הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצין Diacetate-Propidium יודיד מכתים פעמיים Cerebellar גרגר Neuron תרבות

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד במדויק את כדאיות התאים בתרבית נוירונים של גרגירי מוח קטן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח והנוירופרמקולוגיה. היתרון העיקרי של השיטה הזו הוא שאנו יכולים להבחין בין תאי גליה לא רצויים לבין תאי עצב בתרביות תאי MISTA.

ידגימו את הנהלים לין ג'יאג'יה, וואנג ג'יאלינג, שו דילין, שלושה סטודנטים לתואר ראשון מהמעבדה שלי. התחילו לנתח את ראשיהם של גורי חולדות בני שמונה ימים על ידי הכנסת מספריים לתוך הפורמן מגנום וחיתוך שני צידי הגולגולת מהאוזניים ועד העיניים. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להרים את הגולגולת.

השתמש במלקחיים כדי לבודד את המוח הקטן, והנח אותו בצלחת בגודל 35 מילימטר המכילה תמיסת דיסקציה. העבירו את הצלחת לשלב המיקרוסקופ המנתח והשתמשו בשני זוגות מלקחיים כדי להסיר את קרומי המוח וכלי הדם. השתמש בלהב כדי לקצוץ את הרקמות, ולאחר מכן העביר את הרקמה לצינור צנטריפוגה המכיל 30 מיליליטר של תמיסת דיסקציה.

צנטריפוגה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ב -1, 500 x גרם. לאחר הצנטריפוגליזציה, שאפו את הסופרנטנט ושמרו את הגלולה. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת טריפסין לכדור והשעו מחדש על ידי ניעור עדין.

לאחר מכן הניחו את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות מוסיפים תמיסה של DNase One, מעכב טריפסין פולי סויה ומגנזיום גופרתי, ומנערים. ואז צנטריפוגה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ב -1, 500 x גרם.

לאחר שאיבת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-DNase One פחות מדולל, מעכב טריפסין פולי סויה ותמיסת מגנזיום גופרתי. לאחר מכן, הכינו שני צינורות של 15 מיליליטר. הניחו מחצית מהתאים בכל צינור, והניחו פיפטה למעלה ולמטה 60 עד 70 פעמים באמצעות פיפטה פסטר סתומה בכותנה כדי להומוגניזציה של התאים.

לאחר הומוגניזציה, הוסף שלושה מיליליטר של תמיסת מגנזיום גופרתי וסידן כלורי לכל צינור של 15 מיליליטר. הניחו לצינורות לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר שחלף הזמן, הסר בזהירות את הסופרנטנט עם פיפטת פסטר סתומה בכותנה והעביר לצינורות חדשים של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ו -1,500 x גרם. הוסף מדיום תרבית לגלולה כדי לדלל לצפיפות תאים של כ -1.5 x 10 לתאים השישיים למיליליטר. פיפטו את התאים לצלחת של 6 בארות, ותרבבו בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר 24 שעות, הוסף תמיסת מלאי AraC לריכוז סופי של מילימולר אחד כדי לעכב את צמיחת תאי הגליה לפני החזרת הצלחות לאינקובטור. לאחר מכן, ביום השביעי, הוסף 50 מיקרוליטר לתמיסת מלאי D-גלוקוז לריכוז סופי של מילימול אחד. התחל את הצביעה על ידי ערבוב פלואורסצאין דיאצטט לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר, ופרופידיום יודיד לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר ו-10 מיליליטר PBS.

מערבבים את תמיסת ה-FDA/PI על ידי מערבולת ומניחים על קרח. הניחו את צלחת התרבות על קרח. שאפו בזהירות את מדיום התרבות מבלי לגעת בתאים עם קצה הפיפטה, ואז הוסיפו לאט PBS קר.

שאפו את ה-PBS, ולאחר מכן הוסיפו פתרון עבודה קר של FDA/PI, או FDA/PI Hoechst. שים את הצלחת על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, לאחר שאיבת פתרון העבודה של ה-FDA/PI, או ה-FDA/PI/Hoechst, הוסף PBS קר לכל באר.

ודא שהמיקרוסקופ הפלואורסצנטי מוגדר כהלכה. זהה את פליטות הפלואורסצנט עבור FDA, PI ו-Hoechst ב-520, 620 ו-460 ננומטר, בהתאמה, תוך שימוש בזמן חשיפה בין 100 ל-300 מילישניות והגבר אנלוגי של פי 2.8. לאחר איסוף תמונות פלואורסצנטיות, צלם תמונה באור רגיל באמצעות מצב ניגודיות פאזה.

לצביעה כפולה של ה-FDA/PI, שכב-על של תמונות התאים על ידי גרירת השכבה החיובית של ה-FDA על גבי השכבה החיובית של PI בתוכנת עריכה גרפית. התאימו את האטימות של השכבה החיובית של ה-FDA באמצעות הזנת 50% בשדה 'אטימות' בחלונית 'שכבות'. מיזוג שתי שכבות על ידי פתיחת השכבה בתפריט ולחיצה על מיזוג גלוי לחצן.

הגדר את הניגודיות של תמונות הכיסוי על-ידי הזנת 50 בשדה ניגודיות תחת תמונה, התאמות, בהירות/ניגודיות. בדוק שאין תאים חיוביים כפולים של ה-FDA וה-PI בתמונות השכבה. לצביעה משולשת של ה-FDA/PI/Hoechst, שכב את תמונות התאים על ידי גרירת השכבה החיובית של ה-FDA על השכבה החיובית של ה-PI, התאמת האטימות של השכבה החיובית של ה-FDA ומיזוג התמונות כמו קודם.

לאחר מכן גרור את השכבה החיובית של Hoechst על השכבה הממוזגת. התאימו את האטימות של השכבה החיובית של Hoechst על ידי הזנת 50% בשדה האטימות של החלונית Layers, ומזגו את שתי השכבות על ידי פתיחת תפריט Layer ולחיצה על הלחצן Merge Visible. הבחין חזותית בין תאי גליה גדולים ולא סדירים לבין נוירונים גרגיריים במוח הקטן על ידי השוואת התמונות שצולמו במצב פלואורסצנטי לאלו שצולמו במצב ניגודיות פאזה.

התמונות הבאות מראות שגם נוירונים קטנים וגם תאי גליה גדולים ולא סדירים נמצאים בתרבית CGN. תמונה זו מציגה צביעת אמינו GAP-43 של תרבית CGN בשמונה ימים במבחנה. החצים הכחולים מצביעים על נוירונים.

כאן מוצג צביעת אמינו GFAP של תאי גליה. החץ הלבן מציין תא גליה. תמונת ניגודיות פאזה זו מציגה את המורפולוגיה של התאים.

צביעת וו FDA/PI שיכולה להבחין בין תאי גליה לנוירונים היא יתרון להערכה מדויקת של כדאיות עצבית בתרבית CGN. זוהי תמונה ממוזגת של תאים מוכתמים משולשים הגדלים במדיום גידול רגיל. החץ מראה תא גליה טיפוסי.

כאן, תרבית דומה טופלה במדיום המכיל אשלגן נמוך, והחץ מצביע שוב על תא גליה טיפוסי. כמו כן, שימו לב למראה של צביעת יודיד פרופידיום אדום. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.

ניתן ליישם אסטרטגיה דומה על תרביות תאים מעורבות אחרות, כגון תרביות קליפת המוח הראשוניות, ותרביות היפוקמפוס ראשוניות כדי לנתח במדויק את הכדאיות העצבית.