Name: הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: למד הדמיה תלת ממדית בקנה מידה גדול של ארגון תאי קליפת המוח בעכברים. שיטה זו חושפת מבנים תלת ממדיים ומאפשרת ניתוח מקיף של סוגי תאים עצביים ותפקודם במערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אטסשי המייאוואקי וחמאת הירושי לעצה שלהם על הניסויים elAbSca, צ'ארלס Yokoyama לעריכה של כתב היד, Ohshima אריקו, מיוקי Kishino לסיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמך על ידי קרנות מחקר של RIKEN תוצרת הארץ, Grants-in-Aid למחקר מדעי של משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT) של יפן כדי תוצרת הארץ (אזורים חדשני "Mesoscopic Neurocircuitry"; 22115004), אס (25890023).

כל ההליכים ניסיוני היו אושרה על ידי RIKEN Wako חיה ניסויים ועדת ועדת הבטיחות של הניסוי רקומביננטי RIKEN גנטי, שבוצעה על פי הנחיות המוסדי של מתקנים בעלי חיים של מדע המוח RIKEN המכון.
1. הכנת הדמיה צ'יימברס
<ol><li>
הדמיית חדר19
	<ol>
<li>באמצעות יריעות גומי סיליקון, להכין חדר עם עובי של 5 מ מ, רצפת לוחות בעוביים שונים. בנוסף, מכינים צלחות פטרי עם או בלי זכוכית תחתון (איור 1 א').</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מרווח פרוסה
	<ol>
<li>להכין את מפרידי להחזיק דגימות, באמצעות יריעות גומי סיליקון עם עובי של 0.5 מ מ (איור 1C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מעקב הזרקה
הערה: לבצע זריקות לתוך פונס (2.1) או רקתי עליון (2.2). זריקה לתוך הנוירונים הקרנה מוחי תת תווית פונס באזור המוח רחב כולל האזורים חזותי, מנוע, תוך הזרקה לתוך הנוירונים הקרנה מוחי תת תוויות רקתי עליון באזור החזותי. לניסויים שליטה, להזריק תמיסת. סאלין במקום כולירה fluorescently התווית על-ידי יחידת משנה של הרעלן B. לשם קיום תנאי סטרילי להשתמש בכפפות פלסטיק לנקות עם אתנול וציוד מעוקר.
<ol><li>
לעשות זריקות לתוך פונס של עכברים בוגרים.
	<ol>
<li>לצייר µL 1 של כולירה fluorescently התווית על-ידי יחידת משנה של הרעלן B (25 µg/µL ב- PBS) לתוך מזרק G המילטון 26.</li>
		<li>במקום משאבת מזרק על המזרק.</li>
		<li>מקם את המזרק ואת משאבת את הכלי המחזיק תחמן על מכשיר stereotaxic. להטות manipulator 12° posteriorly מן הציר האנכי.</li>
		<li>עזים ומתנגד זכר או נקבה בוגרת עכבר (C57BL/6J או Tlx3-cre/Ai9) על ידי הזרקת סודיום פנטוברביטל intraperitoneally (60 מ"ג/ק"ג משקל גוף) או על ידי מתן איזופלוריין (2-3%). המתן עד העכבר הופך ללא תגובה כאשר זנבו הוא צבט עם מלקחיים, המציין כי העכבר הוא מורדם לחלוטין.</li>
		<li>הנח את העכבר על הכלי stereotaxic.</li>
		<li>הסר בזהירות את השיער בעזרת סכין גילוח כדי למנוע זיהום ולחתוך 10 מ מ של הקרקפת כך bregma ואת למדא גלויים. לנהל 0.1 מ"ל של לידוקאין 1% באמצעות פיפטה. לקבוע את הזווית של הראש על-ידי התאמת המיקום האנכי של פיו על הכלי stereotaxic כך bregma ואת למדא באותה הרמה-z.</li>
		<li>להתאים את המיקום של manipulator על-ידי הזזה על הכלי stereotaxic כך קצה המזרק הוא קרוב bregma ולהקליט את המיקום של manipulator. . משכי את המזרק על-ידי הזזת כלי המחזיק על manipulator</li>
		<li>להזיז manipulator 5.4 מ"מ posteriorly ו- 0.4 מ מ רוחבית. לקדם את המזרק כך הטיפ הוא קרוב נקודת הכניסה על הגולגולת. . משכי את המזרק ולסמן את נקודת הכניסה.</li>
		<li>במיקום המסומן, לקדוח חור בקוטר של-1 מ מ.</li>
		<li>הכנס קצה המזרק דרך החור כך העומק טיפ הוא 6.9 מ מ יותר מאשר זה נמדד ב- bregma.</li>
		<li>מזריקים µL 1 של המשדרים באמצעות המשאבה ב 0.2 µL/דקה.</li>
		<li>הסר את המזרק המוח.</li>
		<li>במידת הצורך, לכסות את המוח החשוף עם רסיסי microfibrillar עוצר דימום, דבק מיידית.</li>
		<li>לשטוף את המוח החשוף באמצעות תמיסת מלח הנכללת פיפטה כדי למנוע זיהום, תפר את הקרקפת.</li>
		<li>הסר את העכבר הכלי stereotaxic. לאפשר את העכבר כדי להתאושש מן ההרדמה באינקובטור ב 30 הלעפה תרוטרפמט, בדרך כלל עבור 1 h. אין להשאיר את העכבר ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. להחזיר את העכבר מחברתם של חיות אחרות אחרי זה הוא החלים לחלוטין.</li>
		<li>לשמור על העכבר 3 – 7 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לעשות זריקות לתוך רקתי עליון של עכברים בוגרים.
	<ol>
<li>הכן על פיפטה מזכוכית בקוטר עצה של 30 עד 50 מיקרומטר.</li>
		<li>להתחבר על פיפטה מזכוכית מזרק המילטון דרך צינור פלסטיק (איור 2 א).</li>
		<li>למלא את פיפטה מזכוכית, צינור פלסטיק, המילטון מזרק עם הנוזל פרפין.</li>
		<li>במקום משאבת מזרק על המזרק.</li>
		<li>למקם את פיפטה מזכוכית manipulator ותטה manipulator 60° posteriorly מן הציר האנכי (איור 2B).</li>
		<li>לבצע 2.1.4–2.1.9. המיקום של manipulator הוא 1.4 מ מ אחורי, צדדי 0.5 מ מ ל למדא.</li>
		<li>במקום סרט פרפין פלסטיק קטן על הגולגולת ולאחר מכן לשים כ 1 µL של הפתרון מעקב על זה. במהירות לקדם את פיפטה מזכוכית ולמלא אותו לפחות 0.5 µL של הפתרון מעקב.</li>
		<li>הכנס את פיפטה מזכוכית כך העומק עצה היא 3.0 מ מ פני המוח.</li>
		<li>מזריקים µL 0.5 של המשדרים באמצעות המשאבה ב 0.2 µL/דקה.</li>
		<li>הסר את פיפטה מזכוכית של המוח.</li>
		<li>לבצע 2.1.13–2.1.16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. קיבוע וגיזום
<ol><li>להזריק סודיום פנטוברביטל (60 מ"ג/ק"ג משקל גוף) intraperitoneally לתוך עכבר (C57BL/6J או Tlx3-cre/Ai9, עם או בלי הזריקה מעקב כפי שמתואר בשלב 2. המתן עד העכבר הופך ללא תגובה כאשר זנבו הוא צבט עם מלקחיים, המציין כי העכבר הוא מורדם לחלוטין.</li>
	<li>המתת חסד העכבר בצורה אנושית על ידי פרפוזיה transcardially העכבר20 עם סליין 0.9%.</li>
	<li>לתקן את העכבר20 על-ידי פרפוזיה 4% paraformaldehyde (PFA) במאגר פוספט 0.1 M (pH 7.5).</li>
	<li>
חותכים את הקרקפת בעזרת זוג מספריים כדי לחשוף את הגולגולת כפי שמתואר20.
	<ol>
<li>חותכים האמצע של הגולגולת החשופים בעזרת זוג מספריים. הסר את הגולגולת באמצעות מלקחיים.</li>
		<li>אם מסמנים את המיקום של bregma ולמבדה הינם הכרחיים, להסיר תחילה והזיז חצי אחד של הגולגולת. להכניס מחטים טונגסטן דק לתוך המוח-העמדות של bregma, למדה על הגולגולת שנותרו על המוח, ולאחר מכן הסר את הגולגולת הנותרים. הערה: המוח יכול להיות מאוחסן PBS ב 4 הלעפה תרוטרפמט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כדי לבצע נוגדן מכתים של נוירונים מעכבות, לחתוך את דגימות המוח לפרוסות.
	<ol>
<li>מניחים את הדגימה המוח על vibratome.</li>
		<li>חותכים פרוסות עד עבה ב- PBS בטמפרטורת החדר 500 מיקרומטר, המשך לצעד שלב 5 (שיטת e AbScal).</li>
	</ol>
</li>
	<li>אם הנוגדן מכתים מיותרים, קישוט לדוגמה המוח כדי חוסמת (עד 3 מ מ עובי) בעזרת סכין גילוח (איור 3), לשלב 4 (שיטת SeeDB). הערה: המוח יכול להיות מאוחסן PBS ב 4 ° C לאחר חיתוך או חיתוך. שיטת SeeDB עדיפה כאשר נוגדן מכתים אינה נחוצה מכיוון שהיא דורשת פחות זמן מאשר שיטת elAbSca.</li>
</ol>4. ניקוי ללא נוגדנים מכתים (שיטת SeeDB)
<ol><li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 20% (w/v) פרוקטוז, דגירה זה במשך 4 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 40% (w/v) פרוקטוז, דגירה זה במשך 4 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 60% (w/v) פרוקטוז, דגירה זה במשך 4 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 80% (w/v) פרוקטוז, תקופת דגירה זה של 12 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 100% (w/v) פרוקטוז, תקופת דגירה זה של 12 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 80.2% פרוקטוז (w/w), תקופת דגירה זה של 24 שעות ייבוש עדין בטמפרטורת החדר. הערה: לטפל המדגם בקפידה כדי לשמור על העיוותים קטן ככל האפשר. לא דגירה דגימות יותר הצביעו, כמו דגימות במהירות יכול להיות אטום.</li>
	<li>להטביע את הדגימה תא ההדמיה מלא עם הפתרון פרוקטוז 80.2% (איור 1B). במידת הצורך, לתקן את הדגימה על ידי לשים חתיכות קטנות של דבק גומי מסביב. אם החדר הוא עמוק מדי, לשים צלחת קומה בבית הבליעה לפני הצבת את הדגימות.</li>
	<li>מניחים על צלחת פטרי עם כיסוי זכוכית על תא הדמיה ולשים מים המנה, ואת התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים עם זמן עובד מרחק אובייקטיבי טבילה במים. עירור אורכי גל ומסננים פליטה מתוארים בטבלה 1. אם יש צורך, להשתמש במה ממונע.</li>
</ol>5. ניקוי עם נוגדן מכתים (שיטת e AbScal)
<ol><li>להכין ריאגנטים כפי שמתואר בטבלה 2.</li>
	<li>להעביר את פרוסות בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 5 מ"ל המכיל 4 מ"ל של פתרון סרוק/eS0 ואת תקופת דגירה אותם של 12 שעות עם טלטול עדין ב 37 מעלות צלזיוס (איור 4B).</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של פתרון סרוק/eA2 ואני דגירה הפרוסות עבור h 36 ברעידות עדין ב 37 º C.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של פתרון סרוק/eB4 ואני דגירה הפרוסות במשך 24 שעות ייבוש עדין ב 37 º C.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של פתרון סרוק/eA2 ואני דגירה הפרוסות במשך 12 שעות ייבוש עדין ב 37 º C.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל ל- PBS, דגירה הפרוסות במשך 6 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר בזהירות את הפרוסות כדי צינור פלסטיק 2 מ"ל בעזרת מרית.</li>
	<li>דגירה עם ראשי נוגדנים (טבלה 3) ב 1 מ"ל של AbScale פתרון עבור 48-72 h ב 37 מעלות צלזיוס (איור 4C) ברעידות עדין.</li>
	<li>הסר בזהירות את הפרוסות כדי צינור פלסטיק מ ל בעזרת מרית.</li>
	<li>דגירה ב 4 מיליליטר AbScale פתרון 2 h 2 פעמים בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.</li>
	<li>הסר בזהירות את הפרוסות כדי צינור פלסטיק 2 מ"ל בעזרת מרית.</li>
	<li>דגירה עם שכותרתו fluorescently משני נוגדנים (טבלה של חומרים, בטחונות) ב 1 מ"ל של AbScale פתרון עבור h 48-37 ° C עם טלטול עדין.</li>
	<li>בזהירות להסיר את פרוסות בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 5 מ"ל המכיל 4 מ"ל של הפתרון elAbSca, דגירה הפרוסות במשך 6 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של הפתרון elAbSca, דגירה את הפרוסות לקבלת 2 h 2 פעמים עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הפתרון מהצינור באמצעות פיפטה ולהוסיף 4 מ"ל של 4% PFA דגירה הפרוסות עבור h 1 ברעידות עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל ל- PBS, דגירה הפרוסות עבור h 1 ברעידות עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של הפתרון סרוק/eS4, דגירה הפרוסות במשך 12 שעות ייבוש עדין ב 37 º C.</li>
	<li>מקם את מרווח על משטח זכוכית מניחים את הפרוסות מרווח, לטבול את הפרוסות עם פתרון סרוק/eS4. חותם את מרווח עם כיסוי זכוכית (איור 1D).</li>
	<li>שים מים על חיפוי זכוכית ועל התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים עם זמן עובד מרחק אובייקטיבי טבילה במים. אם יש צורך, להשתמש במה ממונע. הערה: לבדוק החלקים עמוק של המדגם מסומנות באופן דומה לחלקים שטחית לאשר בהיעדר דעה קדומה תיוג משמעותית. הערה: חדירה של הנוגדנים שנבדקו מתוארת בטבלה3.</li>
</ol>6. תא בנחישות עמדה
<ol><li>לכל תפקיד של תמונות סרוקות, לחשב את ערכי המתאם באמצעות מסנן תלת ממדי התמונה14 (איור 5A-5D).</li>
	<li>לקבוע את העמדות של הפסגות של הערך קורלציה (איור 5D).</li>
	<li>לחקור תמונות סביב הפסגות כדי לאתר תאים (איור 5E).</li>
</ol>

<ol><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li>
<li>Defelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), aac9462(2015).</li>
<li>Sorensen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+gene+expression+and+target+specificity+demonstrate+excitatory+projection+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity.</a> Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347, 1138-1142 (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li>
<li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell-type+classification%3A+Challenges%2C+opportunities+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li>
<li>Horton, J. C., Adams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cortical+column%3A+a+structure+without+a+function%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The cortical column: a structure without a function.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).</li>
<li>Costa, N. M., Martin, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+cortical+column+would+that+be%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Whose cortical column would that be?</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).</li>
<li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).</li>
<li>Hioki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+inhibitory+inputs+to+dendritic+and+somatic+compartments+of+parvalbumin-expressing+neocortical+interneuron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron.</a> Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).</li>
<li>Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+organization+of+a+major+subtype+of+pyramidal+neurons+in+neocortical+layer+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V.</a> Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).</li>
<li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-dependent+posttranscriptional+regulation+of+NOS1+by+FMRP+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex.</a> Cell. 149 (4), 899-911 (2012).</li>
<li>Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+system+of+functionally+distinct+cell+types+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex.</a> Science. 358 (6363), 610-615 (2017).</li>
<li>Treweek, J. B., Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+structural+and+functional+features+of+widely+distributed+biological+circuits+with+single+cell+resolution+via+tissue+clearing+and+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors.</a> Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Principles+in+Tissue+Clearing+and+Staining+Protocols+for+Whole-Body+Cell+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).</li>
<li>Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENSAT+BAC+cre-recombinase+driver+lines+to+study+the+functional+organization+of+cerebral+cortical+and+basal+ganglia+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Kim, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+scalable+proteomic+imaging+for+high-dimensional+profiling+of+intact+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+mapping+of+neuronal+circuitry+with+an+index-optimized+clearing+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent.</a> Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+%283D%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631(2016).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex%2C+quantitative+cellular+analysis+in+large+tissue+volumes+with+clearing-enhanced+3D+microscopy+%28Ce3D%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הוצגו הליכים כדי לקבל תמונות תלת-ממדיות בקנה מידה גדול של הארגון ייחודיים לסוג התא הסוגים העיקריים התא בשכבה neocortical העכבר, 5. לעומת ההכתמה פרוסה קונבנציונאלי, השיטה זו יותר שימושי לקביעת הארגון תלת מימדי של קליפת. השיטה מאפשרת ייבוא תמונות מ רחבה יותר, האזורים במוח עמוק יותר בהשוואה טיפוסי ויוו פוטון 2 מיקרוסקופ או קונבנציונלי מיקרוסקופיה קונפוקלית ו, לפיכך, יכול לאפשר ניתוח מקיף של הטלפון הסלולרי neocortical ארגון.
שלב קריטי של השיטה היא החדירה נוגדן. תת-קבוצה של נוגדנים מראה ענ...

קליפת בתרבית של מורכב של מספר רב של סוגי תאים, אחד עם דפוסי ביטוי גנים ספציפיים, אלקטרופיזיולוגיות ומאפייני הביוכימי, קשרים סינפטיים, ופונקציות ויוו 1,2 ,3,4,5,6,7. בין אם אלה סוגי תאים מאורגנים מבנים חוזרים ונשנים כבר לא ברור. קורטיקלית, כולל העמודות האוריינות החזותית וחביות המגע, יש לחזור על מבנים, אך הארגון הסלולר שלהם נשאר לא ברור8,9. אלה נמצאים אזורים קורטיקליים מסוימים והם אינם המערכת כולו במוח.
בשכבה neocortical 5, רובם המכריע של נוירונים מסווגים לארבעה סוגים עיקריים. סוג העיקריים של נוירונים סינאפסות, הקרנה מוחי תת הנוירונים, פרויקטים אקסונים אל המטרות subcortical לרבות פונס, חוט השדרה, רקתי עליון ומייצג, לכן, מסלול פלט קורטיקלית הגדולות10. הקרנה קורטיקלית הנוירונים, סוג מרכזי נוסף של הנוירונים סינאפסות, innervate קליפת10. נוירונים מעכבות גם להכיל שני מעמדות עיקריים: תאים parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין11.
ניתוחים אחרונים מציינים סוגי תאים ארבע מאורגנות מבנים חוזרים ונשנים12,13,14. הקרנה מוחי תת נוירונים12,13,14 והן נוירונים בקליפת המוח הקרנה14 לארגן סוג התא microcolumns ספציפיים בקוטר של 1-2 תאים. תאים Parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין ישר במיוחד microcolumns של נוירונים הקרנה מוחי תת אבל לא עם microcolumns של נוירונים בקליפת המוח הקרנה14. Microcolumns את עצמם מעת לעת יתיישר טופס משושה סריג מערך14 , קיימים אזורים קורטיקליים מרובים כולל אזורים חזותי, המגע, מנוע12,מוח העכבר14 בשפה אזורי המוח האנושי13. נוירונים ב- microcolumn בודדים התערוכה פעילות מסונכרנת ויש תגובות החישה דומה14. מקרים אלה מצביעים על סוגי תאים בשכבה 5 לארגן לתוך מבנה סריג microcolumn המייצג הארגון ברחבי המוח הידוע הראשון של חוזרות מודולים פונקציונליים.
Microcolumns יש רדיוס של 10 מיקרומטר ויש על תקופתיות המרחבי כ-40 מיקרומטר. בנוסף, כיוון microcolumns הוא מקביל שלהם דנדריטים הפסגה, משתנה בהתאם למיקום שלהם ב- קליפת14. לכן, מערכת microcolumn קשה לנתח באמצעות פרוסות קורטיקלית קונבנציונאלי עם עובי טיפוסי של כמה עשרות מיקרומטר. בנוסף, הניתוח של תקופתיות דורשת נתונים תלת-ממדיים של מגוון רחב של אזורים במוח, ולכן אזור ההדמיה טיפוסי של מיקרוסקופיה קונפוקלית או ויוו הדמיה 2-פוטון הוא צר מדי.
לאחרונה פותחו טכניקות כדי לנקות רקמות בעובי15,16. כאן נתאר היישום של שיטות אלה כדי להשיג בקנה מידה גדול, תלת מימדי תמונות הסוגים העיקריים התא בשכבה neocortical העכבר 5 המרכיבים את המערכת microcolumn. הקרנת subcerebral נוירונים מסומנים על-ידי תיוג רטרוגרדית או הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת ב- Crym-egfp העכברים הטרנסגניים12, והקרנה קורטיקלית נוירונים מסומנים על-ידי גם הכוכבים תיוג או על-ידי הביטוי tdTomato ב Tlx3-cre-/Ai9-עכברים-17. תאים Parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין מסומנות על ידי אימונוהיסטוכימיה. שיטה (נוגדן בקנה מידה S) AbScale18 משמש הנוגדן מכתים ניסויים, ואילו בשיטה SeeDB (ראה מוחי עמוק)19 משמש לניסויים אחרים. שיטות אלה להתגבר על הקשיים הנ של שיטות הדמיה קונבנציונאלי ולחשוף הארגון הסלולר מדויק של שכבה 514.

<table><tbody><tr><td>עכברים טרנסגניים Crym-egfp</td><td>MMRRC</td><td>012003-UCD</td><td></td></tr><tr><td>Tlx3-cre עכברים טרנסגניים</td><td>MMRRC</td><td>36547-UCD</td><td></td></tr><tr><td>ROSA-CAG-flox-tdעכברי עגבניות</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>JAX #7909</td><td></td></tr><tr><td>יריעת גומי סיליקון</td><td>AS ONE</td><td>6-611-01</td><td>בעובי 0.5 מ"מ</td></tr><tr><td>יריעת גומי סיליקון</td><td>AS ONE</td><td>6-611-02</td><td>1.0 מ"מ עובי</td></tr><tr><td>יריעת גומי סיליקון</td><td>AS ONE</td><td>6-611-05</td><td>עובי 3.0 מ"מ</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>פלקון</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>מטסונאמי</td><td>C022241</td><td></td></tr><tr><td>תת-יחידה B של רעלן כולרה (רקומביננטי), Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>C22841</td><td></td></tr><tr><td>תת-יחידה B של רעלן כולרה (רקומביננטי), Alexa Fluor 555 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>C22843</td><td></td></tr><tr><td>תת-יחידה B של רעלן כולרה (רקומביננטי), Alexa Fluor 594 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>C22842</td><td></td></tr><tr><td>תת-יחידה B של רעלן כולרה (רקומביננטי), Alexa Fluor 647 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>C34778</td><td></td></tr><tr><td>26 G מזרק המילטון</td> משאבת מזרק <td>המילטון</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>KD</td><td>Scientific</td><td>KDS 310</td><td>פונס</td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td> הזרקה<td>KD Scientific</td><td>KDS 100</td> מניפולטור <td>הזרקת קוליקולוס מעולה</td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פנטוברביטל</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>Somnopentyl</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>פייזר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לידוקאין</td><td>AstraZeneca</td><td>Xylocaine הזרקת 1% עם מקדחה אפינפרין</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Avitene microfibrillar hemostat</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>Alonalfa</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td>Alonalpha A</td><td></td></tr><tr><td>חממת משי כירורגית</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>UVP</td><td></td><td>HB-1000 Hybridizer</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית פיפטה</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>חולץ אלקטרודות</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>פרפין נוזלי, קל</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Otsuka</td><td>1326</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td></td></tr><tr><td>מחט טונגסטן</td><td>Inter medical</td><td>&Phi; 0.1 *L200 מ"מ</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור פלסטיק</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-thioglycerol</td><td>Nacalai tesque</td><td>33709-62</td><td></td></tr><tr><td>D(-) Fructose</td><td>Nacalai tesque</td><td>16315-55</td><td></td></tr><tr><td>BluTack</td><td>Bostik</td><td>CKBT-450000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דו-פוטוני</td><td>Nikon</td><td>A1RMP</td><td></td></tr><tr><td>טבילה במים מטרות למרחקים ארוכים</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 מ"מ</td><td></td></tr><tr><td>טבילה במים מטרות עבודה למרחקים ארוכים</td><td>Nikon</td><td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 מ"מ</td><td></td></tr><tr><td>שלב ממונע</td><td>COMS</td><td>PT100C-50XY</td><td></td></tr><tr><td>מסנן</td><td>Semrock</td><td>FF01-492/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>מסנן</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>פילטר</td><td>Semrock</td><td>FF03-575/25-25</td><td></td></tr><tr><td>מסנן</td><td>Semrock</td><td>FF01-629/56</td><td></td></tr><tr><td>מסנן</td><td>Chroma</td><td>D605/55m</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינור פלסטיק</td><td>כצינור</td> פלסטיק <td>VIO-5B</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>0030120094</tr><tr><td>Urea</td><td>Nacalai tesque</td><td>35905-35</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>191612</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-sorbitol</td><td>Wako</td><td>191-14735</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&beta;-cyclodextrin</td><td>Tokyo chemical industry</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;- ציקלודקסטרין</td><td>וואקו</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל-L-הידרוקסיפרולין</td><td>חומרים פעילים חיוניים לעור</td><td>33996-33-7</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>נקלאי טסק</td><td>13445-45</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (1.1 גרם/מ"ל)</td><td>Nacalai tesque</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG (H+L) נספג צולב משני נוגדן, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד עכבר IgG (H+L) נספג צולב, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>טבילה במים מטרות עבודה למרחקים ארוכים</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 מ"מ</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>ABN78</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Statb2</td><td>Abcam</td><td>ab51502</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD67</td><td>Millipore</td><td>MAB5406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GABA</td><td>Sigma</td><td>A2052</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Swant</td><td>235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Frontier Institute</td><td>PV-Go-AF460</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פרוואלבומין</td><td>סיגמא</td><td>P3088</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פרוואלבומין</td><td>Abcam</td><td>ab11427</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-סומטוסטטין</td><td>מעבדות חצי האי</td><td>T-4103</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-c-Fos</td><td>CalbioChem</td><td>PC38</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

קליפת בתרבית של מורכב של סוגים רבים של נוירונים סינאפסות, כל אחד עם מאפייני אלקטרופיזיולוגיות וביוכימי ספציפיים, קשרים סינפטיים, ופונקציות ויוו , אבל שלהם basic אנטומי פונקציונלי הארגון של הסלולר לקנה המידה רשת ממעטים להבין. כאן נתאר שיטת ההדמיה תלת מימדי של נוירונים שכותרתו fluorescently על פני שטחים נרחבים של המוח לחקירה של הארגון סלולרי קורטיקלית. סוגי נוירונים ספציפיים מסומנים על ידי ההזרקה של פלורסנט המשדרים עצביים רטרוגרדית או ביטוי של חלבונים פלורסנט ב העכברים הטרנסגניים. בלוק המוח דגימות, למשל, האונה, המוכנים על קיבעון, עשה שקוף עם רקמת ניקוי שיטות, נתון פלורסנט immunolabeling של סוגי תאים מסוים. אזורים גדולים נסרקים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים מצויד גדול לעבוד מרחק מטרות ושלבים ממונע. בשיטה זו ניתן לפתור הארגון תקופתי של המודולים פונקציונליים ייחודיים לסוג microcolumn תא בתוך קליפת העכבר. ההליך יכול להיות שימושי לצורך המחקר של אדריכלות סלולרית תלת מימדי אזורי מוח שונים וברקמות מורכבים אחרים.

אנו תווית נוירונים בקליפת המוח הקרנה באמצעות הביטוי של tdTomato ב Tlx3-creהעכברים הטרנסגניים /Ai9, דמיינו נוירונים הקרנה מוחי תת ידי הזרקת את רכיב המעקב רטרוגרדית CTB488 לתוך פונס. האונה השמאלית של המוח היה נתון לשיטת SeeDB וייסרק באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים מצויד זמן עובד מרחק אובייקטיבי טבילה במים (25 X, נ. א 1.1, ומרחק עבודה 2 מ מ) ו שלב ממונע. ערימה של תמונות 401 (512 x 512 פיקסלים; גודל הפיקסל = 0.99 מיקרומטר) בשלב-z = 2.8 µm בכל אחד 30 סריקה עמדות הושג. הגופים ת...

כאן נתאר תהליך ניקוי רקמות, תיוג פלורסנט של הדמיה בקנה מידה גדול של רקמת מוח העכבר המאפשרת, ובכך, ויזואליזציה של הארגון תלת מימדי של סוגי תאים בתוך קליפת.

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח כגון ניתוח המבנה והתפקוד של הניאו-קורטקס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לחשוף את המבנה התלת מימדי בקנה מידה גדול במוח. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הניאו-קורטקס, ניתן ליישם אותה גם על מערכות עצבים אחרות כמו חוט השדרה.כדי להזריק את העוקב לתוך הפונסים של העכברים הבוגרים, צייר תחילה מיקרוליטר אחד של תת-יחידה B של רעלן כולרה המסומן בפלואורסצנט לתוך מזרק המילטון בגודל 26. הנח משאבת מזרק על המזרק, ולאחר מכן הנח את המזרק והמשאבה על מחזיק הכלי של מניפולטור על מכשיר סטריאוטקסי. הטה את המניפולטור 12 מעלות לאחור מהציר האנכי.לאחר מכן, הנח את העכבר על המכשיר הסטריאוטקסי. בעזרת סכין גילוח, הסר את שיערו כדי למנוע זיהום. לאחר מכן חותכים 10 מילימטרים מהקרקפת כך שהברגמה והלמבדה נראים לעין.יש לתת 0.1 מיליליטר של 1% לידוקאין באמצעות פיפטה. הגדר את זווית הראש על ידי התאמת המיקום האנכי של הפיה במכשיר הסטריאוטקסי כך שלברגמה וללמבדה תהיה אותה רמת Z. לאחר מכן, התאם את מיקום המניפולטור על ידי החלקתו על המכשיר הסטריאוטקסי כך שקצה המזרק יהיה קרוב לברגמה.רשום את מיקום המניפולטור. משוך את המזרק על ידי הזזת מחזיק הכלי על המניפולטור. לאחר מכן הזז את המניפולטור 5.4 מילימטרים לאחור ו -0.4 מילימטרים לרוחב.קדם את המזרק כך שהקצה יהיה קרוב לנקודת הכניסה בגולגולת, ואז החזר את המזרק וסמן את נקודת הכניסה. במצב המסומן, קדחו חור בקוטר של כמילימטר אחד. הכנס את קצה המזרק דרך החור כך שעומק הקצה יהיה 6.9 מילימטרים יותר מזה שנמדד בברגמה.לאחר מכן, הזריק מיקרוליטר אחד של עוקבים באמצעות המשאבה במהירות של 0.2 מיקרוליטר לדקה. לאחר ההזרקה, הסר את המזרק מהמוח. במידת הצורך, כסו את המוח החשוף בשברים קטנים של המוסטט מיקרופיברילר ודבק מיידי.נגב את המוח החשוף במי מלח כדי למנוע זיהום ולתפור את הקרקפת. לאחר מכן, הסר את העכבר מהמכשיר הסטריאוטקסי. אפשרו לעכבר להתאושש מההרדמה באינקובטור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך כשעה.אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה עצם החזה. החזר את העכבר לחברת בעלי חיים אחרים לאחר שהתאושש לחלוטין. כדי לאסוף את רקמת המוח, חתכו את הקרקפת באמצעות מספריים כדי לחשוף את הגולגולת.לאחר מכן, חותכים את קו האמצע של הגולגולת החשופה בעזרת מספריים. לאחר מכן, הסר את הגולגולת באמצעות מלקחיים. אם יש צורך לסמן את מיקום הברגמה והלמבדה, הסר תחילה צד אחד של הגולגולת.לאחר מכן הכניסו מחטי טונגסטן דקות למוח במיקומי הברגמה והלמבדה, ואז הסירו את הגולגולת שנותרה. לאחר מכן, הנח את דגימת המוח על פלטפורמת הרטט. חותכים את החלקים בעובי של עד 500 מיקרומטר ב- PBS בטמפרטורת החדר.בהליך זה, העבירו את הפרוסות לצינור פלסטיק של חמישה מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של תמיסת Scale S0. לאחר מכן דגרו אותם למשך 12 שעות עם ניעור עדין ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר 12 שעות הסר את התמיסה מהצינור באמצעות פיפטה והוסף ארבעה מיליליטר תמיסת סולם A2.דוגרים על הפרוסות למשך 36 שעות בניעור עדין בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 36 שעות, הסר את התמיסה מהצינור והוסף ארבעה מיליליטר תמיסת סולם B4. דוגרים על הפרוסות למשך 24 שעות בניעור עדין בחום של 37 מעלות צלזיוס.לאחר 24 שעות, הסר את התמיסה מהצינור והוסף ארבעה מיליליטר תמיסת סולם A2. דוגרים על הפרוסות למשך 12 שעות בניעור עדין בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 12 שעות, הסר את התמיסה מהצינור והוסף ארבעה מיליליטר PBS.דוגרים את הפרוסות למשך שש שעות בניעור עדין בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר בזהירות את הפרוסות לצינור פלסטיק של שני מיליליטר. דגרו אותם עם נוגדן ראשוני במיליליטר אחד של תמיסת AB Scale למשך 48 עד 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין.לאחר מכן, הסר בזהירות את הפרוסות לצינור פלסטיק של חמישה מיליליטר. דגרו אותם בארבעה מיליליטר של תמיסת AB Scale למשך שעתיים פעמיים בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין. לאחר מכן, הסר בזהירות את הפרוסות לצינור פלסטיק של שני מיליליטר.דגירה עם נוגדן משני עם תווית פלואורסצנטית במיליליטר אחד של תמיסת AB Scale למשך 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין. הסר בזהירות את הפרוסות לצינור פלסטיק של חמישה מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של תמיסת הנוגדן Scale ודגירה על הפרוסות במשך שש שעות בניעור עדין בטמפרטורת החדר. הסר את התמיסה והוסף ארבעה מיליליטר מתמיסת AB Scale ודגר את הפרוסות למשך שעתיים פעמיים עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הסר את התמיסה והוסף ארבעה מיליליטר של 4% PFA ודגר את הפרוסות למשך שעה עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את התמיסה והוסף ארבעה מיליליטר PBS ודגר את הפרוסות למשך שעה עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר. הסר את התמיסה והוסף ארבעה מיליליטר מתמיסת Scale S4 ודגר את הפרוסות למשך 12 שעות בניעור עדין בחום של 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הניחו את המרווח על שקופית זכוכית והניחו את הפרוסות במרווח וטבלו את הפרוסות בתמיסת Scale S4. אטום את המרווח עם זכוכית כיסוי. שים מעט מים על זכוכית הכיסוי ודמיין את הפרוסות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או דו-פוטונית עם מטרה לטבול במים למרחקים ארוכים.במחקר זה, נוירוני הקרנה בקליפת המוח סומנו בירוק על ידי ביטוי tdTomato בעכברים טרנסגניים Tlx3-cre AI9 ונוירונים של הקרנה תת-מוחית במג'נטה הודגמו על ידי הזרקת העוקב הרטרוגרדי CTB488 לתוך הפונים בגיל שבעה שבועות. זוהי התצוגה העליונה המציגה את המיקומים המשוערים של אזורים בקליפת המוח. להלן התצוגות האלכסוניות של הקרינה CTB488 המציגות נוירונים של הקרנה תת-מוחית ופלואורסצנטיות tdTomato המציגות נוירונים של הקרנה בקליפת המוח וזו התמונה הממוזגת.גופי התאים של שני סוגי התאים נראו על פני מגוון רחב של אזורי מוח וחתכים אופטיים הראו עמודות מיקרו מחזוריות. תמונה זו מציגה את גופי התאים והדנדריטים האפיקליים של נוירוני הקרנה תת-מוחיים המבטאים eGFP בחתך אופטי של עכבר Crym-eGFP ותמונה זו מציגה את התאים המבטאים פרוואלבומין המסומנים בנוירוני הקרנה ירוקים ותת-מוחיים המסומנים במג'נטה על ידי הזרקת CTB488 לתוך הפונים של עכבר C57 Black 6 בשיטת סולם הנוגדנים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו עיבוד תמונה תלת מימדית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אפיון כמותי של ארגון המוח.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של קליפת המוח לחקור ארגון מודולרי חדש במוח העכבר.

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

ימנית זווית microprisms מוכנס לתוך הניאוקורטקס העכבר מאפשר הדמיה עמוק של שכבות מרובות קליפת המוח עם מבט נמצא בדרך כלל פרוסה. אחת מילימטר microprisms מציעים בתחום של נוף רחב (~ 900 מיקרומטר) והחלטות מרחבי מספיק כדי לפתור את הקוצים הדנדריטים. אנו מדגימים שכבה V הדמיה עצבית הדמיה של כלי הדם neocortical באמצעות microprisms.

בתחום ההדמיה vivo של שכבות קליפתיים עמוק באמצעות Microprism

בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור...

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

מיקרוסקופיה multiphoton של איברים שלמים עכבר ניתן על ידי ניקוי האיברים אופטיים לפני ההדמיה, אך לא כל הפרוטוקולים לשמר את אות הניאון של חלבוני ניאון. באמצעות שיטה אופטית סליקה עם התייבשות אתנול מבוסס ואלכוהול בנזיל: סליקה בנזואט נזיל, אנחנו מראים תמונות multiphoton ברזולוציה גבוהה של כל המוח של עכבר מביע YFP.

Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

אנו מתארים פרוטוקול עבור videoimaging בזמן האמת של הנדידה עצבית במוח הקדמי בעכבר. ההגירה של מבשרי נוירונים שכותרת-ויראלי או מושתלים נרשמה בפרוסות חיות חריפות באמצעות הדמית ניאון שדה רחב עם מרווח רכישה מהירה יחסית כדי ללמוד את השלבים השונים של נדידת תאים, כולל את משכי הזמן של שלבי הגירה והנייחת והמהירות הגירה.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

במאמר זה אנו מתארים את ההליך ניסיוני המלא לשחזר, עם רזולוציה גבוהה, האנטומיה מוח הקנס של מוח עכבר שכותרתו fluorescently. הפרוטוקול המתואר כולל הכנת מדגם וסליקה, דגימת הרכבה עבור הדמיה, שלאחר עיבוד נתונים והדמיה רב היקף.

מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

באמצעות מספר זוויות לחתוך את מוח גור עכבר, אנחנו לשפר פרוסת מוח חריפה שתואר אשר לוכדת את הקשרים בין רוב מבני המוח התיכון והמוח הקדמי השמיעתיים המרכזיים.

שינוי של Colliculo-thalamocortical עכבר המוח פרוסה, שילוב הדפסת 3-D של לשכת רכיבים ודימות אופטי רב בקנה מידה

כאן, אנו מציגים הליך לביצוע בקנה מידה גדול Ca 2 + הדמיה עם רזולוציה הסלולר על פני שכבות קליפת המוח מרובים בעכברים נעים באופן חופשי. מאות תאים פעילים ניתן לצפות בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ מיניאטורי, ראש רכוב יחד עם בדיקה מנסר פריזמה.

רב שכבתיים Ca קליפת המוח<sup&gt; 2+</sup&gt; הדמיה בחופשיות העברת עכברים עם בדיקות פריזמה מיקרוסקופית פלואורסצנטי מיניאטורי

פרוטוקול זה מתאר שיטות לביצוע הדמיית תהודה מגנטית, ניקוי ותיוג חיסוני של מוחות עכברים שלמים באמצעות iDISCO+, ולאחר מכן תיאור מפורט של הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה של יריעות אור, וניתוחים במורד הזרם באמצעות NuMorph.

הדמיה וניתוח של כל המוח החד-תאי של מוחות עכברים שלמים של ילודים באמצעות MRI, ניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של יריעות אור

מחקר זה מתאר את השלבים להשגת תמונות ברזולוציה גבוהה של מוחות עכבר בילודים על ידי שילוב טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT) וסוכן ניגוד בדגימות ex vivo . אנו מתארים ניתוחים מורפומטריים בסיסיים כדי לכמת את גודל המוח וצורתו בתמונות אלה.

הדמיית מיקרו-CT וניתוח מורפומטרי של מוחות יילודים בעכברים

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

למד הדמיה תלת ממדית בקנה מידה גדול של ארגון תאי קליפת המוח בעכברים. שיטה זו חושפת מבנים תלת ממדיים ומאפשרת ניתוח מקיף של סוגי תאים עצביים ותפקודם במערכת העצבים.

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

גלה סרטונים נוספים