שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להפיק ולנתח את כל הישויות המולקולריות העיקריות, כולל מטבוליטים פולריים וחצי-פולריים, ליפידים וחלבונים, מדגימה אחת באמצעות מיצוי פשוט ומפוצל ב-methyl-tributyl ether. בדרך כלל, מדענים מוצאים כי ניתוח של מספר מחלקות תרכובים מדגימה אחת הוא מאתגר. באמצעות מיצוי ה-MTBE שאנו מציגים כאן, ניתן למצות ולנתח מספר מחלקות תרכובים, כגון ליפידים, מטבוליטים וחלבונים, מדגימה אחת.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת להפיק באופן חסון את כל מחלקות התרכובים המולקולריים מכמות קטנה של מנת דגימה אחת. שיטה זו מסייעת במתן מענה לשאלות יסודיות בביולוגיה של מערכות, מכיוון שהיא מספקת את הבסיס הניסיוני לניתוח מולטי-אומיקס, על ידי אספקת פרקציות שניתן להשתמש בהן לניתוח באמצעות פרוטאומיקה, ליפידומיקה ומטבולומיקה. הפרוטוקול הבא מודגם באמצעות רקמת עלה של Arabidopsis.

Arabidopsis הם צמחים פורחים קטנים ממשפחת ה-Brassicaceae, וקרובים לכרוב. התחילו את ההליך על ידי קירור מקדים של מחזיקי מבחנות הומוגניזטור הרקמות בחנקן נוזלי למשך 10 דקות לפחות. הוציאו את הדגימות מהחנקן הנוזלי והניחו אותן במחזיקי המבחנות.

לאחר מכן, הוציאו את מחזיקי המבחנות מהחנקן הנוזלי. העבירו במהירות את מחזיקי המבחנות להומוגניזטור רקמות, והגדירו את ההומוגניזטור לטחינת החומר הביולוגי לאבקה דקה והומוגנית. עבור עלים, השתמשו ב-20 hertz למשך דקה אחת.

ניתן לשנות את זמן ומהירות ההומוגניזציה בהתאם לרקמה. ודאו כי אתם מבצעים הומוגניזציה עד שהדגימה המתקבלת הופכת לאבקה עדינה מאוד. כמו כן, יש לשמור על הדגימה קפואה בכל שלב של ההומוגניזציה.

הומוגניזו את הדגימות, ולאחר מכן הוציאו את הדגימות הביולוגיות ממחזיקי המבחנות. אם הן לא ישמשו באופן מיידי, מקמו אותן במקפיא של 80- מעלות צלזיוס עד לשלב המיצוי הבא. סמנו ארבע מבחנות מיקרוצנטריפוגה בעלות תחתית עגולה וסגירת בטיחות בנפח 2 מיליליטר עם מספר הדגימה.

קררו מראש את המבחנות ומספר שפכטלים על ידי טבילתם בחנקן נוזלי. לאחר שהמבחנות והשפכטלים קרים, הניחו את אחת המבחנות על מאזניים אנליטיים, והשתמשו בשפכטל כדי להעביר מנה של 25 milligrams של אבקת רקמה אל מבחנת המיקרוצנטריפוגה. רשמו את המשקל המדויק עבור כל דגימה, ולאחר מכן הניחו מיד את הדגימות בחנקן נוזלי.

בצע שלב זה במהירות כדי למנוע הפשרה של חומר הצמח. אחסן את הדגימות המחולקות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לשלב המיצוי. כדי להיערך למיצוי, קרר מראש את methyl tert-butyl ether, או את תערובת המיצוי של MTBE methanol, שהוכנה כפי שמתואר במסמך המצורף, במקפיא בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.

הוציאו את הדגימות המאליקוטיות, והוסיפו מיליליטר אחד של תערובת המיצוי שקולל מראש לכל מבחנה של דגימה. בצעו שלב זה במהירות. ל-MTBE צמיגות נמוכה והוא עלול לטפטף מקצה הפיפטה.

ערבבו כל דגימה באופן מיידי במערבל וורטקס עד שהרקמה תהיה הומוגנית היטב בתוך תערובת המיצוי. השאירו את המבחנות במעמד על שולחן העבודה עד שכל הדגימות יומצאו. שלב זה הוא קריטי.

כאן אנו משקיעים חלבונים ומנטרלים את פעילותם האנזימטית. דגרו את כל הדגימות על מנער אורביטלי במהירות של 100 RPM למשך 45 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בצעו סוניקציה לדגימות למשך 15 דקות באמבטT סוניקציה קר מאוד.

בשלב הבא, כדי לבצע הפרכת שברים באמצעות הפרדת פאזות, הוסיפו לכל מבחנה של דגימה 650 µL של תמיסה ביחס של שלושה ל-אחד של מים ומתנול. לאחר מכן, ערבבו באמצעות וורטקס למשך דקה אחת. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 20,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C.

לאחר שלב זה, יש לטפל במבחנות בזהירות כדי למנוע ערבוב של שני הפאזות הנוזליות ולהימנע מהפרעה למשקע השקוע. בשלב זה, קיימות שתי פאזות נוזליות מותרות עם משקע מוצק בתחתית המבחנה. הפאזה העליונה הבלתי פולרית מכילה ליפידים.

הפאזה המימית התחתונה מכילה מטבוליטים פולריים וחצי-פולריים. המשקע מכיל חלבונים, עמילנים ודופן התא. העבירו 500 microliters מהממס מהפאזה העליונה המכילה ליפידים אל נבובת מיקרוצנטריפוגה מסומנת בנפח 1.5 milliliter.

לאחר מכן, בעזרת פפטה של 200 microliter, הסירו בזהירות את שארית השכבה השומנית והשליכו אותה. כעת, העבירו 400 microliters מהממס מהשכבה התחתונה אל מבחנה של microcentrifuge בנפח 1.5 milliliter המסומנת. העבירו מנה נוספת של 200 microliters למבחנת micro-fuge לצורך ביצוע ניתוחים נוספים, כגון ניתוח מטאבוליטים מבוסס גז כרומטוגרפיה.

הסיר והשלך את שארית הפאזה המימית על ידי שאיבה של הנפח העודף בעזרת פפטה. לאחר מכן, כדי לשטוף את משקע החלבון-עמילן-דופן התא שהתקבל, הוסף 500 µL של מתנול ולאחר מכן ערבב במכשיר וורטקס למשך דקה אחת. סבב את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C.

יש לאדות את הממס מדגימות הליפידים באמצעות מאדה עם זרימת חנקן כדי למנוע מודיפיקציות חמצוניות של הליפידים. יש לנתח את הדגימות המיובשות שהתקבלו באופן מיידי. את הממס מהדגימות המימיות יש לאדות למשך הלילה בריכז vacuum ללא חימום.

ניתן לאחסן את הדגימות המימיות המיובשות למשך מספר שבועות במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני הניתוח. השביעה מחדש את פראקציות הליפידים המיובשות ב-400 µL של תמיסה של אצטוניטריל ל-2-פרופנול ביחס של שבעה לשלוש. העבר כמות מספיקה של נוזל לבקבוקונים מזכוכית וסגור אותם היטב.

לאחר מכן, הניחו את מבחנות הזכוכית במקרין דגימות אוטומטי מקורר בטמפרטורה של 4 °C. מזגו 2 µL לכל דגימה והפרידו את הליפידים בעמודת פאזה הפוכה C8 בטמפרטורה של 60 °C באמצעות מערכת UPLC בקצב זרימה של 400 µL לדקה. להפרדה הכרומטוגרפית השתמשו בפאזות הניידות המתוארות בטבלה 1 במסמך המצורף.

רכשו את ספקטראות המסות במצב יינון חיובי ושלילי באמצעות מכשיר MS מתאים המכסה את טווח המסות שבין 150 ל-1500 ביחס מטען-מסה. השעיה מחדש את הפאזה הפולרית ב-200 µL של תמיסה של מתנול בדרגת UPLC ומים ביחס של אחד לאחד. העבר כמות מספיקה של נוזל לבקבוקוני זכוכית וסגור אותם היטב.

לאחר מכן, הכניסו את מבחנות הזכוכית לדגמן אוטומטי מקורר, בטמפרטורה של 4 °C. הזריקו 2 µL מכל דגימה והפרידו את המטבוליטים בעזרת עמודת RP C-18 בטמפרטורה של 40 °C, באמצעות מערכת UPLC בקצב זרימה של 400 µL לדקה. השתמשו בפאזות הניידות להפרדה כרומטוגרפית לפי הפרמטרים המופיעים בטבלה 2 במסמך המצורף.

רכשו ספקטרומי מסה בסריקה מלאה במצב יינוט חיובי ושלילי באמצעות ספקטרומטר מסה מתאים, המכסה טווח מסות בין 50 ל-1500 ביחס מסה-למטען. לבסוף, בצעו מיצוי חלבונים, עיכול ואנליזה, כפי שמתואר במסמך המצורף. 25 milligrams של רקמת עלה של Arabidopsis נאספו, נטחנו ומולצו לפני שהועברו לשלוש פלטפורמות אנליטיות של UPLC-MS.

המטבוליטים הראשוניים והשניוניים הפולריים והחצי-פולריים נותחו מהפאזה הפולרית באמצעות UPLC-MS בעמודה C-18 בעלת פאזה הפוכה. כרומטוגרמות של שיא הבסיס (Base peak chromatograms) של ליפידים, המוצגות בפאנל העליון, ומטבוליטים חצי-פולריים, המוצגות בפאנל התחתון, נותחו במצב יינון חיובי. תרשים העוגה בפינה הימנית העליונה של כל כרומטוגרמה מראה את מספר הליפידים והמטבוליטים שזוהו ושויכו למשפחות כימיות שונות.

לדוגמה, 58 ליפידים שונים שויכו לקבוצת הטריאצילגליצרול, המסומנת בגרף העליון כ-TAG. מטבוליטים הידרופיליים יותר מfracion זה, כגון סוכרים וחומצות אמינו פולריות, שאינם מראים ספיחה טובה בחומר בעל פאזה הפוכה, ניתנים לניתוח בשיטות אנליטיות אחרות, כגון GCMS, או כרומטוגרפיית נוזלים באינטראקציה הידרופילית. החלבונים שחולצו מהמיצוי עברו עיכול בתמיסה, ונותחו באמצעות shotgun LCMS.

תרשים העוגה המוצג בפינה הימנית העליונה מצביע על מספר החלבונים שזוהו ושויכו לתהליכים ביולוגיים שונים. לדוגמה, 268 חלבונים שויכו לקטגוריית הלוקליזציה. לסיכום, ניתן לזהות באופן שגרתי יותר מ-200 סוגי ליפידים, 50 מטבוליטים חצי-פולריים מאושרים ואלפי חלבונים מדגימות בדומה לזו ששימשה בדוגמה זו.

בנוסף, השיטה הראתה ישימות רחבה בשימוש ברקמות, איברים וחומרי תרביות תאים שונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן למצות ולנתח את רוב התרכובות החיוניות מדגם בודד. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשמור על כל הדגימות במצב קפוא, לטחון את החומר כראוי ולהשתמש בממסים ובכימיקלים בדרגת ניקיון אנליטית.

לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בכל השיטות האנליטיות כדי לקבוע את ההרכב המולקולרי של הדגימות שהופקו.