רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת כדי לדמיין ולעקוב אחר קולטנים בודדים על פני תאים חיים ובכך לנתח את הניידות הרוחבית של הקולטן, גודל קומפלקסי הקולטנים וכן לדמיין אינטראקציות קולטן-קולטן חולפות. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחלבוני ממברנה אחרים.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמיין קולטנים בודדים על פני תאים חיים ולנתח את מיקומם, תנועתם והקשר הדינמי שלהם לקומפלקסים סופרמולקולריים. זה מושג על ידי ביטוי קולטנים מתויגים ברמות נמוכות מאוד על פני תאים חיים ותיוג שלהם בפלואורופורים אורגניים בהירים כדי לאפשר זיהוי מולקולה בודדת. כשלב שני, התאים מוצגים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית כוללת, המאפשר רכישת רצף תמונה מהיר של חלקיקי קולטן בודדים הנעים על פני התא.

לאחר מכן, אלגוריתמי זיהוי ומעקב אוטומטיים מוחלים על רצף התמונה על מנת לקבל את המיקום והעוצמה של כל חלקיק קולטן לאורך זמן. מתקבלות תוצאות המראות ניתוח מדויק של גודל קומפלקסי הקולטנים בדוגמה זו, בטא שני קולטנים אדרנרגיים המבוססים על התאמה גאוס מעורבת של התפלגות העוצמה של החלקיקים בתחילת רצף התמונה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, כגון כיצד הקולטנים שלנו מתארגנים בתחומים של פני השטח של תאים חיים.

כיצד הם מתקשרים זה עם זה כדי ליצור דימרים ואוליגומרים, וכיצד מתרחשים אירועים דינמיים בבסיס איתות הקולטנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות סטנדרטיות הוא שהיא חוקרת את התנהגותם של קולטנים בודדים בסביבה הטבעית, ובכך מאפשרת לנו לחקור היבטים חשובים שבדרך כלל מוסתרים במדידות אנסמבל. יש לנקות בהרחבה את החלקות הכיסוי של הדגימות כדי למזער את הקרינה ברקע במהלך ההדמיה, השתמש בפינצטה נקייה כדי למקם קוטר 24 מילימטר.

כיסוי זכוכית מחליק לתוך מחזיק החלקת כיסוי המפריד בין החלקות כיסוי בודדות. הכניסו את המחזיק עם החלקות הכיסוי לכוס והוסיפו כלורופורם עד שהכיסוי מחליק מכוסה. מכסים את הכוס בנייר אלומיניום כדי להפחית את האידוי וסוניקט באמבטיה.

סוניקציה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, הוציאו את מחזיק החלקת הכיסוי מהכוס ותנו לכיסוי להחליק להתייבש. לאחר מכן, הנח את המחזיק עם הכיסוי מחליק לכוס אחרת והוסף תמיסת נתרן הידרוקסיד חמש טוחנת עד שהכיסוי מחליק.

כמו קודם, מכסים את הכוס בנייר כסף וסוניקט למשך שעה בטמפרטורת החדר, מעבירים את מחזיק החלקת הכיסוי לכוס חדשה ושוטפים שלוש פעמים במים מזוקקים. לבסוף, הכניסו פתקי כיסוי נקיים לכלי תרבית תאי זכוכית מלא באתנול 100%. מוצגים כאן פתקי כיסוי לפני ואחרי הניקוי, המצולמים על ידי פלואורסצנטיות השתקפות פנימית מוחלטת או מיקרוסקופ דשא.

דגימות כיול Cal משמשות להערכת העוצמה של מולקולות פלואורסצנטיות בודדות במהלך מיקרוסקופ דשא. להכנת הדגימות, ממיסים את הצבע הפלואורסצנטי בממס המתאים. הכן דילול סדרתי של 1 עד 10 של הצבע הפלואורסצנטי החל מפיקה-מולר אחד ועד טוחנת אחת.

במים מעוקרים מסננים. שטפו את החלקות הכיסוי שנקו בעבר על ידי העברתם לכלי תרבית תאים מלא במים מעוקרים מסננים. לאחר מכן, הניחו כל כיסוי בבאר של צלחת תרבית תאים של שש בארות והמתינו עד שהם מתייבשים 20 מיקרוליטר מכל דילול צבע פלואורסצנטי על פתק כיסוי נקי נפרד.

תן לכיסוי להחליק להתייבש מתחת למכסה מנוע סטרילי. הגן על החלקות הכיסוי מפני אור ואבק עד לשימוש לפני ההעברה. הכן צלחת תרבית תאים של שש בארות שטפו את החלקות הכיסוי הנקיות עם PBS סטרילי והניחו החלקת כיסוי אחת לכל באר של צלחת תרבית תאי שש בארות.

תאי ה-CHO שיועברו למחקר זה מתורבתים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 בתערובת תזונתית בינונית של נשר אחד לאחד F12 בתוספת 10% פניצילין וסטרפטומיצין בסרום בקר עוברי לאחר טריפסין וספירת התאים בשיטות סטנדרטיות זרעים בצפיפות של שלוש פעמים 10 עד חמישית תאים לבאר. בצלחת תרבית תאי הבאר השישית המכילה את החלקות הכיסוי, תנו לתאים לגדול באינקובטור למשך 24 שעות על מנת להשיג כ-80% שטף, שהיא צפיפות התאים האופטימלית. לטרנספקציה.

ההיבט הקשה ביותר של פרוטוקול זה הוא להשיג רמת ביטוי נמוכה במיוחד של קולטני הממברנה על פני התא כדי להבטיח הצלחה. תנאי הטרנספקציה. לדוגמה, יש למטב את כמות המדיה הפלוס NA והזמן לאחר הטרנספקציה ביום הטרנספקציה.

הכן את ריאגנטים הטרנספקציה לכל אחד מהם ידלל שני מיקרוגרם של ה- DNA המשובץ הרצוי ב -500 מיקרוליטר של מדיום אופטימלי בצינור אחר. עבור כל באר יש לדלל שישה מיקרוליטרים של כריתת שומן 2000 ב-500 מיקרוליטר של מדיום אופטים. דגרו את שני הצינורות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר חמש דקות, שלב את שתי התמיסות לצינור אחד וערבב לקבלת תערובת טרנספקציה. דגרו את תערובת הטרנספקציה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. בינתיים, הכינו את תאי ה-CHO.

שטפו את התאים פעמיים עם PBS שהוזהר מראש לאחר השטיפה השנייה, החליפו PBS במיליליטר אחד לבאר של מדיום D-M-E-M-F 12 ללא פנול אדום בתוספת 10% FBS, אך ללא אנטיביוטיקה. מוסיפים מיליליטר אחד מתערובת הטרנספקציה, טיפתית לכל באר ומנענעים בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה כדי להבטיח ערבוב מלא. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 למשך שעתיים עד ארבע שעות לפני שתמשיך מיד לסימון החלבון.

כדי להתחיל בהליך זה, יש לדלל מיקרוליטר אחד של נגזרת פלואורו ארבע בנזו גיין מצומד או תמיסת מלאי פלואורו ארבע BG במיליליטר אחד של מדיום D-M-E-M-F 12 בתוספת 10% FBS כדי לקבל ריכוז סופי של מיקרומולר אחד. אחזר את התאים שהועברו מהחממה ושטוף פעמיים עם PBS חם מראש. החלף PBS במיליליטר אחד של תמיסת פלואורו מיקרו-מולרית אחת ארבע BG ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 למשך 20 דקות.

לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם מדיום D-M-E-M-F 12 בתוספת 10% FBS בכל פעם, ולאחר מכן דגירה של חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. השתמשו בפינצטה להעברת פתקי כיסוי עם תאים מסומנים לתא הדמיה. שטוף פעמיים עם 300 מיקרוליטר של מאגר הדמיה.

הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר הדמיה טרי והמשך מיד להדמיה מתקבלות. שימוש במיקרוסקופ דשא המצויד בטבילת שמן, מטרת צמצם מספרית גבוהה, לייזרים מתאימים, מכשיר מצמד מטען מכפיל אלקטרונים, מצלמה וחממה, ובקרת טמפרטורה. הגדר את פרמטרי המיקרוסקופ הרצויים, כלומר קו הלייזר, זווית הדשא, החשיפה, קצב הפריימים ומספר התמונות לסרט.

שים טיפה של שמן טבילה על המטרה של פי 100 של המיקרוסקופ. הנח את תא ההדמיה עם התאים המסומנים על מחזיק הדגימה של המיקרוסקופ והביא את התאים למיקוד. שימוש בתאורת שדה בהיר.

עבור לתאורת דשא. שמור על עוצמת לייזר נמוכה ככל האפשר כדי לאפשר חיפוש אחר התא הרצוי, אך יחד עם זאת למזער את הלבנת הצילום. בחר את התא הרצוי וקנס.

כוונן את המיקוד. הגדל את עוצמת הלייזר לרמה המאפשרת הדמיה של ארבע פלורה בודדות. רכוש רצף תמונות ושמור את רצף התמונות הגולמי כקובץ tiff לכיול.

הרכיבו כל דגימת כיול בתא ההדמיה והניחו על המיקרוסקופ. בחר דגימה המכילה עקיפה מופרדת היטב. כתמים מוגבלים שמלבינים בצעד אחד.

רצפי תמונות דשא נרכשים לאחר מכן באותו אופן כפי שהודגם עבור התאים המסומנים. להכנת רצף תמונות, השתמש בתוכנת עיבוד תמונה כגון Image J כדי לחתוך את התמונות. שמור מסגרות בודדות כתמונות TIFF נפרדות בתיקייה חדשה המציינת את מספר המסגרת בכל תמונה.

זיהוי ומעקב אחר חלקיקים מבוצעים באמצעות תוכנה לא מסחרית כגון U Track בסביבת MATLAB. משורת הפקודה MATLAB הקלד בורר סרטים, GUI. כדי לפתוח את ממשק בחירת הסרט, בצע את ההוראות ליצירת מסד נתונים חדש של סרטים החל מהתמונות הנפרדות שנשמרו קודם לכן.

ספק את גודל הפיקסלים בננומטרים, מרווח זמן בשניות, צמצם מספרי, עומק סיביות מצלמה ואורך גל פליטה של הפלואורופור הנדרש לזיהוי ומעקב אחר חלקיקים. שמור את מסד הנתונים של הסרטים מממשק בחירת הסרטים. הפעל את הניתוח תוך בחירת חלקיקים בודדים כסוג אובייקט.

הפעל את אלגוריתם הזיהוי ולאחר מכן הפעל את אלגוריתם המעקב. השתמש בשגרת הצגת הסרטים הכלולה בחבילת URAC כדי להציג את הרצועות באופן חזותי ולבדוק את איכות הזיהוי והמעקב. פתח את קובץ הנקודה MAT כדי לראות את המיקום והמשרעת של החלקיקים הנמצאים במעקב בכל מסגרת.

ניתן לחשב את גודל החלקיקים גם מהנתונים שנרכשו. מוצגת כאן המסגרת הראשונה של רצף תמונות דשא טיפוסי של תא שהועבר עם שני קולטנים אדרנרגיים מתויגים בהצמד ומסומן בנגזרת פלואורו ארבע מצומדת. הכתמים מייצגים קולטנים בודדים או קומפלקסים של קולטנים.

אלגוריתם זיהוי מוחל על אותו רצף תמונות וכל חלקיק שזוהה מסומן על ידי יישום עיגול כחול של אלגוריתם מעקב. לאותו רצף תמונות נוצרים מסלולים של החלקיקים הבודדים המסומנים בכחול. מקטעים ירוקים מייצגים אירועי מיזוג ומקטעים אדומים מייצגים אירועי פיצול.

שיטה זו לוכדת גם אירועים דינמיים. בדוגמה זו, שני חלקיקים עוברים אינטראקציה חולפת, נעים יחד למספר פריימים ומתפצלים שוב. המסלולים של חלקיקים בודדים משמשים לחישוב מקדמי הדיפוזיה שלהם.

תוצאה מייצגת זו מראה כי לקולטן בטא 2 אדרנרגי יש ניידות גבוהה. בעוד שלקולטן gaba B יש ניידות מוגבלת, ניתן להעריך במדויק את גודל קומפלקסי הקולטנים על ידי התאמת התפלגות עוצמות החלקיקים למודל גאוס מעורב. ניתוח זה יכול גם לחשוף את הדו-קיום של מונומרים ודימרים.

מוצגות כאן דוגמאות להלבנת חלקיקי קולטן מונומרי בשלב אחד והלבנת חלקיקי קולטן דיאמטרי בשני שלבים. ניתן להרחיב את ההליכים הללו ולהתאים אותם לעבודה עם חלבונים אחרים על פני התא, שיטות פילוס ומודלים תאיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר שנת כיסוי נקייה, כיצד להשיג רמות ביטוי נמוכות ותיוג יעיל עם פלואורוס אורגני בהיר, כמו גם כיצד לרכוש ולנתח תמונות דשא, המייצגות את כל שלבי המפתח למולקולה בודדת מוצלחת.