פרוטוקול לצורך מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד
3 בינואר 2018
פרוטוקול זה פרטים הקמה ותפעול של מיקרוסקופ מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד מסוגל מעקב הננומטרי פלורסנט רגשים במהירויות גבוהות המפזרת, המחירים ספירה נמוכה פוטון.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא ליישם מיקרוסקופ מעקב אחר חלקיקים בודדים בזמן אמת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנטר אובייקט יחיד בקנה מידה ננומטרי ברציפות ברזולוציה זמנית מוגבלת של פוטון. טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הווירולוגיה, כגון מעקב אחר נגיף בודד לאורך כל תהליך ההדבקה.
הכן את המכשיר על שולחן אופטי. הגדרה זו מוכנה לכיול. רכיבי המפתח כוללים לייזר מצב מוצק של 488 ננומטר, שני מסיטים אלקטרו-אופטיים הנמצאים לאורך נתיב האלומה, עדשת שיפוע אקוסטית מתכווננת ושלב דגימה עם ממקמי מיקרו וננו.
סכימה זו של ההגדרה מספקת פרטים נוספים. להלן נתיב קרן הלייזר לשלב הדגימה. המסיטים האלקטרו-אופטיים והעדשה האקוסטית המתכווננת נמצאים לאורך נתיב האלומה.
מכשירים אלה מניעים באופן דינמי את נקודת הלייזר בשלב הדגימה. פוטונים מהדגימה נספרים על ידי דיודת צילום מפולת. מצלמה עוקבת אחר מיקום החלקיק.
מיקום הדגימה נקבע באמצעות בקרי מיקרו וננו. מערך שערים הניתן לתכנות בשטח שולט בנקודת הלייזר, חישוב מיקום החלקיקים בזמן אמת, משוב שלב וספירת פוטונים. יש להכין שתי דוגמאות.
הראשון, דורש חרוזים פלואורסצנטיים של 190 ננומטר מדוללים בתמיסת מלח חוצצת פוספט. השתמש בתלוש כיסוי כדי להכין דגימת חלקיקים קבועה. הניחו 400 מיקרוליטר מתמיסת החרוזים על החלקת הכיסוי.
כעת, צור את דגימת החלקיקים הנעים בחופשיות. זה דורש חרוזים פלואורסצנטיים של 110 ננומטר מדוללים במים. צור דגימת חלקיקים נעה חופשית על ידי הנחת 400 מיקרוליטר של התמיסה על פתק כיסוי.
קח את דגימת החלקיקים הקבועה למיקרוסקופ להרכבה. הדגימה נמצאת על מיקום ננו XY. הפעל את הלייזר, את גלאי הצילום, את הבקרים עבור רכיבי קו האלומה ועבור הממצבים.
הפעל את מיקום הננו של Piezo בלולאה סגורה. לאחר מכן, הסר את מסנן פליטת הקרינה מחזית גלאי הצילום. לאחר מכן, שנה את מיקום ה-z של הדגימה עם מיקום המיקרו
.ככל שהמיקום משתנה, השתמש בגלאי הצילום כדי לנטר את עוצמת השתקפות הלייזר. מקסם את העוצמה כדי לזהות את מישור המוקד של עדשת האובייקט. כשהדגימה במישור המוקד, החלף את מסנן פליטת הקרינה.
כעת, עבוד עם תוכנת בקרת המחשב. השתמש בתוכנה מותאמת אישית כדי לסרוק רסטר את הדגימה. ראשית, הגדר טווח סריקה גדול, ההבדל בין התחלה לסיום.
כאן, הטווח הוא 10 מיקרומטר ב-Y ו-10 מיקרומטר ב-X.כמו כן, הגדר גודל מדרגה גדול לכל כיוון. כאן, 200 ננומטר. הגדר את שני שדות Z למיקום שזוהה קודם לכן של מישור המוקד.
לחיצה על סריקת רסטר תפעיל את סריקת הרסטר. התחל את הסריקה. התוכנה מניעה את המסיטים האלקטרו-אופטיים בסיור לילי, אוספת ספירות מגלאי הצילום, מניעה את מיקום הננו ומבצעת חישובי מיקום.
הסריקה תמצא חלקיק הניתן לזיהוי בתוכנה באמצעות פלואורסצנטי פלטה. עבור כל אתר בסריקה, התוכנה תקבע גם הערכות של מיקום החלקיקים ב-X ו-Y, ביחס למרכז סריקת מסיט האובייקט החשמלי. לאחר מציאת החלקיק, כווץ את טווח הסריקה סביבו לשני מיקרומטר ב-X ו-Y.כמו כן, הקטן את גודל הצעד עבור שניהם ל-100 ננומטר.
הוסף טווח סריקה בכיוון Z של שני מיקרומטר כדי לסוגריים את המיקוד הפלואורסצנטי. הגדר את גודל שלב Z ל-200 ננומטר. התחל את סריקת הרסטר התלת-ממדית כדי למצוא את המוקד הפלואורסצנטי.
הנתונים המופקים מהסריקה מראים את מישור המוקד לפני הפעלת עדשת השיפוע האקוסטית המתכווננת. עבור לעבודה עם הגדרת העדשה האקוסטית הניתנת לכוונון בתוכנת הבקרה שלה. ראשית, לחץ על התחבר, ולאחר מכן הפעל.
עבור לקטע בקרת הדופק והשער, שנה את מצב הדק הפלט מ-RGB לרב מישורים. לאחר מכן, שנה אותו בחזרה ל-RGB כדי לאפשר שינוי שלב הפלט. השתמשו במחוונים לקביעת שלב הפלט בין אפס מעלות, 90 מעלות ו- 270 מעלות.
לאחר מכן, עבור לסעיף בקרת התדרים. שם, בחר תדר תהודה של 68, 500 הרץ. עבור לראש המסך ולחץ על מתקדם.
לאחר מכן, בחר בכרטיסייה הגדרות. במסך החדש, מצא את התדירות המקסימלית של עמודת האפס. התאם אותו כדי לשנות את טווח חיפוש התדירות.
לחץ, שמור כיול ולאחר מכן צא מהכיול. חזור לבקרות התדרים ושנה את תדר התהודה. שנה אותו מיד בחזרה ל-68, 500 הרץ כדי שהכיול ייכנס לתוקף.
בקטע בקרת המשרעת, השתמש במחוון כדי להעלות לאט את המשרעת ל -35%לאחר מכן, לחץ על תהודת נעילה. כאשר התדר נעול, לחץ על בטל נעילת תהודה. חזור לתוכנת סריקת הרסטר.
הזן שני טווחי סריקה של מיקרומטר הממוקדים בחלקיק ב-X ו-Y. השתמש בגודל צעד של 100 ננומטר. מרכז את החלקיק בטווח של ארבעה מיקרומטר ב-Z, עם גודל צעד של 200 ננומטר. בתמונת הסריקה המתקבלת אזור התאורה המייצג את החלקיק הוא ברוחב של מיקרומטר אחד.
על סמך זה, התאם את פרמטר סולם XY כך שהמיקומים המשוערים ב-X ו-Y ינועו בין 0.5 ל-0.5 מיקרומטר שלילי. לאחר הליך דומה בסולם Z הגדר את מיקום הננו למצב אפס. כבה את החשמל למיקום הננו לפני שתמשיך.
החלף את דגימת החלקיקים הקבועה בדגימת החלקיקים הנעה בחופשיות. לאחר מכן, ודא שכל הציוד פועל. הפעל את מיקום הננו של Piezo בלולאה פתוחה.
במחשב, הגדר את תוכנת עדשת השיפוע האקוסטית הניתנת לכוונון כמו קודם. הסר את מסנן פליטת הקרינה מהנתיב לגלאי הצילום. מצא את מישור המוקד על ידי שינוי מיקום Z של הדגימה ומקסום עוצמת השתקפות הלייזר, מהחלקת הכיסוי.
לאחר מציאת מישור המוקד, הגדל את מיקום המיקוד ב-15 מיקרומטר לתוך התמיסה. החלף את מסנן פליטת הקרינה. פתח את תוכנת המעקב המותאמת אישית.
מגדירים את הפרמטרים של הערכת המיקום לערכים שנמצאו במהלך האופטימיזציה. כעת, הגדר את קבועי הבקרה האינטגרליים, המכתיבים את מהירות התגובה של ממקם הננו. נתחיל עם קבוע X.
הזן ערך נמוך והגדל אותו לאט. כאשר מתחילות תנודות בקריאת מיקום החלקיקים, שים לב לערך של קבוע הבקרה. צמצם את קבוע הבקרה האינטגרלי לכ- 70% מערכו בתחילת התנודה.
חזור על השלבים עם קבועי הבקרה Y ו- Z. הגדר את ההדק כדי להתחיל לעקוב אחר סף המסלול לשלושה קילו-הרץ. הגדר את מינימום המסלול, ההדק לסיום המעקב, על 1.5 קילו-הרץ.
התחל את הניסוי על-ידי לחיצה על חיפוש ולאחר מכן לחיצה על מעקב אוטומטי. סרטון זה מציג את התוצאה של שימוש במיקרוסקופ מעקב תלת מימדי ודינמי של לוקליזציה של פוטונים כדי לעקוב אחר התנועה הדיפוזיבית של ננו חלקיק פלואורסצנטי של 110 ננומטר במים. מיקום החלקיק, הנמדד באמצעות קריאת המיקום של מיקום הננו, מוצג על צירי התלת מימד.
הכניסה היא הקריאה של מצלמת אזוב הים המדעית. זה מדגים שהחלקיק מוחזק, נעול בנפח המוקד, על ידי מערכת המעקב. החלקיק היה במעקב ומיקומו נרשם במשך יותר משתי דקות.
לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מ-50 דקות, אם המערכת מיושרת כראוי, ופרמטרי הכיול מוגדרים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תסייע לחוקרים בתחום העברת התרופות לחקור את מסלולי ההפנמה וההובלה של מטען תאי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להפעיל מיקרוסקופ מעקב אחר חלקיקים בודדים תלת-ממדיים בזמן אפס.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את היישום של מיקרוסקופ למעקב אחר חלקיקים בודדים בתלת-ממד בזמן אמת שנועד לפקח על בדיקות פלואורסצנטיות בסדר גודל ננומטרי. טכניקה זו מאפשרת תצפית רציפה של אובייקטים מתפזרים בודדים, אפילו בתנאי פוטון מוגבלים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרוסקופיה
- מעקב אחר חלקיקים בודדים
- וירולוגיה
רקע
- מעקב בזמן אמת אחר חלקיקים בסדר גודל ננומטרי חיוני בתחומים מדעיים שונים.
- הבנת הדינמיקה של וירונים בודדים יכולה לספק תובנות לגבי תהליכי זיהום.
- טכניקה זו משפרת את היכולת לחקור חלקיקים במהירויות דיפוזיה גבוהות.
- מגבלות ספירת הפוטונים מטופלות באמצעות התקנים אופטיים מתקדמים.
מטרת המחקר
- לפתח מיקרוסקופ שיכול לעקוב אחר חלקיקים בודדים בזמן אמת.
- להקל על חקר זיהומים ויראליים על ידי מעקב אחר וירונים בודדים.
- לשפר את הרזולוציה הזמנית של מעקב אחר אובייקטים בסדר גודל ננומטרי.
שיטות ששימשו
- בניית מיקרוסקופ למעקב אחר חלקיקים בודדים בתלת-ממד.
- שימוש בלייזר מצב מוצק באורך גל של 488 ננומטר.
- שילוב של מפלטים אלקטרו-אופטיים ועדשה קולית עם שיפוע מתכוונן.
- כיול המכשיר על שולחן אופטי עם מיקום מדויק.
תוצאות עיקריות
- המיקרוסקופ עוקב בהצלחה אחר בדיקות פלואורסצנטיות בסדר גודל ננומטרי.
- הוכח יכולת לפקח על חלקיקים בקצבי ספירת פוטונים נמוכים.
- אפשר תצפית רציפה של וירונים בודדים במהלך זיהום.
- סיפק תובנות לגבי הדינמיקה של תהליכים ויראליים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מבסס שיטה חזקה למעקב אחר חלקיקים בזמן אמת.
- הוא פותח דרכים חדשות למחקר בתחום הוירולוגיה ותחומים קשורים.
- הטכניקה יכולה לשפר משמעותית את ההבנה שלנו על התנהגות ויראלית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Real-time 3D single particle tracking enables continuous monitoring of nanoscale objects under photon-limited conditions, addressing a critical gap in observing fast, three-dimensional cellular processes. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by providing high-resolution dynamic data on molecular interactions and trafficking pathways. The method enhances predictive confidence in target validation and lead identification by delivering quantitative, reproducible spatiotemporal data essential for informed go/no-go decisions in drug delivery and virology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking single virions or nanoparticles through infection processes with high spatiotemporal resolution.
- Operational Value: Provides functional target validation through direct observation of molecular dynamics in near-native environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative data on particle diffusion, binding, and transport kinetics under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements (position, trajectory, diffusion coefficient) essential for assay standardization and hit confirmation.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening via precise 3D localization and tracking of fluorescent probes.
- Scalability: Supports platform reuse through robust single-excitation/single-detection layout and calibrated electro-optic and acoustic gradient lens control.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling real-time observation of cellular cargo internalization and transport pathways relevant to drug delivery.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in viral entry and intracellular trafficking models through direct visualization of single-particle behavior in solution.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing reproducible, high-fidelity data on nanoparticle behavior under low photon flux conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for studies requiring dynamic, nanoscale resolution in three dimensions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling continuous tracking of single particles in 3D space under physiological mimicry.
- Screening: Enhances assay readiness through reproducible particle localization and tracking, facilitating reliable compound or nanoparticle evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs (position, velocity, confinement) that allow objective comparison of experimental conditions and therapeutic candidates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling drug delivery pathways and viral infection dynamics in biologically relevant systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability due to its modular optical layout, calibration protocol, and adaptability to different sample types and tracking objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nanoscale biological processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through calibrated raster scanning, position estimation algorithms, and feedback-controlled nano-positioning.
- Strategic Value: Improves capital efficiency and reduces late-stage biological risk by enabling early, data-driven decisions on target druggability and delivery mechanism feasibility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, high-resolution tracking data that inform advancement criteria in drug delivery and antiviral development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and real-time control systems including FPGA-based feedback loops.
- Depends on specialized instrumentation: 488 nm solid-state laser, 2D electro-optic deflectors, tunable acoustic gradient lens, avalanche photodiode, and nano-positioning stages.
- Necessitates cross-team standardization for calibration protocols, position estimation parameters, and integral control constant tuning across users and labs.
- Involves adaptation considerations when transitioning from fixed bead samples to freely moving particles in viscous or complex biological media.
- Practical limitations include sensitivity to photon count rates and the need for careful optimization of tracking thresholds (e.g., 3 kHz start, 1.5 kHz end) to maintain lock-on under low-signal conditions.
