שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לשחזר ולנתח את כל הישויות המולקולריות העיקריות, כולל מטבוליטים קוטביים וחצי קוטביים, ליפידים וחלבונים מדגימה בודדת באמצעות מיצוי אתר מתיל-טריבוטיל פשוט מקוטע. באופן כללי, מדענים מתקשים לנתח מספר מחלקות תרכובות מדגימה אחת. באמצעות מיצוי MTBE שאנו מציגים כאן, אתה יכול לחלץ ולנתח מספר מחלקות תרכובות, כמו שומנים, מטבוליטים וחלבונים מדגימה אחת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לחלץ בצורה חזקה את כל מחלקות התרכובות המולקולריות מכמות קטנה של דגימה בודדת. שיטה זו עוזרת לענות על שאלות בסיסיות בביולוגיה של מערכות, מכיוון שהיא מספקת את הבסיס הניסויי לניתוח מולטיומיקה, ומספקת שברים שניתן להשתמש בהם לניתוח על ידי פרוטאומיקה, ליפידומיקה ומטבולומיקה. הפרוטוקול הבא מודגם באמצעות רקמת עלה Arabidopsis.

Arabidopsis הם צמחים פורחים קטנים ממשפחת Brassicaceae, וקשורים לכרוב. התחל הליך זה על ידי קירור מראש של מחזיקי צינור הומוגנייזר הרקמות בחנקן נוזלי למשך 10 דקות לפחות. הסר את הדגימות מחנקן נוזלי והנח אותן במחזיקי הצינורות.

ואז הסר את מחזיקי הצינורות מחנקן נוזלי. הכניסו במהירות את מחזיקי הצינורות להומוגניזטור הרקמות, והגדירו את ההומוגנייזר לטחון את החומר הביולוגי לאבקה דקה והומוגנית. לעלים, השתמש ב -20 הרץ למשך דקה אחת.

זמן ההומוגניזציה והמהירות עשויים להשתנות בהתאם לרקמה. הקפד להומוגניזציה עד שהדגימה המתקבלת היא אבקה דקה מאוד. ויש לשמור את הדגימה קפואה בכל שלב של הומוגניזציה.

הומוגניזציה של הדגימות, ולאחר מכן הסר את הדגימות הביולוגיות ממחזיקי הצינורות. ואם לא ישתמשו בהם מיד, הכניסו אותם למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לחילוץ נוסף. סמן ארבעה צינורות מיקרו-צנטריפוגה עגולים עם תחתית עגולה של שני מיליליטר עם מספר המדגם.

יש לקרר מראש את הצינורות וכמה מרית על ידי טבילתם בחנקן נוזלי. לאחר שהצינורות והמרית מתקררים, הניחו את אחד הצינורות על איזון אנליטי והשתמשו במרית כדי להחדיר 25 מיליגרם של אבקת רקמות לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה. רשום את המשקל המדויק עבור כל דגימה, ולאחר מכן הנח מיד את הדגימות האליקוטיות בחנקן נוזלי.

בצע שלב זה במהירות כדי למנוע הפשרת החומר הצמחי. אחסן את הדגימות המצוטטות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד למיצוי נוסף. כדי להתכונן למיצוי, יש לקרר מראש את מתיל טרט-בוטיל אתר, או תערובת מיצוי מתנול MTBE, שהוכנה כמתואר במסמך הנלווה, במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס.

הוצא את הדגימות המצוטטות, והוסף מיליליטר אחד מתערובת המיצוי שהתקררה מראש לכל צינור דגימה. בצע שלב זה במהירות. ל-MTBE יש צמיגות נמוכה והוא יכול לטפטף מקצה הפיפטה.

מערבבים כל דגימה מיד על מערבל מערבולת עד שהרקמה הומוגנית היטב בתוך תערובת המיצוי. שמור את הצינורות במתלה על הספסל עד לחילוץ כל הדגימות. שלב זה הוא קריטי.

כאן אנו מזרזים חלבונים ומשביתים את פעילותם האנזימטית. דגרו את כל הדגימות על שייקר מסלולי ב-100 סל"ד למשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן סוניקציה של הדגימות למשך 15 דקות באמבט סוניקציה קר כקרח.

לאחר מכן, כדי לחלק לפי הפרדת פאזה, הוסף 650 מיקרוליטר של תמיסה של שלושה לאחד של מים ומתנול לכל צינור דגימה. לאחר מכן מערבבים על ידי מערבולת במשך דקה. צנטריפוגה את הדגימות במהירות של 20,000 פעמים גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר שלב זה, טפל בצינורות בזהירות כדי למנוע ערבוב של שני שלבי הנוזל ולהימנע משיבוש הגלולה המשקעת. בשלב זה, ישנם שני שלבים נוזליים קבילים עם כדור מוצק בתחתית הצינור. השלב העליון הלא קוטבי מכיל שומנים.

השלב המימי התחתון מכיל מטבוליטים קוטביים וחצי קוטביים. הגלולה מכילה חלבונים, עמילנים ודופן התא. העבירו 500 מיקרוליטר של הממס מהשלב העליון המכיל שומנים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה מסומן בנפח 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר, הסר בזהירות את שלב השומנים שנותר והשליך אותו. לאחר מכן, העבירו 400 מיקרוליטר של הממס מהשלב התחתון לצינור מיקרוצנטריפוגה מסומן בנפח 1.5 מיליליטר. העבר מנה נוספת של 200 מיקרוליטר לצינור מיקרו-פוגה כדי לבצע ניתוח נוסף, כגון ניתוח מטבוליט מבוסס כרומטוגרפיה של גז.

הסר והשליך את שארית השלב המימי על ידי פיפטינג מהנפח העודף. לאחר מכן, כדי לשטוף את כדור דופן החלבון-עמילן-תא המתקבל, הוסף 500 מיקרוליטר מתנול ולאחר מכן מערבל אותו למשך דקה אחת. צנטריפוגה את הדגימות במהירות של 10,000 פעמים גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

אידוי הממס מדגימות השומנים באמצעות מאייד זרימת חנקן כדי למנוע שינויים חמצוניים של השומנים. יש לנתח מיד את הדגימות המיובשות המתקבלות. אידוי הממס מהדגימות המימיות למשך הלילה ברכז ואקום ללא חימום.

ניתן לאחסן את הדגימות המימיות המיובשות במשך מספר שבועות במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני הניתוח. השעו מחדש את שברי השומנים המיובשים ב -400 מיקרוליטר של תמיסה של שבעה עד שלושה אצטוניטריל ל -2 פרופנול. מעבירים מספיק נוזלים לבקבוקוני זכוכית ומכסים היטב.

לאחר מכן, הכניסו את בקבוקוני הזכוכית לדגימה אוטומטית מקוררת בארבע מעלות צלזיוס. הזרקו שני מיקרוליטר לדגימה והפרידו את השומנים על עמודת פאזה C8 הפוכה המוחזקת ב-60 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת UPLC הפועלת בקצב זרימה של 400 מיקרוליטר לדקה. השתמש בשלבים הניידים המתוארים בטבלה 1 של המסמך הנלווה להפרדה הכרומטוגרפית.

רכוש את ספקטרום המסה במצב יינון חיובי ושלילי באמצעות מכשיר MS מתאים המכסה את טווח המסה בין 150 ל-1500 יחס מטען למסה. השעו מחדש את השלב הקוטבי ב-200 מיקרוליטר של תמיסה של מתנול אחד לאחד בדרגת UPLC למים. מעבירים מספיק נוזלים לבקבוקוני זכוכית ומכסים היטב.

לאחר מכן, הכניסו את בקבוקוני הזכוכית לדגימה אוטומטית מקוררת, ארבע מעלות צלזיוס. הזרקו שני מיקרוליטר מכל דגימה והפרידו את המטבוליטים על עמודת RP C-18 המוחזקת ב-40 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת UPLC הפועלת בקצב זרימה של 400 מיקרוליטר לדקה. השתמש בשלבים הניידים להפרדה כרומטוגרפית עם פרמטרים המופיעים בטבלה 2 של המסמך הנלווה.

רכוש ספקטרום מסה סריקה מלאה במצב יינון חיובי ושלילי באמצעות ספקטרומטר מסה מתאים המכסה טווח מסה בין 50 ל-1500 יחס מסה למטען. לבסוף, בצע מיצוי, עיכול וניתוח חלבונים, כמתואר במסמך הנלווה. 25 מיליגרם של רקמת עלי Arabidopsis נקטפו, נטחנו וחולצו לפני שהועברו לשלוש פלטפורמות UPLC-MS אנליטיות.

המטבוליטים הראשוניים והמשניים הקוטביים והקוטביים למחצה נותחו מהשלב הקוטבי על ידי שלב הפוך C-18 UPLC-MS. כרומטוגרמות שיא בסיס של שומנים, המוצגות בפאנל העליון, ומטבוליטים חצי קוטביים, המוצגים בפאנל התחתון, נותחו במצב יינון חיובי. תרשים העוגה בפינה הימנית העליונה של כל כרומטוגרמה מציג את מספר השומנים והמטבוליטים שזוהו שהוקצו למחלקות כימיות שונות.

לדוגמה, 58 ליפידים שונים הוקצו לקבוצת הטריאציל גליצרידים, המסומנים בתרשים העליון כ-TAG. מטבוליטים הידרופיליים יותר משבר זה, כגון סוכרים וחומצות אמינו קוטביות, שאינם מראים שמירה טובה על החומר ההפוכה, ניתנים לניתוח בשיטות אנליטיות אחרות, כגון GCMS, או כרומטוגרפיה נוזלית של אינטראקציה הידרופילית. החלבונים שנאספו מהמיצוי עוכלו בתמיסה ונותחו באמצעות LCMS רובה ציד.

תרשים העוגה המוצג בפינה הימנית העליונה מציין את מספר החלבונים המזוהים שהוקצו לתהליכים ביולוגיים שונים. לדוגמה, 268 חלבונים הוקצו לקטגוריית הלוקליזציה. לסיכום, ניתן לזהות באופן שגרתי יותר מ-200 מיני שומנים, 50 מטבוליטים חצי-קוטביים מבוארים וכמה אלפי חלבונים מדגימות כמו זו ששימשה בדוגמה זו.

בנוסף, השיטה הראתה ישימות רחבה תוך שימוש ברקמות, איברים וחומר תרבית תאים שונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ ולנתח את התרכובות החיוניות ביותר מדגימה בודדת. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על כל הדגימות קפואות, לטחון את החומר כראוי ולהשתמש בממיסים וכימיקלים בדרגה אנליטית.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בכל השיטות האנליטיות כדי לקבוע את ההרכב המולקולרי של הדגימות שחולצו.