הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

כאן נתאר תהליך ניקוי רקמות, תיוג פלורסנט של הדמיה בקנה מידה גדול של רקמת מוח העכבר המאפשרת, ובכך, ויזואליזציה של הארגון תלת מימדי של סוגי תאים בתוך קליפת.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח כגון ניתוח המבנה והתפקוד של הניאו-קורטקס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לחשוף את המבנה התלת מימדי בקנה מידה גדול במוח. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הניאו-קורטקס, ניתן ליישם אותה גם על מערכות עצבים אחרות כמו חוט השדרה.

כדי להזריק את העוקב לתוך הפונסים של העכברים הבוגרים, צייר תחילה מיקרוליטר אחד של תת-יחידה B של רעלן כולרה המסומן בפלואורסצנט לתוך מזרק המילטון בגודל 26. הנח משאבת מזרק על המזרק, ולאחר מכן הנח את המזרק והמשאבה על מחזיק הכלי של מניפולטור על מכשיר סטריאוטקסי. הטה את המניפולטור 12 מעלות לאחור מהציר האנכי.

לאחר מכן, הנח את העכבר על המכשיר הסטריאוטקסי. בעזרת סכין גילוח, הסר את שיערו כדי למנוע זיהום. לאחר מכן חותכים 10 מילימטרים מהקרקפת כך שהברגמה והלמבדה נראים לעין.

יש לתת 0.1 מיליליטר של 1% לידוקאין באמצעות פיפטה. הגדר את זווית הראש על ידי התאמת המיקום האנכי של הפיה במכשיר הסטריאוטקסי כך שלברגמה וללמבדה תהיה אותה רמת Z. לאחר מכן, התאם את מיקום המניפולטור על ידי החלקתו על המכשיר הסטריאוטקסי כך שקצה המזרק יהיה קרוב לברגמה.

רשום את מיקום המניפולטור. משוך את המזרק על ידי הזזת מחזיק הכלי על המניפולטור. לאחר מכן הזז את המניפולטור 5.4 מילימטרים לאחור ו -0.4 מילימטרים לרוחב.

קדם את המזרק כך שהקצה יהיה קרוב לנקודת הכניסה בגולגולת, ואז החזר את המזרק וסמן את נקודת הכניסה. במצב המסומן, קדחו חור בקוטר של כמילימטר אחד. הכנס את קצה המזרק דרך החור כך שעומק הקצה יהיה 6.9 מילימטרים יותר מזה שנמדד בברגמה.

לאחר מכן, הזריק מיקרוליטר אחד של עוקבים באמצעות המשאבה במהירות של 0.2 מיקרוליטר לדקה. לאחר ההזרקה, הסר את המזרק מהמוח. במידת הצורך, כסו את המוח החשוף בשברים קטנים של המוסטט מיקרופיברילר ודבק מיידי.

נגב את המוח החשוף במי מלח כדי למנוע זיהום ולתפור את הקרקפת. לאחר מכן, הסר את העכבר מהמכשיר הסטריאוטקסי. אפשרו לעכבר להתאושש מההרדמה באינקובטור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך כשעה.

אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה עצם החזה. החזר את העכבר לחברת בעלי חיים אחרים לאחר שהתאושש לחלוטין. כדי לאסוף את רקמת המוח, חתכו את הקרקפת באמצעות מספריים כדי לחשוף את הגולגולת.

לאחר מכן, חותכים את קו האמצע של הגולגולת החשופה בעזרת מספריים. לאחר מכן, הסר את הגולגולת באמצעות מלקחיים. אם יש צורך לסמן את מיקום הברגמה והלמבדה, הסר תחילה צד אחד של הגולגולת.

לאחר מכן הכניסו מחטי טונגסטן דקות למוח במיקומי הברגמה והלמבדה, ואז הסירו את הגולגולת שנותרה. לאחר מכן, הנח את דגימת המוח על פלטפורמת הרטט. חותכים את החלקים בעובי של עד 500 מיקרומטר ב- PBS בטמפרטורת החדר.

בהליך זה, העבירו את הפרוסות לצינור פלסטיק של חמישה מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של תמיסת Scale S0. לאחר מכן דגרו אותם למשך 12 שעות עם ניעור עדין ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר 12 שעות הסר את התמיסה מהצינור באמצעות פיפטה והוסף ארבעה מיליליטר תמיסת סולם A2.

דוגרים על הפרוסות למשך 36 שעות בניעור עדין בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 36 שעות, הסר את התמיסה מהצינור והוסף ארבעה מיליליטר תמיסת סולם B4. דוגרים על הפרוסות למשך 24 שעות בניעור עדין בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר 24 שעות, הסר את התמיסה מהצינור והוסף ארבעה מיליליטר תמיסת סולם A2. דוגרים על הפרוסות למשך 12 שעות בניעור עדין בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 12 שעות, הסר את התמיסה מהצינור והוסף ארבעה מיליליטר PBS.

דוגרים את הפרוסות למשך שש שעות בניעור עדין בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר בזהירות את הפרוסות לצינור פלסטיק של שני מיליליטר. דגרו אותם עם נוגדן ראשוני במיליליטר אחד של תמיסת AB Scale למשך 48 עד 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין.

לאחר מכן, הסר בזהירות את הפרוסות לצינור פלסטיק של חמישה מיליליטר. דגרו אותם בארבעה מיליליטר של תמיסת AB Scale למשך שעתיים פעמיים בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין. לאחר מכן, הסר בזהירות את הפרוסות לצינור פלסטיק של שני מיליליטר.

דגירה עם נוגדן משני עם תווית פלואורסצנטית במיליליטר אחד של תמיסת AB Scale למשך 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין. הסר בזהירות את הפרוסות לצינור פלסטיק של חמישה מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של תמיסת הנוגדן Scale ודגירה על הפרוסות במשך שש שעות בניעור עדין בטמפרטורת החדר. הסר את התמיסה והוסף ארבעה מיליליטר מתמיסת AB Scale ודגר את הפרוסות למשך שעתיים פעמיים עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר את התמיסה והוסף ארבעה מיליליטר של 4% PFA ודגר את הפרוסות למשך שעה עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את התמיסה והוסף ארבעה מיליליטר PBS ודגר את הפרוסות למשך שעה עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר. הסר את התמיסה והוסף ארבעה מיליליטר מתמיסת Scale S4 ודגר את הפרוסות למשך 12 שעות בניעור עדין בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הניחו את המרווח על שקופית זכוכית והניחו את הפרוסות במרווח וטבלו את הפרוסות בתמיסת Scale S4. אטום את המרווח עם זכוכית כיסוי. שים מעט מים על זכוכית הכיסוי ודמיין את הפרוסות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או דו-פוטונית עם מטרה לטבול במים למרחקים ארוכים.

במחקר זה, נוירוני הקרנה בקליפת המוח סומנו בירוק על ידי ביטוי tdTomato בעכברים טרנסגניים Tlx3-cre AI9 ונוירונים של הקרנה תת-מוחית במג'נטה הודגמו על ידי הזרקת העוקב הרטרוגרדי CTB488 לתוך הפונים בגיל שבעה שבועות. זוהי התצוגה העליונה המציגה את המיקומים המשוערים של אזורים בקליפת המוח. להלן התצוגות האלכסוניות של הקרינה CTB488 המציגות נוירונים של הקרנה תת-מוחית ופלואורסצנטיות tdTomato המציגות נוירונים של הקרנה בקליפת המוח וזו התמונה הממוזגת.

גופי התאים של שני סוגי התאים נראו על פני מגוון רחב של אזורי מוח וחתכים אופטיים הראו עמודות מיקרו מחזוריות. תמונה זו מציגה את גופי התאים והדנדריטים האפיקליים של נוירוני הקרנה תת-מוחיים המבטאים eGFP בחתך אופטי של עכבר Crym-eGFP ותמונה זו מציגה את התאים המבטאים פרוואלבומין המסומנים בנוירוני הקרנה ירוקים ותת-מוחיים המסומנים במג'נטה על ידי הזרקת CTB488 לתוך הפונים של עכבר C57 Black 6 בשיטת סולם הנוגדנים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו עיבוד תמונה תלת מימדית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אפיון כמותי של ארגון המוח.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של קליפת המוח לחקור ארגון מודולרי חדש במוח העכבר.