ליפיד הפקת וניתוח שיטה לאפיון קרקע חיידקים בניסויים עם דוגמאות רבות

מטרת סרטון זה היא לתאר שיטה המגבירה את התפוקה תוך איזון בין המאמץ לדיוק בחילוץ ליפידים מממברנות של תאי מיקרואורגניזמים, לשימוש באפיון של ליפידים כוללים ושל השפעיות היחסיות של ליפידים סמן, במטרה לקבוע את מבנה הקהילה המיקרובית בקרקע ובמחקרים הכוללים דגימות רבות. בשטח, עליכם להתחשב בהטרוגניות של הקרקע בעת איסוף דגימות הקרקע, כך שהן ייצגו את האתר שלכם. כדי לשמר את הקהילה המיקרובית בעת הדגימה, יש להוביל את הדגימות מהשטח על קרח.

עם החזרה למעבדה, הסירו שורשים ואבנים והפרידו גושים באמצעות נפה גסה. פעולה זו משמשת גם להומוגניזציה של הדגימה. הכינו את הדגימות לתהליך של ייבוש בהקפאה על ידי הנחת תתי-דגימות במכלים מתאימים, ובצעו ייבוש בהקפאה בהקדם האפשרי.

לאחר ייבוש קר של הדגימות, יש לאחסן את הקרקעות במיכל אטום עם חומר מייבש עד לשלב המיצוי. מומלץ לאחסן קרקעות שעברו ייבוש קר בטמפרטורה של 80- °C. כהכנה למיצוי, הוצא את הקרקעות המיובשות מהאחסון וגרס אותן. שיטות גריסה כוללות כדורית (ball mill), מד-כדורים (ball meter), או מכתש ועלי.

לאחר גריסת הקרקע, הומוגניזו שוב את דגימות הקרקע באופן יסודי ואחסנו אותן במקפיא. כל כלי המעבדה חייבים להיות נקיים להפליא. שאריות של דטרגנט, גריז או לכלוך עלולות להשפיע על התוצאות ולהופיע כשיא (peak) בכרומטוגרם הסופי של ה-GC.

המיצויים מבוצעים באנבובי צנטריפוגה מ-Teflon בנפח 30 מיליליטר, אותם יש לשטוף בממס. הוסף שני עד שלושה מיליליטר של hexane לאנבוביים ובצע ערבוב ב-vortex למשך מספר שניות. העבר את ה-hexane למבחנה אחרת ובצע ערבוב ב-vortex.

ניתן להשתמש בשני עד שלושה מיליליטרים של hexane כדי לשטוף באופן סדרתי שש מבחנות. יש לאחסן את המבחנות השטופות ב-hexane כשהן הפוכות בתוך מapay, ולהשליך את ה-hexane המשומש למכל פסולת מתאים. ניתן לחמם כלי זכוכית בתנור מעמם (muffle) או לשטוף אותם בממס מיד לפני השימוש.

שריפה במנור (Muffling) מבטיחה את ניקיון כלי הזכוכית באמצעות חמצון של שאריות בטמפרטורה גבוהה. עטפו את כלי הזכוכית בשתיים עד שלוש שכבות של נייר אלומיניום והניחו אותם בתנור השריפה (muffle furnace). הגדירו את הטמפרטורה ל-450 °C, ולאחר שהתנור הגיע לנקודת ההגדרה, השריו למשך 4 1/2 שעות לפחות.

יש להמתין לשעה אחת לפחות לקירור לפני ההוצאה מהתנור. יש לסמן ולשקול צינורות טפלון שנשטפו בהקסאן. הוסף דגימות קרקע לתוך צינורות צנטריפוגה מטפלון ושקול שוב למדידת מסת הקרקע.

הכינו תמיד לפחות שני דגימות ביקורת (blanks) לכל סדרה, וכללו סטנדרט לבדיקה, עדיף קרקע שחולצה בעבר, אם ברצונכם לוודא שהחילוץ התבצע כהלכה. חילוצי ליפידים. הכינו שלוש פיפטות רב-פעמיות בנפח 5 עד 10 מיליליטר עבור בופר פוספט, כלורופורם ומתנול.

כלורופורם הוא נוזל דחוס מאוד בעל מתח פנים נמוך. הקפידו כי הכמות הנמזגת תהיה מדויקת ועקבית. שמרו על בקבוק מלא בלפחות מחצית מהנוזל.

בתוך מCה מנדף, הוסיפו את הרכיבים לדגימת הקרקע שנמצאת בנבובת הטפלון לפי הסדר הבא: בופר פוספט, כלורופורמיל ומתנול. זוהי ההפקה הפיזית הראשונה של ליפידים מחומר הדגימה שלכם. המתכונים להכנת תמיסות הרכיבים כלולים בפרוטוקול הכתוב.

פרופורציות הממסים וסדר ההוספה חשובים להפרדה תקינה של הפאזות האורגנית והמימיות. יש להמתין שהקרקעות יירטבו לאחר הוספת הבאפר לפני הוספת הכלורופורם. במידת האפשר, ניתן לשלב את חומרי המיצוי ולהוסיפם כנפח בודד (aliquot) עבור המיצוי השני וכל מיצוי עוקב.

סגרו את מבחנות הטפלון בחוזקה וכסו אותן כדי להגן עליהן מאור. הניחו אותן על השייקר במצב אופקי תוך כדי וידוא שהן מקובעות היטב. בהגדרה של מהירות גבוהה, נערנערו במשך שעה.

בזמן ששפורי הבחירה נערערים, הכינו שני שפורי זכוכית ארוכים עבור כל דגימה באופן הבא. סמנו את השפחור, הוסיפו את אותו נפח של chloroform שהתוסף לקרקע ונפח שווה של phosphate buffer. לאחר הוצאת שפורי הטפלון מהמנערה בטמפרטורה של 25 °C, סבבבו את השפחורים בצנטריפוגה למשך 10 דקות במהירות של 2,500 RPM.

לאחר מכן, בתוך מפת ventilating hood כאשר האורות כבויים, העבירו את supernatant מהשפופרת מסוג Teflon לאחת השפופרות הארוכות. הפרדת הפאזות צריכה להיות גלויה בשפופרת הזכוכית. השכבה התחתונה מכילה את הממס האורגני, בעיקר כלורפורם, ואת הליפידים.

יש לחזור על פעולת המיצוי. שפכו את הנוזל העליון (supernatant) לתוך המבחנה השנייה שהוכנה קודם לכן. כעת ביצעתם מיצוי פיזי של הליפידים מהקרקע פעמיים.

עבור רוב סוגי הקרקעות, הדבר מספיק. סגרו היטב את כל מבחנות ה-long class באמצעות פקקים עם ציפוי טפלון והפכו אותן 10 פעמים כדי לערבב. הניחו למופעים להיפרד באמצעות כבידה במהלך הלילה.

יש להשאיר את הדגימות ללא הפרעה למשך לילה כדי להשלים את ההפרדה של שני הפאזים. לשם כך, יש לשמור את הדגימות בארון חשוך או מכוסות בנייר אלומיניום בטמפרטורת החדר. ניתן להשאיר את התמציות להיפרד במהלך סוף השבוע.

יום שני, בידוד ליפידים. ביום השני, השכבה המימית נשאבת והליפידים מרוכזים על ידי הסרת הממס במערכת אידוי בוואקום. ניתן לייבש את הדגימות גם על ידי הנחתן במקלח מים או חול והפעלת זרם עדין של חנקן.

הנוזל במבחנות אמור להיות כעת מופרד היטב וצלול ברובו. אם לא, או אם הממשק בין שתי השכבות עבה במיוחד, אפשרו להפרדה להימשך יום נוסף. הגדירו שואב ואקום במנדף.

זהו בקבוק עם זרוע צד המחובר למשאבת ואקום באמצעות צינור Tygon ופיפטת פסטור. כאשר המשאבה פועלת, השתמש בפיפטה כדי לשאוב את הפאזה המימית אל תוך הבקבוק. שאב את השכבה העליונה ואת הממשק.

זה יהיה בערך בשליש התחתון (2/3 מהדרך למטה). בצעו זאת עבור שתי עד שלוש קבוצות של מבחנות זכוכית. השכבה העליונה עשויה להכיל מספר חלקיקי קרקע.

הסר אותם אם הדבר אפשרי. שלב את התמצית מהסט השני ו/או השלישי של המבחנות עם זו שבשתיים הראשונות על ידי מזיגה זהירה. השתדל להשקיף מהמזיגה כל חומר מוצק, ושטוף את דפנות המבחנה על ידי סיבוב.

השתמשו בפיפטה נקייה עבור כל דגימה וחזרו על תהליך זה עבור שאר הדגימות. לאחר שמיצויים של הכלורופורם אוחדו והמתינו מספר דקות, בחנו את פני הנוזל. לעיתים קרובות, תיווצר שכבה דקה של שאריות מים.

אם קיים שארית, יש לשאוב אותה לפני ההמשך. מים שיישארו עלולים לתקוף קשרים כפולים של חומצות שומן, אך כמות קטנה מאוד אמורה להתאדות יחד עם הממסים תוך כדי ייבוש הדגימות. ייבשו את כל הדגימות באמצעות מכשיר האידוי בוואקום.

סגרו את המבחנות היטב ואחסנו במקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. יום שלישי, סאפוניפיקציה (סבון) ומתיליזציה. ראשית, הפעילו את מקבתי המים. בדקו את מפלס המים וכוונו את מקבת מים אחת ל-95 מעלות צלזיוס ואת מקבת מים שתיים ל-80 מעלות צלזיוס. בעזרת פפטה רב-פעמית (re-pipette), הוסיפו 1 מ"ל של ריאגנט הסאפוניפיקציה, Reagent 1, לליפידים המיובשים.

סגרו את המכסים היטב, ערבבו קצרות במערבל וורטקס (vortex) והניחו על מעמד. לאחר השלמת שלב זה, הכניסו את מעמד המבחנות למקלח מים בטמפרטורה של 95 °C והמתינו חמש דקות. הוציאו את מעמד המבחנות מהמקלח ובדקו שאין דליפות מהמבחנות.

דבר זה יתבטא בבועות העולות בשפופרת בדומה לקצף. הידקו מחדש או החליפו את הפקקים של השפופרות הדולפות. המשיכו לחמם את השפופרות באמבט המים למשך 10 דקות נוספות.

הורידו את הגדרת הטמפרטורה של מקלח המים ל-80 °C והמשיכו בדגירה למשך 15 דקות נוספות. הוציאו את המבחנות קררו אותן על ידי הנחת הסטנד בתוך תבנית עם מי ברז. אין להשתמש במי קרח.

לאחר שהדגימות התקררו, הוסיפו שתי מיליליטר של ריאגנט המתילציה, Reagent 2, לכל דגימה. שוב, סגרו את הפקק היטב וערבבו במערבל Vortex למשך חמישה עד 10 שניות. ייתכן שיתגלו מלחים גרנולריים כשקע בתמיסה, דבר שקורה לעיתים עקב עודף בריאגנטים.

הניחו את הסטנד במקלחת מים בטמפרטורה של 80 °C והדגירו למשך 10 דקות. הוציאו את סטנד המבחנות ממקלחת המים והניחו אותו באמבטיה של מי ברז לצורך קירור. נערו את הסטנד כדי להאיץ את תהליך הקירור.

באמצעות פיפט רב-פעמי (re-pipette), הוסיפו לכל מבחנה 1.25 milliliters של הקסאן ומתיל טרשיירי בוטיל אתר, Reagent 3, לצורך מיצוי הפאזה. סגרו את הפקקים היטב והניחו את המבחנות על שייקר למשך 10 דקות. לאחר הנעורה, השאירו את מדף המבחנות למשך 10 דקות כדי לאפשר את הפרדת הפאזות.

העבירו את השלב האורגני, המהווה כעת את השכבה העליונה, למבחנה קצרה באמצעות פיפטת פסטור. מומלץ להוציא את מרב הנוזל. כמויות קטנות מאוד של השלב המימי לא יפגעו בתהליך המיצוי.

חזרו על מיצוי הפאזה המימית על ידי הוספת Reagent 3, ניעור, המתנה להפרדת הפאזות והעברה של הפאזה העליונה. בהתאם למצב הפאזה התחתונה, ניתן לחזור על פעולה זו פעם נוספת, לסך הכל שלושה העברות. הוסיפו 3 milliliter של תמיסת השטיפה הבסיסית, Reagent 4, שהיא תמיסה מדוללת של נתרן הידרוקסיד, אל המיצויים במבחנות הקצרות.

סגרו את מבחנות הבדיקה היטב, ערבלו ב-vortex למשך 20 עד 30 שניות ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה למשך שלוש דקות במהירות של 2,000 RPM. לאחר הסבב, שאבו באמצעות פיפט פסטור נקייה את הפאזה האורגנית העליונה והעבירו אותה לבקבוק ענבר בנפח של ארבעה מיליליטר. היזהרו מאוד לא לשאוב חלק מהפאזה המימית.

השלב הבא הוא אידוי הממס עד ליובש במכשיר אידוי בוואקום. יום ארבע, הכנת התמציות לאנליזת GC. באמצעות הפיפטור, הוסף 100 µL של Reagent 3 לכל אחד מהמבחנות בנפח 4 mL המכילות את הפאזה המיובשת.

ערבבו את הדגימה במיקסר וורטקס (Vortex) ולאחר מכן הניחו לה לעמוד במשך 10 דקות. באמצעות הפיפטה השנייה, העבירו בזהירות את ה-FAMEs התלוים למבחנה ל-GC. הוסיפו מנה נוספת של הממס למבחנה בנפח של ארבעה מיליליטר וערבבו קצרה במיקסר וורטקס.

גלגלו את הבקבוק כדי להבטיח ששאריות ה-FAMEs שעל דפנות הבקבוק התמוססו. באמצעות הפיפטור השני, העבירו שוב את הממס לבקבוק ה-GC. השלימו את ההעברה על ידי הוספת מנה שלישית של ממס לבקבוק, ערבוב ב-vortex, והעברה לבקבוק ה-GC.

סגרו את המכס של מבחנת ה-GC ואחסנו במקפיא. אחסנו מבחנות GC סגורות במקפיא לפני הניתוח. ניתוח GC.

כדי להשתמש במערכת זו, יש לבצע את האנליזה באמצעות עמודת GC ספציפית. כרומטוגרף הגז מצויד במזרק split-splitless הכוללライנר זכוכית בעל קוטר פנימי של 4 מ"מ עם פלאג צמר זכוכית דה-אקטיבי. המזרק מכוון ל-250 °C ומופעל במצב של לחץ קבוע.

גז הנשא הוא מימן. חנקן ואוויר נדרשים כגזי תמיכה לגלאי. נעשה שימוש בעמודת Agilent Ultra 2.

אורך העמודה הוא 25 מטרים, עם קוטר פנימי של 2 מילימטרים ועובי שכבת פאזה נייחת של 33 מיקרומטר. הפאזה הנייחת בעמודה זו היא 5%phenyl, 95%methylpolysiloxane, הידועה גם כעמודה מסוג DB-5. לצורך ניתוח תמציות הליפידים, מוזרקת מנה של שני מיקרוליטר ביחס פיצול (split ratio) של 100:1, כאשר טמפרטורת התנור היא 170 מעלות צלזיוס. לאחר ההזרקה, התנור מתוכנת לעלות בחמש מעלות לדקה עד לטמפרטורה של 300 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להישמר בטמפרטורה זו למשך 12 דקות.

מבוצעות סדרת הזרקות לפי תקן ה-MIDI והתוצאות משמשות לביצוע התאמות בהתאם להוראות במדריך ה-MIDI. לאחר כיול בצורה זו, המערכת עשויה לדרוש התאמות מינוריות מדי פעם, אך בדרך כלל אמורה להשיג תוצאות טובות באמצעות פרמטרים אלה. מערכת ה-MIDI מפיקה דוח עבור כל דגימה, הכולל טבלה עם שורה אחת לכל שיא (peak) שזוהה.

התוכנה מדווחת על זמן השהייה בשיא (peak retention time), שטח השיא, זיהוי השיא, יחד עם ECL או אורך שרשרת מוערך, פרמטר המשמש לזיהוי שיאים, ומקדם תגובה (response factor), פרמטר המשמש לנורמליזציה של תנודות ותגובת הגלאי ביחס לזמן השהייה. ה-ECL מבטא היכן בתוך סדרה של FAMEs בעלי שרשרת ישרה כל FAME לא ידוע יוצא (elutes). כך לדוגמה, אם זמן השהייה של חומר לא ידוע יוצא באמצע הדרך בין שרשראות של 12 ו-13 פחמנים, ה-ECL ידווח כשרשרת של 12.5 פחמנים.

התוכנה משווה את ה-ECL של כל שיא לאלו של FAMEs במאגר נתונים, ובמקומות שבהם נמצאה התאמה היא מקצה את השם המתאים לדגימה הבלתי ידועה. במקרים שבהם לשני FAMEs במאגר נתונים יש ECLs קרובים מאוד, התוכנה מדווחת על שני השמות ומפרטת תחילה את הקרוב ביותר. ניתן לרכז את טבלאות הנתונים מהדוחות לתוך גיליון אלקטרוני או מאגר נתונים.

לאחר התאמה למקדם התגובה, ניתן להשוות את שטחי הפסגות לשטח הפסגה של סטנדרט חיצוני או פנימי כדי להגיע לריכוז של התמצית. על ידי חלוקה במסת הקרקע שהוצצה, ניתן להביע את הנתונים כמסת FAME לגרם קרקע, או, באמצעות שימוש במשקל המולקולרי של כל FAME, כננומול לגרם קרקע. ניתן לסכם את ה-FAMEs המשמשים כסמנים ביולוגיים כדי לקבל את הביומסה של קבוצות מיקרוביאליות (microbial guilds), וניתן לנתח קבוצות אלו בהמשך.

לדוגמה, כאן אנו רואים ערבות לא מודשנות בעלות יותר biomass של FAME מאשר ערבות מודשנות. לשתיהן יש יותר biomass מאשר לשדות תירס סמוכים. כמו כן, FAMEs מקושרים לקבוצות תפקודיות ספציפיות כמו פטריות או חיידקים.

קשרים אלו ספציפיים למערכת אקולוגית מסוימת, ולכן חשוב שלא להכליל אותם יתר על המידה. סוג זה של ניתוח מראה האם קבוצות מסוימות נפוצות יותר בסביבות מסוימות. במקרה זה, הפטריות נפוצות יותר בערבה שאינה מודשמת מאשר בשדה התירס.

ולבסוף, דרך נוספת לבחון את הרכב קהילת המיקרובים הכוללת היא להשוות באמצעות בחינה של השפע היחסי של כל ה-FAMEs בבת אחת, תוך שימוש בשיטות סידור (ordination) כגון סקלה רב-ממדית לא-מטרית, NMDS, או ניתוח רכיבים ראשיים, PCA. בסידור זה, קהילות מיקרוביאליות הדומות יותר יהיו קרובות יותר זו לזו. לכן, בנתוני הדוגמה שלנו, התירס והערבה הבלתי-מדשנת רחוקים מאוד זה מזה, בעוד שחלק מדגימות הערבה המדושנת בעלות קהילות מיקרוביאליות הדומות לאלו של התירס ואחרות דומות לערבה הבלתי-מדשנת.

קהילות מיקרוביאליות הן לעיתים קרובות משתנות מאוד אפילו בתוך סביבה אחת, ולכן הן לא תמיד יופרדו באופן נקי. לאחר צפייה בסרטון זה, על הצופה להחזיק בהבנה טובה של התהליך שבו מחלצים מהקרקע סמנים ביולוגיים ליפידיים (lipid biomarkers) מממברנות התאים של מיקרואורגניזמים. חילוץ חומצות שומן פוספוליפידיות הוא דרך יעילה, מהירה וזולה להערכת גילדות מיקרוביאליות וביומסה מיקרוביאלית כוללת, באמצעות זיהוי של סמנים ביולוגיים מיקרוביאליים ייחודיים.