שיטה המבוססות על מיקרו-CT אפיון נגעים ואיתור אלקטרודות במוח בעלי חיים קטנים
November 8th, 2018
מאמר זה מתאר שיטה פשוטה כדי להתכונן מוח בעל חיים קטן מיקרו-CT הדמיה, פצעים אשר ניתן לכמת, אלקטרודות הממוקם עם דיוק גבוהה בהקשר של המוח כולו.
שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח על ידי מתן שיטה פשוטה יותר, פחות נוטה לשגיאות, ושיטה כמותית יותר לאימות נגעים ואיתור מיקומי אלקטרודה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת אימות של נגעים ואתרי אלקטרודה במוח כולו ללא צורך בניתוח. המוצר הסופי הוא נפח תלת-מימדי דיגיטלי של המוח ומוחות מרובים יכולים להיות מעובדים במקביל.
למרות שיטה זו יוכח בחולדה, זה יכול להיות מיושם גם על אורגניזמים אחרים, כגון עכברים פרושים זברה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו כי כמה צעדים דורשים טיפול מסוים כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר. כדי להתחיל, למקם מוח שחולץ בתת פתרון שפע בצינור חרוט 50 מיליליטר.
אחסן את הדגימה במשך יומיים עד שלושה עם רעידות עדינות בארבע מעלות צלזיוס. ודא כי אוסמיניום מדולל במים ולא חיץ. הסיבה לכך היא כי המים יפעלו כמו דטרגנט מתון, המאפשר אוסמיניום לחדור עמוק לתוך הרקמה.
הכינו 50 מיליליטר של 2% אוסיום טטרוקסיד במים מזוקקים כפולים. ואז למקם את המוח בצינור חרוט חדש 50 מיליליטר ולהוסיף את פתרון אוסיום tetroxide. סגור את הצינור ואתום אותו עם סרט פרפין כדי למנוע דליפות.
אחסן את הצינור האטום בארבע מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות במשך שבועיים. ודא כי הצינור ממוקם אופקית. המוח עבה מאוד ודרכים ארוכות לנסוע על ידי דיפוזיה.
הצבת הצינור אופקית תאפשר לאוסמיניום לנוע עמוק יותר לתוך הרקמה. לאחר הדגירה מדגם במשך שבועיים, לשטוף אותו עם מים מזוקקים פעמיים חמש פעמים כדי להסיר את כל osmium tetroxide מאוגד מהדגימה. לאחר מכן, לשטוף את המדגם עם מים מזוקקים כפול במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
החלף את המים מזוקקים כפול עם ארבעה דילול של אתנול כדי לייבש את המדגם. כדי להתחיל את תהליך חדירת שף, להעביר את המדגם דרך שלושה אצטון ושלושה דילולים אצטון שף, ולאחר מכן לטבול את המדגם ב 100% שף בטמפרטורת החדר כדי להמשיך את תהליך החדירה. לאחר מכן, להעביר את הדגימה לתבנית חד פעמית.
להחדיר את המדגם עם טרי 100% שדון במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. דגה את הדגימה בתנור ואקום במשך 15 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. ואז לרפא את הדגימה בתנור במשך 48 שעות ב 60 מעלות צלזיוס.
לבסוף, כאשר המדגם סיים לרפא, לקלף את התבנית החד פעמית ולסרוק אותו עם מכונת מיקרו CT. בניתוח מסורתי, יש לציין מראש את כיוון המוח. באמצעות שיטת מיקרו-CT זו, ניתן לתפעל את הנפח הדיגיטלי של המוח המדגם בשלושה ממדים ולמעשה לחתוך אותו לכל כיוון.
סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים של מוח החולדה המוכן מאשרת כי הרקמה לא נפגעה באופן משמעותי לצורך הדמיית מיקרו-CT. מוח פרוש זברה היה גם מוכן נסרק על פי פרוטוקול זה כדי לבדוק את התועלת של שיטה זו על מוחות בעלי חיים קטנים אחרים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי למצוא נגעים פני השטח במוח, כמו גם נגעים עמוק בתוך המוח.
טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על המיקום של טטרודים בודדים במקום, נגעים אלקטרוליטיים, מסלולי אלקטרודה, מערכי טטרודה במקום, ובדיקות סיליקון במקום. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לאפשר למוח דגירה מספיק זמן עם מספיק תסיסה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אופטוגנטיקה והדמיה של שני פוטון על מנת לענות על שאלות נוספות על התפקיד של אזורי מוח שונים בהתנהגויות שונות.
טכניקה זו יכולה לאפשר לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור טוב יותר את יחסי המבנה-תפקוד בין המוח להתנהגות בחולדות, עכברים, ציפורי שיר ובעלי חיים קטנים אחרים. אל תשכח כי עבודה עם אוסמיניום יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות, כגון ללבוש כפפות ולעבוד במכסה המנוע ואקום תמיד צריך לקחת בעת ביצוע הליך זה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להכנת מוחות של בעלי חיים קטנים, במיוחד מוחות של עכברים, לצורך הדמיית מיקרו-CT. הטכניקה שואפת לכמת פגיעות ולמקם במדויק אלקטרודות מבלי להזדקק לחיתוך, וליצור נפח דיגיטלי תלת-ממדי מקיף של המוח.
מרכיבים מרכזיים של המחקר
תחום המדע
- נוירו-מדע
- טכניקות הדמיה
- ניתוח פגיעות
רקע
- הדמיית מיקרו-CT מאפשרת ניתוח לא הרסני של מבני מוח.
- שיטות חיתוך מסורתיות עלולות להיות מועדות לטעויות ולמגבלות גמישות כיוון.
- שיטה זו משפרת את היכולת לנתח פגיעות ומיקום אלקטרודות.
- מתאים לבעלי חיים קטנים אחרים כמו עכברים וציפורי זברה.
מטרת המחקר
- לפתח שיטת הכנה פשוטה ופחות מועדת לטעויות להדמיית מיקרו-CT.
- לספק מיקום מדויק של פגיעות ואלקטרודות.
- לאפשר מניפולציה תלת-ממדית של דגימות מוח לניתוח משופר.
שיטות ששימשו
- הפלטפורמה העיקרית בשימוש היא הדמיית מיקרו-CT של דגימות מוח מוכנות.
- המודל הביולוגי העיקרי הוא מוח עכבר, אך השיטה ניתנת להתאמה לבעלי חיים קטנים אחרים.
- השיטה כוללת תקופות חדירה ספציפיות ושימוש בטטרוקסיד עשיר באוסמיום להכנת רקמה.
- שלבים קריטיים כוללים מיקום צינור אופקי ושלבי שטיפה מרובים כדי להבטיח חדירת אוסמיום.
- ההכנה הסופית כוללת ריפוי שרף וסריקה באמצעות מכונת מיקרו-CT.
תוצאות עיקריות
- שיטה זו מאפשרת הדמיה של פגיעות, הן פניתיות והן עמוקות במוח.
- היא מאפשרת זיהוי מדויק של מסלולי אלקטרודות ופגיעות תוך שמירה על שלמות הרקמה.
- דגימות סרוקות מראות כי נזק לרקמה מינימלי, מה שמאישש את ההתאמה של הטכניקה.
- ההליך יכול לתמוך בניסויים נוספים כמו אופטוגנטיקה והדמיה דו-פוטונית.
מסקנות
- מחקר זה מדגים שיטה יעילה להכנת מוחות של בעלי חיים לניתוח מפורט באמצעות מיקרו-CT.
- הטכניקה מאפשרת לחוקרים לחקור התנהגות נוירונים ויחסים מבניים מבלי לפגוע בדגימות.
- בסך הכל, היא מגבירה את היכולות של מחקר נוירו-מדע בהבנת מכניקת המוח.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Accurate lesion characterization and electrode localization are critical for validating mechanistic hypotheses in neuroscience-driven drug discovery. This micro-CT-based workflow enables high-resolution, quantitative mapping of brain interventions, reducing manual error and supporting reproducible, cross-study comparisons. The approach enhances predictive confidence at the target validation and preclinical model inflection points, directly impacting translational continuity and portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of lesion placement and electrode localization for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by providing 3D anatomical context for intervention sites.
- Facilitates quantitative comparison of experimental manipulations across studies and models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain models for downstream functional assays and behavioral studies.
- Standardizes lesion and electrode mapping, improving reproducibility and assay reliability.
- Generates digital volumes suitable for automated or manual segmentation and analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns anatomical intervention data with behavioral and functional outcomes in disease-relevant systems.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting multi-modal data integration.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This micro-CT method integrates at the interface of discovery biology and preclinical model validation, bridging anatomical verification with functional and behavioral readouts.
- Discovery Biology: Provides quantitative, 3D verification of experimental manipulations for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, high-resolution anatomical data to support assay readiness and cross-study standardization.
- Analytics: Enables digital measurement and comparison of lesion volumes and electrode positions across conditions.
- Translational Research: Supports alignment of anatomical and functional data for disease-relevant model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, digital workflow adaptable to multiple small animal models and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation studies.
- Operational Value: Streamlines verification processes, enabling parallel sample processing and digital archiving.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by standardizing anatomical validation across programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative anatomical data for model selection and advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue preparation, micro-CT imaging, and digital volume analysis.
- Demands access to micro-CT instrumentation and compatible analysis software (free or proprietary).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample handling and imaging protocols.
- Adaptable to various small animal models with protocol adjustments for tissue size and composition.
- Safety precautions are essential due to hazardous reagents such as osmium tetroxide.
