר על ידי מריחת חרוז של 3 מילימטר של חומר איטום מסיליקון. באמצעות כלי רוטטורי המצויד בראש חיתוך שטוח, חתכו את החלק העליון (3 סנטימטר) של מבחנת תרבית רקמות מפוליסטירן מסוג conocole בקוטר 15 מילימטר, כך שיישאר לפחות סנטימטר אחד מהמבחנה מתחת למכסה.
השתמש בצדו השטוח של ראש החיתוך כדי להחליק את קצה השפופרת החתוכה עד שיהיה חלק ושטוח. הסר רסיסי פלסטיק שנוצרו כתוצאה מהשיוף. בעזרת טוש, שרטט את קצה שפופרת ה-concole בנפח 15 milliliter על מכסה הצלחת בקוטר 150 millimeter, במרחק של כ-0.5 centimeters מקצה הצלחת.
קדחו חור בתוך העיגול ששורטט, תוך השארת שוליים של כ-one to two millimeters מקצה העיגול. הניחו את החלק העליון הגזור של שפופרת ה-conocole מעל החור שנקדח. באמצעות פיפטת העברה, מרחקו כ-quarter milliliter, או 250 µL של methylene chloride לקצוות הגזורים של שפופרת ה-conocole כדי להדביק את שפופרת ה-conocole למכסה בגודל 150 millimeter.
לבסוף, אטמו את המכסה של ה-150 millimeter אל הדיש של ה-150 millimeter על ידי מריחת פס של חומר איטום סיליקון בעובי של 1 millimeter מסביב לקצה הפנימי של פטריית המעבדה העליונה. מוצג תרשים של טבעת איטום מורכבת. הצבע הכחול מייצג את האזור שבו זרעו תאי אנדותל.
החצים האדומים החיצוניים והפנימיים מצביעים על התנועה המסלולית של טבעת הגזירה והמדיה בתוך טבעת הגזירה כאשר היא מונחת על מנער מסלולי (orbital shaker). הכינו את הסטריליזציה על ידי פיפטא של כ-10 millimeters של PBS לתוך טבעת הגזירה שנוצרה acabado, דרך פתח מבחנת ה-15 milliliter conocole. סובבו את הנוזל כדי להסיר שאריות כלשהן מתוך טבעת הגזירה.
הסיר את ה-PBS באמצעות פיפט פסטור ושואב ואקום. חזור על שטיפת ה-PBS עד להסרה מלאה של כל השאריות. כדי לעקר את טבעת הגזירה, יש להשתמש בשילוב של שטיפה ב-70% ethanol וקרינת UV.
שחררו את הפקק המאוורר, העבירו באמצעות פיפט כ-10 milliliters של 70%ethanol דרך פתח הגישה והבריגו את הפקק חזרה. סובבו והפכו את טבעת החיתוך מספר פעמים כדי להבטיח שפנים טבעת החיתוך נשטפו ביסודיות. תחת מנדף לתרביות רקמה, שאבו את ה-70%ethanol העודף.
בעזרת בקבוק התזה, רססו ביסודיות את פתח הגישה ואת הפקק ב-70% ethanol. לאחר מכן, הניחו את טבעת הגזירה (shear ring) ואת הפקק תחת קרינת UV במנדף לתרביות רקמה עד לייבוש מלא. ברגע שטבעת הגזירה יבשה, הבריגו את הפקק בחזרה.
יש לאחסן את טבעות הגזירה המעוקרות בטמפרטורת החדר עד לשימושן בזריעת תרבית תאים. כדי להתכונן למחקר מאמץ גזירה, יש לזרוע תחילה תאי אנדותל בטבעות גזירה מעוקרות בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי לתרבית תאים. יש להמתין עד שהתרבית תגיע למצב של התמזגות (confluency) לפני תחילת מחקרי הזרימה.
כאשר התאים הגיעו למצב של התמסכות (confluency), הניחו את טבעות הגזירה הניסיוניות על מנער אורביטלי הממוקם במדף התחתון של האינקובטור כדי למזער עומסי מדף ורטט. הניחו את טבעות הגזירה של קבוצת הביקורת הסטטית בתוך אותו אינקובטור. השאירו את טבעות הגזירה על המנער למשך הזמן הרצוי של החלת מאמץ הגזירה.
לאחר ששכבות התאים נחשפו למאמץ גזירה למשך הזמן הרצוי, הוציאו את טבעות הגזירה מהאינקובטור. הסירו את מכסה טבעת הגזירה ואספו את התאים ו/או את המצע לצורך ניתוח נקודת הסיום הרצויה. שימו לב כי לאחר פתיחת טבעות הגזירה, החוקרים יכולים לקצור תאים ומצע לניתוח באמצעות מספר שיטות.
מוצגים תוצאות מייצגות של מראה של שכבות מונו של תאי אנדותל של המוח האנושי מסוג CMEC D3 בטבעות גזירה לאחר 48 שעות של גזירת נוזלים מחזורית או חשיפה סטטית; נצפה כי יישור התרבית אינו תמיד מקבילי לכיוון הזרימה המסומן על ידי החיצים. חלק מהתגובות לגזירה מחזורית מוצגות בשכבות מונו של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של רשתית חולדה. 72 שעות של גזירת נוזלים מחזורית בטבעות גזירה הביאו להפחתה משמעותית במולקולת היצמדות של טסיות-תאי אנדותל ביחס לבקרת העמסה של Beta-actin.
ברגע שהשיטה נלמדת, ניתן להכין מספר טבעות גזירה (Shear Rings) בתוך כသုံး שעות אם הפעולה מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור ליישר בזהירות את הכלי הפנימי עם הכלי החיצוני, ולהבטיח שנוצר ביניהם איטום הדוק. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הבנייה והשימוש בטבעות גזירה כשיטה פשוטה לביצוע מחקרי זרימה תקופית של נוזלים ומאמץ גזירה In Vitro על תאי אנדותל. אין לשכוח שעבודה עם מתילן כלוריד עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה תחת מנדף כימיים, בעת ביצוע שלבים הדורשים זאת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מודל המכונה 'shear rings', היוצר תבניות מחזוריות של מאמץ גזירה חד-כיווני לבחינת תאי אנדותל. השיטה פשוטה, חסכונית ומניבה מספר גבוה של תאים, ובכך היא מקלה על המחקר של פיזיולוגיית תאי האנדותל.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פיזיולוגיה של תאי אנדותל
- מאמץ גזירה של נוזלים
- מודלים חוץ גופיים (In Vitro)
רקע
- מאמץ גזירה של זרימה משפיע על ביטוי גנים באנדותל ועל הרגישות למחלות.
- הבנת השפעות מאמץ הגזירה היא קריטית עבור הביולוגיה של כלי הדם.
- ייתכן ששיטות נוכחיות חסרות יעילות או סובלות ממורכבות.
- טבעות גזירה מספקות גישה חדשנית לחקר השפעות אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה חסכונית לחקר זרימה מחזורית של נוזלים.
- בחינת השפעת גזירה מחזורית על מורפולוגיה ותפקוד של תאי אנדותל.
- העמקת ההבנה לגבי תגובות של תאי אנדותל לגירויים מכניים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבה של תבנית לבניית טבעת גזירה.
- שימוש במכשיר לתרבית רקמות להערכה של שטח פנים גדול.
- החלת זרימה תקופתית של נוזלים על תאי אנדותל.
- הדגמת הפרוטוקול על ידי סטודנט לרפואה.
תוצאים עיקריים
- טבעות גזירה מייצרות ביעילות תבניות מבוקרות של מאמץ גזירה.
- השיטה מאפשרת הערכה משמעותית של התגובה התאית.
- ניתן להשיג תנובאי תאים גבוהים באמצעות טכניקה זו.
- גזירה מחזורית משפיעה על צורתם ותפקודם של תאי אנדותל.
מסקנות
- טבעות גזירה הן כלי בעל ערך למחקר אנדותליאלי.
- מודל זה יכול לקדם את ההבנה של הפיזיולוגיה האנדותליאלית.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל שיטה זו למגוון יישומים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תגובות של תאי אנדותל למאמץ גזירה מחזורי הן קריטיות להבנת הפתופיזיולוגיה של כלי הדם ולזיהוי מטרות תרופתיות רגישות למכניקה. מודל טבעת הגזירה מספק מערכת in vitro ניתנת להרחבה ושחזור, המאפשרת הערכה בקיבולת גבוהה של פנוטיפים של אנדותל תחת תנאים המודינמיים מבוקרים. דבר זה תומך בתיקוף מטרות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים בתוכניות לגילוי תרופות קרדיווסקולריות, על ידי קישור דינמיקת זרימת נוזלים למדדים מולקולריים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מסלולי העברה מכנית (mechanotransduction) אנדותליאליים תחת דפוסי גזירה פיזיולוגיים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות המגיבות לגזירה באמצעות פנוטיפים מדידים של היצמדות ויישור.
- ערך חיזוי: מקל על סריקה פנוטיפית של תרכובות המווסתות תגובות אנדותליאליות לזרימה מחזורית.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מספקת פלטפורמה סטנדרטית עם שטח פנים גדול להיווצרות עקבית של שכבה אחת של תאי אנדותל.
- יכולת הרחבה: מאפשרת יצירה של מספר חזרות לבדיקות תגובה למינון ומסלול זמן תחת כסחף אורביטלי.
- פלט כמותי: מאפשרת מדידה של שינויים תלויי-כסחף בביטוי של מולקולות היצמדות בין טסיות לאנדותל כמדד תפקודי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תנאי גזירה פתופיזיולוגיים המעורבים בדלקת כלי דם ובטרומבוזה.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים in vitro לבין תפקוד לקוי של האנדותל in vivo באמצעות סמנים ביולוגיים מדידים, כגון downregulated של PECAM-1.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מסייע בתעדוף מטרות על ידי ביסוס קשרים סיבתיים בין דפוסי מאמץ גזירה לבין שינויים בפנוטיפ האנדותל.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מודל טבעת הגזירה משתלב ברצף הגילוי המוקדם, ותומך בזיהוי מטרות מונחה-השערה ובתיקוף פרה-קליני של תרופות למערכת כלי הדם באמצעות אספקת גירוי מכני רלוונטי פיזיולוגית.
- ביולוגיה של התגליות: מאפשרת בדיקת השערות של מסלולים רגישים למסחרור בפיזיולוגיה אנדותליאלית באמצעות זרימה מחזורית מבוקרת.
- סריקה: מספקת נקודות קצה כמותיות וניתנות לשחזור של היצמדות ומורפולוגיה, המתאימות להערכת ספריות של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות מנורמלות (למשל, יחסי PECAM-1 ל-beta-actin) המאפשרות השוואה בין תנאים ובחירת תוצאות חיוביות (hits).
- מחקר טרנסלציונלי: תומכת בקידום מבוסס-סמנים ביולוגיים על ידי מידול דפוסי מסחרור הקשורים להפעלה או לתפקוד לקוי של האנדותל.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה מערכת מודולרית בעלות נמוכה הניתנת להתאמה לסוגים שונים של תאי אנדותל ולצוותי פרויקטים, לשימוש מתמשך בתוכניות של מכנוביולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתגובות אנדותליאליות לכוחות המודינמיים באמצעות פרופילי גזירה תקופתיים ומוגדרים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה של הבדיקה ושמירה על סטריליות באמצעות הרכבה פשוטה והכלה של נוזלים באטימה מסיליקון.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי מתן תובנה מוקדמת לגבי הסיכון ההמודינמי של יעדים וסקולריים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מסלולים רגישים למכניקה (mechanosensitive) בהתאם לסיכון, בהתבסס על תוצאים פנוטיפיים תלויי-גזירה.
שיקולי יישום
- דורש טכניקה אספטית והיכרות עם הדבקה מבוססת ממס באמצעות methylene chloride תחת מנדף כימיים.
- תלוי בגישה למנערים אורביטליים התואמים לסביבת אינקובטור עבור יישום כוחות גזירה לטווח ארוך.
- מחייב זריעה סטנדרטית של תאים והערכת התמלאות (confluency) כדי להבטיח חשיפה ניתנת לשחזור לכוחות גזירה.
- כולל שיקולים של תאימות חומרים, שכן methylene chloride פוגע בפלסטיק ומצריך שימוש בזכוכית או במצעים עמידים.
- מוגבל לעוצמות ותדרי גזירה שניתן להשיג באמצעות תנועה אורביטלית; אינו מתאים לסימולציות של זרימה טורבולנטית או לתדרים גבוהים.
