הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצין Diacetate-Propidium יודיד מכתים פעמיים Cerebellar גרגר Neuron תרבות

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד במדויק את חיות התאים בתרבית של נוירונים גרנולריים מהמוח הקטן. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי מדעי המוח והנוירופארמקולוגיה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת להבדיל בין תאי גליה לא רצויים לבין נוירונים בתרביות תאי MISTA.

את הפרוצדורות ידגימו Lin Jiajia, Wang Jialing ו-Xu Dilin, שלושה סטודנטים לתואר ראשון מהמעבדה שלי. התחילו בנתיחה של ראשיהם של גורי חולדה בני שמונה ימים על ידי הכנסת מספריים ל-foramen magnum וחיתוך שני צדי הגולגולת מהאוזניים לעבר העיניים. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להרים את הגולגולת.

השתמשו בפינצטה כדי לבודד את המוחון, והניחו אותו בצלחת של 35 מילימטר המכילה תמיסת דיסקציה. העבירו את הצלחת לבמה של מיקרוסקופ הדיסקציה והשתמשו בשני זוגות פינצטות כדי להסיר את הקרומים והכלי הדם. השתמשו בלהב כדי לקצוץ את הרקמות, ולאחר מכן העבירו את הרקמה לשפופרת צנטריפוגה המכילה 30 milliliters של תמיסת דיסקציה.

סבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ב-1,500 x g. לאחר הצנטריפוגציה, שאבו את supernatant ושמרו את ה-pellet. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת Trypsin ל-pellet ותלו אותו שוב על ידי ניעור עדין.

לאחר מכן, הניחו את המבחנה באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, הוסיפו תמיסה של DNase One, מעכב טריפסין מסויה (soybean Trypsin inhibitor) ומגנזיום סולפט, ונערה. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר במהירות של 1,500 x g.

לאחר שאיבת הנוזל העליון, השהה מחדש את המשקע בתמיסה פחות מדוללת של DNase One, מעכב טריפסין מפולי סויה ומגנזיום סולפט. לאחר מכן, הכן שתי מבחנות של 15 מיליליטר. העבר מחצית מהתאים לכל מבחנה, ובצע פיפטינג למעלה ולמטה 60 עד 70 פעמים באמצעות פיפט פסטור עם פקק כותנה כדי להומוגנז את התאים.

לאחר ההומוגניזציה, הוסיפו שלוש מיליליטר של תמיסת מגנזיום סולפט וסידן כלוריד לכל מבחנה של 15 מיליליטר. השאירו את המבחנות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. עם סיום הזמן, הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) בעזרת פיפט פסטור עם פקק כותנה והעבירו למבחנות חדשות של 15 מיליליטר.

סבב במערך צנטריפוגה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר וב-1, 500 x g. הוסף מצע גידול למשקע כדי לדלל אותו לצפיפות תאים של כ-1.5 x 10⁶ תאים למיליליטר. העבר את התאים באמצעות פיפט לצלחת 6-בארות, וגדל אותם באינקובטור ב-37 °C וב-5% CO2.

לאחר 24 שעות, יש להוסיף תמיסת מלאי של AraC לריכוז סופי של 1 millimolar כדי לעכב את צמיחת התאי הגליאליים לפני החזרת הפלטות לאינקובטור. לאחר מכן, ביום השביעי, יש להוסיף 50 microliters של תמיסת מלאי D-glucose לריכוז סופי של 1 millimolar. יש להתחיל את הצביעה על ידי ערבוב fluorescein diacetate לריכוז סופי של 10 micrograms per milliliter, ו-propidium iodide לריכוז סופי של 50 micrograms per milliliter ו-10 milliliters של PBS.

ערבבו את תמיסת ה-FDA/PI באמצעות וורטקס והניחו על קרח. הניחו את פלטת התרבית על קרח. שאבו בזהירות את מצע התרבית ללא מגע של קצה הפ pipette בתאים, ולאחר מכן הוסיפו לאט PBS קר.

שאבו את ה-PBS, ולאחר מכן הוסיפו תמיסת עבודה קרה של FDA/PI, או FDA/PI Hoechst. הניחו את הפלטה על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, לאחר שאיבת תמיסת העבודה של FDA/PI, או FDA/PI/Hoechst, הוסיפו PBS קר לכל באר.

ודאו שהמיקרוסקופ הפלואורסצנטי מכוון כראוי. גלו את הפליטות הפלואורסצנטיות של FDA, PI ו-Hoechst ב-520, 620 ו-460 ננומטרים, בהתאמה, תוך שימוש בזמן חשיפה שבין 100 ל-300 מילישניות ובהגבר אנלוגי של 2.8x. לאחר איסוף תמונות הפלואורסצנציה, צלמו תמונה באור רגיל באמצעות מצב ניגודיות פאזה (phase contrast).

עבור כביושה כפולה של FDA/PI, יש להלביש את תמונות התאים על ידי גרירת השכבה החיובית ל-FDA מעל השכבה החיובית ל-PI בתוכנה לעריכת גרפיקה. יש להתאים את השקיפות של השכבה החיובית ל-FDA על ידי הזנת 50% בשדה ה-Opacity (שקיפות) בחלונית השכבות (Layers). כדי למזג את שתי השכבות, פתחו את תפריט השכבות (Layer) ולחצו על כפתור ה-Merge Visible (מיזוג הנראים).

הגדירו את הניגודיות של תמונות השכבות על ידי הזנת הערך 50 בשדה Contrast תחת Image, Adjustments, Brightness/Contrast. ודאו שאין תאים כפולי-חיוביים ל-FDA ו-PI בתמונות השכבות. עבור צביעה משולשת של FDA/PI/Hoechst, הניחו את תמונות התאים כשכבות על ידי גרירה חוזרת של השכבה החיובית ל-FDA על השכבה החיובית ל-PI, כיוונון השקיפות של השכבה החיובית ל-FDA ומיזוג התמונות כפי שבוצע קודם לכן.

לאחר מכן, גררו את השכבה החיובית ל-Hoechst על גבי השכבה הממוזגת. כווננו את השקיפות של השכבת ה-Hoechst החיובית על ידי הזנת 50% בשדה השקיפות (Opacity) של חלונית השכבות (Layers panel), ומזגו את שתי השכבות על ידי פתיחת תפריט השכבות (Layer menu) ולחיצה על כפתור מיזוג הנראים (Merge Visible). הבדילו באופן חזותי בין תאי גליה גדולים ולא סדירים לבין נוירונים גרנולריים של המוחון על ידי השוואת התמונות שצולמו במצב פלואורסצנציה לאלו שצולמו במצב ניגודיות פאזה (phase contrast).

התמונות הבאות מראות כי גם נוירונים קטנים וגם תאי גליה גדולים ולא סדירים נוכחים בתרבית CGN. תמונה זו מציגה צביעת חלבון GAP-43 של תרבית CGN לאחר שמונה ימים in vitro. החיצים הכחולים מצביעים על נוירונים.

כאן מוצגת צביעת חלבון GFAP של תאי גליה. החץ הלבן מצביע על תא גליה. תמונת ניגודיות פאזה זו מציגה את מורפולוגיית התאים.

צביעת FDA/PI, המסוגלת להבדיל בין תאי גליה לנוירונים, היא יתרון להערכה מדויקת של חיוניות נוירונים בתרבית CGN. זוהי תמונה ממוזגת של תאים שנצבעו בשלושה צבעים וגודלו במצע גידול רגיל. החץ מצביע על תא גליה טיפוסי.

כאן, תרבית דומה טופלה במצע המכיל ריכוז נמוך של אשלגן, והחץ מצביע שוב על תא גליא טיפוסי. כמו כן, שימו לב למראה הצביעה באדום של propidium iodide. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשעתיים אם היא מבוצעת כראוי.

ניתן להחיל אסטרטגיה דומה על תרביות תאים מעורבות אחרות, כגון תרביות קורטקס ראשוניות ותרביות היפוקמפוס ראשוניות, כדי לנתח במדויק את החיוניות הנוירונלית.