אפיון מיקרוביאלית של חומרים מתקדמים ליישומים בביו-הנדסה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת החומרים, כגון תכונות אנטי-מיקרוביאליות, הרצויות מאוד עבור יישומי ביו-הנדסה רבים. ניתן להשתמש בטכניקה זו כפרוטוקול עקבי במעבדות כדי לעזור לחוקרים פחות מנוסים הדורשים נהלים מעמיקים שלב אחר שלב כדי לעקוב אחר תוצאות מדויקות. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כשהתחלנו לחפש פרוטוקולים אנטי-מיקרוביאליים, והבנו שאין פרוטוקולים מפורטים על שיטה זו בספרות.

במחקר זה ייבדקו ארבעה חומרים מתקדמים בעלי אופי כימי שונה וחומר בקרה, לפעילות אנטי-מיקרוביאלית. הכן כל חומר על ידי חיתוך לדיסקים בקוטר 10 מ"מ. לאחר מכן, יש לעקר כל דגימה על ידי טבילה ב-70% אתנול למשך 10 דקות, ולאחר מכן קרינה אולטרה סגולה למשך שעה לכל צד.

שלושה מיקרואורגניזמים שונים ישמשו לבדיקת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של החומרים המתקדמים. החיידק הגרם חיובי, Staphylococcus aureus, החיידק הגרם שלילי, Escherichia coli, והשמרים, Candida albicans. בעזרת צמר גפן סטרילי, השעו מחדש כמה מושבות של כל מיקרואורגניזם ב-25 מ"ל של מרק סויה טריפטי, או TSB, הכלול בצינור צנטריפוגה סטרילי.

מערבולת למשך דקה להשגת ערבוב אחיד. מדוד את הספיגה ב-540 ננומטר עבור כל תרבית מיקרואורגניזם עם ספקטרופוטומטר. התאם את הריכוז של כל מיקרואורגניזם למספר מתאים של יחידות יוצרות מושבה, או CFU למיליליטר.

מערבול את התרחיף המיקרוביאלי למשך חמש שניות כדי לשפר את פיזור המיקרואורגניזם, ולטבול לזמן קצר צמר גפן סטרילי בתרחיף המיקרוביאלי הזה. הסר את עודפי הנוזל מהספוגית על ידי לחיצת הספוגית על דופן הצינור המכיל את התרבית. פס באופן שווה כל תרחיף מרק מיקרוביאלי עם צמר גפן סטרילי על פני אגר סויה טריפטי, או צלחת TSA, בשלושה מישורים כדי לכסות את כל פני השטח במיקרואורגניזם.

הניחו לצלחות להתייבש חמש דקות לאחר החיסון. השאירו את תרחיפי המרק המיקרוביאלי על הספסל לשימוש מאוחר יותר כדי לבדוק את ריכוז ההשעיה המיקרוביאלית ואת טוהרה. עקרו זוג פינצטה על ידי טבילתם בכוס עם אתנול 96%, ולאחר מכן הבערה עם מבער אלכוהול.

השתמש בפינצטה הסטרילית כדי למקם את דיסקי הדגימה שייבדקו במרכז לוחות ה-TSA. דגרו את לוחות ה-TSA במצב הפוך ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. כדי לנתח את תוצאות בדיקת הדיפוזיה, יש למדוד את קוטר אזור העיכוב וקוטר דיסק הדגימה באמצעות קליפר דיגיטלי, או על ידי צילום ושימוש בתוכנת עיבוד תמונה מתאימה.

הליך זה הכרחי כדי לוודא שריכוזי החיידקים שנקבעו קודם לכן נכונים, ולהבטיח היעדר זיהום סביבתי מיקרוביאלי. בעזרת מיקרופיפטה עם קצות חיטוי מתאימים ותנאים אספטיים, הוצא TSB סטרילי לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים. כלול דגימה שתשמש כבקרה שלילית.

בצע שישה דילולים סדרתיים עשרוניים עם תרחיפי המרק המיקרוביאלי ששימשו קודם לכן לפסים של לוחות ה-TSA. בעזרת מרית דריגלסקי מעוקרת מראש, מורחים 100 ליטר מכל דילול שנבחר על צלחת TSA. מורחים 100 ליטר מדיום TSB ללא מיקרואורגניזם על צלחת TSA כבקרה שלילית.

דגרו את לוחות ה-TSA בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, ספרו את מספר המושבות כדי לבדוק שה-CFU למיליליטר דומה לזה שנקבע קודם לכן. בדוק את לוחית הבקרה השלילית כדי לוודא שאין זיהום סביבתי מיקרוביאלי.

התחל הליך זה על ידי תרבית המיקרואורגניזמים השונים שייבדקו ב-TSB, בשייקר אורביטלי ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, מדדו את ה-OD540 של כל תרבית לילה, ולאחר מכן דללו כל תרבית ב-20 מ"ל TSB בצינור צנטריפוגה מעוקר מראש של 50 מ"ל לריכוז של כ-10 עד ה-CFU השישי למיליליטר. הנח ארבעה דיסקים מכל סוג חומר וארבעה דיסקי בקרה בבארות נפרדות של צלחת סטרילית של 48 בארות.

פיפטה 150 ליטר מהתרחיף המיקרוביאלי על כל משטח דיסק. דגרו את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר שהצלחת בת 48 הבארות הודגרה במשך 24 שעות, פיפטה 850 ליטר של PBS סטרילי על פני השטח של כל אחד מארבעת דיסקי הדגימה וארבעת דיסקי הבקרה, וערבב אותה עם התרחיף המיקרוביאלי.

אוספים כל תערובת תרחיף מיקרוביאלית PBS וכל דיסק מצלחת 48 הבארות, ומעבירים לצינור מעוקר מראש של 15 מ"ל. מערבולת את תערובות ההשעיה והדיסקים המיקרוביאליים של PBS למשך דקה אחת. סוניקציה ב-50 הרץ למשך חמש דקות, ומערבולת שוב למשך דקה אחת כדי להבטיח שלא יישארו מיקרואורגניזמים ברי קיימא דבוקים למשטח החומר.

בצע דילולים סדרתיים עשרוניים של התרביות הסוניקטיביות וצינורות המיקרו-צנטריפוגה הסטריליים המכילים TSB. מורחים 100 ליטר מכל דילול על צלחת TSA, ומדגרים את הצלחות באופן אירובי בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, ספרו את מספר המושבות והביעו את המספר הזה ב-CFU למיליליטר.

לאחר מכן מנותחים תוצאות שיטת יצירת הקשר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. תוצאות בדיקות דיפוזיה של דיסק אגר מראות פעילות לא מיקרוביאלית עבור החומר הראשון, ופעילות אנטיבקטריאלית מוגברת כנגד S.aureus ו-E.coli עבור שלושת החומרים האחרים. גרף זה מציג את ההילה המנורמלת עבור כל דיסקת חומר כנגד S.aureus ו-E.coli לאחר 24 שעות של דגירה.

תוצאות שיטת המגע מצביעות גם על פעילות לא מיקרוביאלית של החומר הראשון, והגברת הפעילות האנטיבקטריאלית נגד חיידקים גרם חיוביים וגראם שליליים עבור שלושת החומרים האחרים. C הוא החיידקים הברי קיימא שהתאוששו מדיסק הבקרה לאחר 24 שעות של דגירה. גרף זה מציג את אחוז אובדן הכדאיות של ארבעת החומרים כנגד S.aureus ו-E.coli על משטחי החומר.

דגימה M1 לא הראתה פעילות מיקרוביאלית. למרות שלא מוצג כאן, אף אחד מארבעת החומרים אינו מסוגל לעכב את צמיחת השמרים, קנדידה אלביקנס, בשיטה אחרת. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע פעילות אנטי-מיקרוביאלית על ידי שתי השיטות המשלימות הללו.